Auristatin; microtubule; tubulin polymerization

体外活性：当与 cAC10 偶联时，MMAE 在 CD30+ 细胞中表现出选择性细胞毒性，并通过诱导细胞凋亡来诱导 G2/M 期生长停滞和细胞死亡。 [1] 当与抗 CD79b 抗体偶联时，抗 CD79b-vcMMAE 在体外对大量 NHL 细胞系具有非常有效和广泛的活性。 [2] 当与抗 HER2 抗体偶联时，hertuzumab-vc-MMAE 也可以有效内化并有效杀死 HER2 过表达的肿瘤细胞。细胞测定：根据制造商的说明，使用阿拉玛蓝染料还原测定来测量细胞毒性。简而言之，在添加培养物之前，在完全培养基中新鲜制备 40%（重量/体积）的 Alamar Blue 溶液。药物暴露后 92 小时，将 Alamar Blue 溶液添加到细胞中以构成 10% 培养物体积。将细胞孵育 4 小时，并在 Fusion HT 荧光板读数器 上测量染料还原。使用的细胞系：CD30+ Karpas 299 细胞。

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目的：SGN-35是一种抗体-药物偶联物（ADC），含有强效抗有丝分裂药物单甲基尿抑素E（MMAE），与抗CD30单克隆抗体cAC10连接。如前所述，SGN-35治疗可以逆转并治愈已建立的霍奇金淋巴瘤和间变性大细胞淋巴瘤异种移植物。最近，ADC已被证明在临床试验中具有明显的活性。在这里，我们通过确定靶向细胞内药物释放和保留的程度以及旁观者的活动来研究SGN-35活性的分子基础。 实验设计：SGN-35是用（14）C-标记的MMAE制备的。使用基于放射和液相色谱/质谱的检测组合来确定CD30（+）和阴性细胞系上的细胞内ADC激活。使用由CD30（+）和CD30（-）系组成的混合肿瘤细胞培养物测定SGN-35的旁观者活性。 结果：SGN-35处理CD30（+）细胞导致化学未修饰的MMAE在细胞内有效释放，MMAE的细胞内浓度在500 nmol/L范围内。这是由于特异性ADC结合、摄取、MMAE保留和受体再循环或再合成。MMAE占CD30（+）细胞可检测到的释放药物总量，其保留半衰期为15至20小时。对CD30（-）细胞系和CD30（阳性）细胞系的混合物进行的细胞毒性研究表明，CD30（＋）细胞可扩散释放的MMAE能够杀死共培养的CD30（－）细胞。 结论：MMAE在CD30（+）癌症细胞内从SGN-35有效释放，并且由于其膜通透性，能够对旁观者细胞产生细胞毒性活性。这为SGN-35观察到的明显的临床前和临床抗肿瘤活性提供了机制上的见解。[1]

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肿瘤对放射治疗的内在耐药性限制了电离辐射（IR）的疗效。使癌症细胞特异性地对IR增敏将改善肿瘤控制并降低正常组织的毒性。肿瘤靶向技术的发展允许开发强效放射增敏药物。我们假设抗微管蛋白药物单甲基auristan E（MMAE）是临床批准的抗体导向偶联物的一种成分，可以作为一种强效的放射增敏剂，并使用靶向基质金属蛋白酶和RGD结合整合素的可激活细胞穿透肽（ACPP-cRGD-MMAE）选择性地递送至肿瘤。我们使用克隆和DNA损伤测定法评估了MMAE对已建立的癌症细胞和低渗透培养的人胰腺肿瘤细胞系的放射增敏能力。MMAE以计划和剂量依赖的方式使结直肠癌和胰腺癌癌症细胞对IR敏感，与有丝分裂阻滞相关。用MMAE处理的受照射细胞的克隆存活率降低和DNA双链断裂增加证明了放射增敏。MMAE联合IR导致DNA损伤信号传导和CHK1激活增加[2]。

