CDK7 (IC50 = 3.2 nM)

THZ1 抑制 Jurkat 细胞和 Loucy 细胞，IC50 值分别为 50 nM 和 0.55 nM。 CDK12 被 THZ1（9、27、83、250、750 和 2500 nM）抑制，但浓度高于 CDK7。 THZ1 (1 μM) 不可逆地磷酸化 CAK 和 RNAPII CTD。在 Hela S3 细胞中，THZ1 (2.5 μM) 共价靶向 CDK7 激酶结构域外的特定半胱氨酸，以不可逆地阻止 RNAPII CTD 磷酸化。在 T-ALL 细胞系中，THZ1 (250 nM) 会导致抗凋亡蛋白（最明显的是 MCL-1 和 XIAP）下降，以及凋亡指数增加和细胞增殖降低 [1]。所有基因型人类 (hSCLC) 细胞系的 IC50 范围为 5 至 20 nM，均表现出对 THZ1 的高度敏感性 [3]。

THZ1 (10 mg/kg) 可有效杀死原发性慢性淋巴细胞白血病 (CLL) 细胞，并对原发性 TALL 细胞和体内人 T-ALL 异种移植物具有抗增殖活性 [1]。 THZ1（10 mg/kg，静脉注射）可减少肿瘤生长，并且在人 MYCN 扩增的 NB 小鼠模型中没有显示出毒性 [4]。 THZ1（10 mg/kg，腹腔注射）完全抑制动物食管鳞状细胞癌肿瘤的生长，而不会出现体重减轻或其他常见不良症状[5]。

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为了比较THZ1的单药效力与药物的联合作用，我们对THZ1和PARP抑制剂奥拉帕尼（一种FDA批准的治疗复发性卵巢癌症的药物，无论BRCA1/2状态如何）进行了联合研究。我们首先进行了耐受性研究，发现以10mg/kg的剂量每天两次（BID）腹腔注射THZ1具有良好的耐受性，根据体重和动物行为判断，没有明显的毒性迹象（数据未显示）。在疗效研究中，我们首先将腹水衍生的卵巢肿瘤细胞植入小鼠体内，7天后将动物分为四组，分别接受载体对照（10 ml/kg，口服，每日一次）或THZ1（10 mg/kg，IP，每日两次）或奥拉帕尼（100 mg/kg，口服，每天一次），或组合（THZ1+Olaparib）治疗27天，并在5个时间点（0、6、13、20和27天）进行生物发光成像（图5A-B）。与之前对THZ1或奥拉帕尼的研究一致，抑制剂对小鼠体重的影响最小（图5--图补充1）。在所有11个独立的PDX模型中，THZ1的给药对肿瘤细胞生长产生了显著的抑制作用（图5B-C）。值得注意的是，在四种模型（DF-149、172、83和86）中，THZ1诱导了对肿瘤生长的完全抑制（图4C，称为i类）。在六种模型（DF-101、106、118、20、68和216）中，THZ1首先导致肿瘤负担明显减轻，但在以后的时间点重新生长（称为ii类）。只有一个模型（DF-181，称为iii类）没有显示肿瘤消退，而是在THZ1治疗后肿瘤细胞生长较慢。奥拉帕尼的给药并没有显著抑制肿瘤生长，在三种模型（DF-106、68和83）中仅显示出非常温和的效果。然而，THZ1和奥拉帕尼的组合显示出协同作用，在五种模型（DF-106、118、86、181和68）中观察到对肿瘤生长的进一步抑制。此外，我们发现THZ1治疗后，肿瘤中MYC和MCL-1的蛋白质丰度几乎被消除（图5D）。总体而言，THZ1在我们的卵巢肿瘤模型中抑制肿瘤生长的效力是惊人的，因为在之前使用THZ1的研究中很少观察到肿瘤消退。联合研究表明，THZ1与临床PARP抑制剂联合应用可能是治疗卵巢癌症的有前途的未来治疗方法[2]。

抑制剂处理实验[1]
进行了扩展数据图5a中描述的时间过程实验，以确定CDK7完全失活所需的最短时间。用THZ1、THZ1-R或DMSO处理细胞0-6小时，以评估时间对THZ1介导的RNAPII CTD磷酸化抑制的影响。对于后续实验，除非另有说明，否则用上述时间过程实验确定的化合物处理细胞4小时。对于抑制剂洗脱实验（图2e，f；扩展数据图5），用THZ1、THZ1-R或DMSO处理细胞4小时。随后去除含有抑制剂的培养基以有效“洗脱”化合物，并允许细胞在没有抑制剂的情况下生长。对于每个实验，检测裂解物的RNAPII CTD磷酸化和其他特定蛋白质。

高通量细胞系平板活性测定[1]
将细胞接种在384孔微孔板中，在含有5%FBS和青霉素/链霉抗生物素的培养基中以约15%的融合率接种。用THZ1或DMSO处理细胞72小时，并用刃天青测定细胞存活率。

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细胞增殖试验[2]
在病毒感染和嘌呤霉素选择后，将细胞接种在1ml培养基中的12孔板（密度为5×103）中。14天后，细胞用1%甲醛固定15分钟，用结晶紫（0.05%，wt/vol）染色15分钟，这是一种染色质结合细胞化学染色。这些板在大量去离子水中广泛清洗，在滤纸上倒置干燥，并用爱普生扫描仪成像。 对于96孔板中的3天细胞增殖试验，细胞以每孔6000至10000个细胞的密度铺板，并在第二天用不同浓度的THZ1或YKL-116处理。孵育72小时后，将CellTiter-Glo试剂直接加入细胞中，并在平板阅读器上读取发光信号。

研究人员使用了他们先前建立的卵巢患者来源的异种移植 (PDX) 模型 (Liu et al., 2017)。为了利用非侵入性生物发光成像（BLI）技术测量肿瘤生长，原发肿瘤细胞经荧光素酶基因转导。简而言之，从经知情同意的高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）患者体内获取卵巢癌细胞，并将其腹腔注射到免疫缺陷的NOD-SCID IL2Rγnull小鼠体内。每只小鼠植入5 × 10⁶个腹水来源的细胞，植入7天后，对小鼠进行BLI成像，并根据治疗情况将其分为四组：载体对照组（每日一次，灌胃给药，剂量为10 ml/kg）；THZ1组（每日两次，腹腔注射给药，剂量为10 mg/kg）；奥拉帕尼组（每日一次，灌胃给药，剂量为100 mg/kg）；以及THZ1联合奥拉帕尼组。使用生物发光成像（BLI）技术，每7天（0、6、13、20、27天）评估一次肿瘤生长情况，直至第27天。收获后，将肿瘤或其他组织快速冷冻于