Karpas 299 ALCL 模型，cAC10-vcMMAE（1 mg/kg，静脉注射）可诱导完全、持久的肿瘤消退，而游离 MMAE（0.36 mg/kg）不会产生可检测到的抗肿瘤活性。在 NHL 小鼠异种移植模型中，抗 CD79b-vcMMAE（7 mg/kg，口服）显着导致肿瘤持续完全缓解。

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然后，我们评估了MMAE与局灶性IR联合抑制肿瘤异种移植物生长的疗效。首先，我们测试了MMAE肿瘤靶向递送与游离MMAE递送相比会增加肿瘤消退的假设（图6C）。在开始治疗之前，PANC-1肿瘤异种移植物生长到平均体积为200mm3。在第0天和第1天静脉注射游离MMAE或ACPP cRGD MMAE（6 nmoles MMAE/天）。该剂量的MMAE是基于之前对自由MMAE递送相关动物毒性的研究而选择的。在第1天和第2天给予每天3 Gy的分次IR。在第1天，当同时给予MMAE和IR时，IR在早上递送，MMAE在下午递送。在开始治疗后的第30天，与未经治疗的对照肿瘤相比，自由MMAE治疗导致PANC-1肿瘤的生长延迟很小，但具有统计学意义，p<0.0001。游离MMAE治疗的小鼠的平均肿瘤体积是未治疗对照组的75%。更重要的是，与单独使用IR或游离MMAE相比，游离MMAE与IR联合使用导致肿瘤异种移植物严重退化（p<0.0001）。在没有IR的情况下比较靶向和游离MMAE给药，ACPP-cRGD-MMAE与游离MMAE相比导致了显著更大的肿瘤消退，这与之前涉及癌症模型的研究一致（12）。与游离MMAE和IR相比，IR联合ACPP-cRGD-MMAE导致肿瘤消退时间延长（p<0.01）。对肿瘤的长期随访表明，用ACPP-cRGD-MMAE和IR治疗的10个PANC-1肿瘤中有2个在第0天小于或等于其起始肿瘤体积（表1）。值得注意的是，仅用2剂MMAE和IR即可观察到这种长期和持续的肿瘤消退，初始肿瘤体积大于200 mm3。此外，没有其他治疗组显示出长期肿瘤消退。 [2]

我们通过增加给药方案来扩展我们对ACPP-cRGD-MMAE和IR的研究，看看它是否会导致长期回归的进一步改善。在第0、1和2天给予ACPP-cRGD-MMAE（6 nmoles/天，共18 nmoles）。在第1、2和3天，每天分次给予3 Gy的IR。同样，在同时给予ACPP cRGD MMAE和IR的日子里，IR在早上递送，ACPP cRGD MMAE在下午递送。正如我们在图6C中观察到的那样，与单独使用IR或ACPP-cRGD-MMAE治疗的小鼠相比，ACPP-cRGD-MMAE与IR联合使用再次产生了显著的肿瘤消退（补充图6）。与所有其他组相比，ACPP-cRGD-MMAE和IR联合小鼠的肿瘤体积仍然具有统计学意义，p<0.0001。更引人注目且具有治疗重要性的是，在将ACPP-cRGD-MMAE与IR联合使用后，大多数接受治疗的肿瘤在PANC-1肿瘤中的肿瘤消退时间延长。到第40天，对照组或单独接受IR治疗的肿瘤均未小于其在第0天的初始肿瘤体积（表1）。对于单独使用ACPP-cRGD-MMAE的组，14个肿瘤中只有1个小于其初始肿瘤体积。相比之下，ACPP-cRGD-MMAE和IR联合组的14个肿瘤中有8个小于其初始肿瘤体积。 [2]

然后，我们使用HCT-116肿瘤异种移植物测试了ACPP-cRGD-MMAE和IR的改良治疗方案。在开始治疗之前，HCT-116肿瘤生长至平均肿瘤体积>270 mm3。我们观察到，给予HCT-116异种移植物6 Gy可改善比率ACPP探针切割（图5D和补充图4）。因此，在受照射的肿瘤中，我们在第0天注射了6 Gy，然后在第1天和第2天注射了3 Gy。在照射后6小时的第0天和第1天静脉注射ACPP-cRGD-MMAE（7.5 nmoles/天）。与PANC-1相比，ACPP-cRGD-MMAE的剂量增加，因为HCT-116细胞对MMAE的IC50更高。如PANC-1肿瘤所示，与未经治疗的对照肿瘤相比，单独使用ACPP-cRGD-MMAE会产生适度的生长延迟（图6D）。正如预期的那样，单独使用IR会导致最初的肿瘤生长延迟（由于第0天的剂量为6 Gy，这一点尤为突出），但到第10天，肿瘤体积开始上升。与单独使用IR相比，从治疗开始后第10天开始，将ACPP-cRGD-MMAE与IR结合再次产生持续的肿瘤消退，p<0.006。到第14天，对照组或ACPP-RGD-MMAE治疗的肿瘤均未小于第0天的初始肿瘤体积（表1）。对于单纯IR组，10个肿瘤中只有3个小于其初始肿瘤体积。相比之下，ACPP-cRGD-MMAE和IR联合组中的10个肿瘤中有9个小于其初始肿瘤体积[2]。

游离药物滞留[1]
对于MMAE保留实验，以5×105个细胞/mL的浓度接种25×106个细胞。每种细胞类型用放射性浓度的MMAE处理三次，确定在37°C下孵育3小时后，该细胞类型的细胞内浓度相似。将细胞在等体积的新鲜培养基中洗涤两次。将每个洗涤过的培养物分成三个15mL离心管。立即从每根LSC试管中取出1毫升等分试样，并在15毫升离心管中将第二份1毫升等分样品分层放置在2毫升FBS上，在室温下以390×g的速度离心5分钟。从分离的样品中取出0.5mL上层培养基相用于LSC。将每个样品的剩余部分冷冻在干冰浴中，将含有细胞颗粒的试管底部切入含有0.5mL PBS的闪烁瓶中。将样品涡旋；加入Ecoscint A闪烁液（4 mL），然后进行第二次涡流；并用LSC对样品进行计数。如所述，在指定的时间点用FBS处理更多的等分试样（1 mL）。为了计算细胞内药物浓度，在洗涤到不含药物的培养基中后，通过台盼排斥法重新测定细胞密度，并在24小时后再次测定。

按照制造商的指示，使用 Alamar Blue 染料还原测定来量化细胞毒性。简而言之，在添加培养物之前，将新鲜制备的 40%（重量/体积）Alamar Blue 溶液添加到完全培养基中。药物暴露后 92 小时，将 Alamar Blue 溶液添加到细胞中，使其达到培养体积的 10%。 Fusion HT 荧光板读数器 用于测量细胞孵育 4 小时后染料的减少情况。

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ADC处理的培养条件培养基生物测定[1]
将SGN-35处理过的细胞的废培养基样品以六种不同的稀释液加入CD30阴性Ramos细胞培养物中。同时，将Ramos细胞与8种浓度的MMAE作为细胞毒性标准进行孵育。在37°C下孵育96小时后，使用刃天青培养Ramos培养物（相对荧光，激发=530-560 nmol/L，发射=590 nmol/L）。使用与MMAE标准品一起孵育的Ramos细胞的平均相对荧光单位（RFU）测量值，绘制了活细胞相对于未处理Ramos细胞（未处理百分比）的百分比，作为MMAE浓度（nmol/L）的函数。使用四参数曲线拟合来生成用于定量废培养样品中释放的MMAE的方程。使用该方程将废培养液的细胞存活率测量值转换为MMAE浓度（假设细胞毒性仅归因于MMAE）。仅使用未经处理的Ramos细胞的15%至85%之间的细胞存活率测量值来计算MMAE的浓度。

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共培养实验[1]
单次培养中的Karpas299、L540cy或Ramos细胞以2.5×105个细胞/mL的速度接种在1.5 mL的培养体积中，而CD30阳性和CD30阴性对的共培养物由每种细胞类型在1.5 mL培养基（1:1细胞混合物，RPMI 1640+10-15%FBS）中的1.25×105个细胞/mL组成。共培养实验中使用的培养基充分支持所有三种细胞类型的生长。用载体对照、1μg/mL SGN-35或IgG vc-MMAE非结合对照处理培养物。孵育72小时后，用含有所需处理类型的60%培养基喂养培养物。120小时后检查培养物的细胞计数和存活率（Vi-cell XR2.03细胞存活率分析仪），用抗CD30藻红蛋白和抗CD19-FITC（BD Biosciences）抗体对存活细胞进行染色，以确定每种细胞类型在存活培养物中的分布。染色是通过以1200 rpm离心5分钟来收获细胞，在20μL荧光激活细胞分选（FACS）缓冲液（含2%FBS的PBS）中的96孔板上每孔镀5×105个细胞，并将标记的抗体添加到所需的孔中而不稀释（5μL/孔）。将板在冰上孵育30分钟，然后以1500rpm离心5分钟，最后通过敲击板去除上清液。用PBS（200μL）洗涤细胞三次，然后重新悬浮在250μL FACS缓冲液中，并在4°C下储存，以便在BD FACScan仪器上通过流式细胞术进行后续分析。

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细胞周期与凋亡[2]
细胞用MMAE处理24小时，然后在甲醇中固定。用RNAse处理细胞，用碘化丙啶（PI）染色，并使用FloJo软件通过FACS进行分析。

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阿拉玛蓝分析[2]
将细胞铺在96孔板上，暴露于MMAE或紫杉醇72小时，并在560nm下进行分析。对于受照射的细胞，用MMAE处理细胞过夜，然后进行6 Gy。

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克隆形成试验[2]
用MMAE处理细胞24小时，然后用0-8Gy照射。IR后，将细胞重新铺在无药物培养基中。菌落在10-14天内形成并被计数。

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中性彗星试验[2]
将细胞处理指定长度和剂量的MMAE，然后进行6 Gy的照射。在IR后15分钟收获细胞，进行中性电泳（Trevigen）。在多个场中计数彗尾（每个样本>60个细胞），并使用CometScore（TriTek Corp）进行分析。

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γH2Ax免疫染色[2]
在玻璃盖玻片上生长的细胞用MMAE处理过夜，然后照射。IR后两小时，细胞被固定、渗透并用γH2Ax抗体染色。细胞核用DAPI染色。每组在6-8个高功率场中计数病灶。

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免疫印迹[2]
收集经MMAE和IR处理的细胞，并在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液中裂解。使用4-12%的Bis-Tris凝胶对30 ug裂解物进行电泳，转移到PVDF膜上，并与指定的一抗一起孵育。印迹由ECL开发。

Mice: Female athymic nu/nu mice aged 6-8 weeks are given a 1:1 Matrigel and PBS solution subcutaneously injected into their thighs, containing 5×10⁶ HCT-116 or PANC-1 cells. After administering ACPP-cRGD-MMAE intravenously (IV) or orally (IR) (6 nmoles/day, totaling 18 nmoles), the mice are given the treatment. Tumor tissue is then removed, paraffin embedded, formalin fixed, and stained with the appropriate antibodies. Using the UltraMap system, DAB is used as a chromagen and the primary antibody is used at a 1:250 dilution for visualization.

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Immunohistochemistry [2]
Mice were treated with IR or intravenous (IV) injection of ACPP-cRGD-MMAE, tumor tissue was harvested, formalin fixed and paraffin embedded followed by staining with indicated antibodies (Ventana Medical Systems). The primary antibody was used at a 1:250 dilution and was visualized using DAB as a chromagen with the UltraMap system.

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In vivo tumor xenograft optical imaging [2]
Tumor xenografts were irradiated as described above. One day post IR, mice were anesthetized (1:1 mixture of 100 mg/ml of ketamine and 5 mg/ml of midazolam) and IV injected with either fluorescently labeled ratiometric ACPP (Cy5 and Cy7) or ACPP-cRGD-MMAE (Cy5). Animals were imaged 2 hours later using a Maestro Small Animal Imager (CRI) with excitation filter of 620/22 nm and 645 nm long pass emission filter with dichroic filter tuned to 670 nm. Imaging was done both with skin on and after skin removal to decrease autofluorescence and scattering.

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In vivo tumor xenograft experiments [2]
HCT-116 or PANC-1 tumor growth was measured with digital calipers. Tumor volume was calculated using the formula as ½ * Length * Width2. Mice were randomized into groups as indicated in Results once the average tumor volume reached >200 mm3. Free MMAE was injected on an equimolar basis to ACPP-cRGD-MMAE.

[1]. Intracellular Activation of SGN-35, a Potent Anti-CD30 Antibody-Drug Conjugate. Clinical Cancer Research (2010), 16(3), 888-897.

[2]. Tumor radiosensitization by monomethyl auristatin E: mechanism of action and targeted delivery. Cancer Res. 2015 Apr 1;75(7):1376-87.

Monomethyl Auristatin E is a dolastatin-10 peptide derivative with potent antimitotic activity and potential antineoplastic activity as part of an antibody-drug conjugate (ADC). Monomethyl auristatin E (MMAE) binds to tubulin, blocks tubulin polymerization, and inhibits microtubule formation, which results in both disruption of mitotic spindle assembly and arrest of tumor cells in the M phase of the cell cycle. To minimize toxicity and maximize efficacy, MMAE is conjugated, via a cleavable peptide linker, to a monoclonal antibody that specifically targets a patient's tumor. The linker is stable in the extracellular milieu but is readily cleaved to release MMAE following binding and internalization of the ADC by the target cells.

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In the work described here, we show that CD30-positive cell lines process SGN-35 by releasing MMAE in a chemically unmodified form. The results are consistent with the proteolytic cleavage at the citrulline-PABC amide bond, which leads to the release of MMAE after spontaneous fragmentation of the PABC spacer (Fig. 1). This is supported by inhibition studies with chloroquine (Fig. 2C), a lysosomotropic agent that reduces lysosomal protease activity through pH modulation. Upon release, the MMAE diffuses through cell membranes and accumulates in culture media, albeit at concentrations that were ∼250 times lower than that found inside the cells, presumably due to dilution into the relatively larger volume of medium (Fig. 2B). Despite the great differential, extracellular drug was able to kill CD30-negative cells cocultured with CD30-positive cells. Thus, SGN-35 has the potential to act on cells within a heterogeneous tumor cell population that do not bind sufficiently high amounts of ADC for effective direct cytotoxic activity. In general, this is of importance because mAbs have been shown to distribute within tumors in an uneven manner and many tumors are heterogeneous with respect to antigen expression. In targeting HL with antibodies directed against CD30 in particular, the ability to eradicate antigen-negative cells within the tumor mass may be useful because only a small percentage of the cells are CD30 positive and thought to be a part of the clonal malignancy. Because this bystander cytotoxic effect would be localized to the tumor microenvironment, with cells near the CD30-positive cells exposed to a concentration gradient of MMAE that decreases with increasing distance, it is likely to minimize toxic systemic exposure of diffusible tumor-released MMAE. In summary, targeted in vitro delivery of MMAE to CD30-expressing cells with SGN-35 leads to high and sustained intracellular MMAE levels, and successfully ablates both CD30-expressing malignant cells and neighboring malignant cells that do not express the target antigen. This may be of significance in treating tumors that are heterogeneous with respect to both antigen presentation and ADC distribution. The results reported here provide insight into the pronounced activities associated with this promising ADC. [1]

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Intrinsic tumor resistance to radiotherapy limits the efficacy of ionizing radiation (IR). Sensitizing cancer cells specifically to IR would improve tumor control and decrease normal tissue toxicity. The development of tumor-targeting technologies allows for developing potent radiosensitizing drugs. We hypothesized that the anti-tubulin agent monomethyl auristatin E (MMAE), a component of a clinically approved antibody-directed conjugate, could function as a potent radiosensitizer and be selectively delivered to tumors using an activatable cell-penetrating peptide targeting matrix metalloproteinases and RGD-binding integrins (ACPP-cRGD-MMAE). We evaluated the ability of MMAE to radiosensitize both established cancer cells and a low-passage cultured human pancreatic tumor cell line using clonogenic and DNA damage assays. MMAE sensitized colorectal and pancreatic cancer cells to IR in a schedule- and dose-dependent manner, correlating with mitotic arrest. Radiosensitization was evidenced by decreased clonogenic survival and increased DNA double-strand breaks in irradiated cells treated with MMAE. MMAE in combination with IR resulted in increased DNA damage signaling and activation of CHK1. To test a therapeutic strategy of MMAE and IR, PANC-1 or HCT-116 murine tumor xenografts were treated with nontargeted free MMAE or tumor-targeted MMAE (ACPP-cRGD-MMAE). While free MMAE in combination with IR resulted in tumor growth delay, tumor-targeted ACPP-cRGD-MMAE with IR produced a more robust and significantly prolonged tumor regression in xenograft models. Our studies identify MMAE as a potent radiosensitizer. Importantly, MMAE radiosensitization can be localized to tumors by targeted activatable cell-penetrating peptides. [2]

C39H67N5O7

717.98

717.504

C, 65.24; H, 9.41; N, 9.75; O, 15.60

474645-27-7

MMAE-d8;2070009-72-0;Monomethyl auristatin E;474645-27-7

11542188

white solid powder

1.1±0.1 g/cm3

873.5±65.0 °C at 760 mmHg

482.1±34.3 °C

0.0±0.3 mmHg at 25°C

1.519

4.13

149.54

4

8

20

51

1100

10

O(C([H])([H])[H])[C@]([H])([C@]([H])(C(N([H])[C@]([H])(C([H])([H])[H])[C@@]([H])(C1C([H])=C([H])C([H])=C([H])C=1[H])O[H])=O)C([H])([H])[H])[C@]1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])N1C(C([H])([H])[C@]([H])([C@]([H])([C@@]([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])N(C([H])([H])[H])C([C@]([H])(C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H])N([H])C([C@]([H])(C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H])N([H])C([H])([H])[H])=O)=O)OC([H])([H])[H])=O

DASWEROEPLKSEI-UIJRFTGLSA-N

InChI=1S/C39H67N5O7/c1-13-25(6)34(43(10)39(49)33(24(4)5)42-38(48)32(40-9)23(2)3)30(50-11)22-31(45)44-21-17-20-29(44)36(51-12)26(7)37(47)41-27(8)35(46)28-18-15-14-16-19-28/h14-16,18-19,23-27,29-30,32-36,40,46H,13,17,20-22H2,1-12H3,(H,41,47)(H,42,48)/t25-,26+,27+,29-,30+,32-,33-,34-,35+,36+/m0/s1

(2S)-N-[(2S)-1-[[(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-3-[[(1S,2R)-1-hydroxy-1-phenylpropan-2-yl]amino]-1-methoxy-2-methyl-3-oxopropyl]pyrrolidin-1-yl]-3-methoxy-5-methyl-1-oxoheptan-4-yl]-methylamino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]-3-methyl-2-(methylamino)butanamide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： (1). 请将本产品存放在密封且受保护的环境中（例如氮气保护），避免吸湿/受潮和光照。  (2). 该产品在溶液状态不稳定，请现配现用。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: 2.62 mg/mL (3.65 mM) in 5% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 50% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.62 mg/mL (3.65 mM) (饱和度未知) in 5% DMSO + 95% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (3.48 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 4 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (3.48 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100μL 25.0mg/mL澄清的DMSO储备液加入到900μL 20％SBE-β-CD生理盐水中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 5 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (3.48 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 6 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (3.48 mM) (饱和度未知) in 10% EtOH + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清乙醇储备液加入到 400 μL PEG300 中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 7 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (3.48 mM) (饱和度未知) in 10% EtOH + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，要配制1 mL工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL的澄清EtOH储备液加入到900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中， 混合均匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 8 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (3.48 mM) (饱和度未知) in 10% EtOH + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，要配制1 mL工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL 澄清乙醇储备液加入到900 μL 玉米油中，混匀。

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配方 9 中的溶解度: ≥ 0.52 mg/mL (0.72 mM) (饱和度未知) in 1% DMSO + 99% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。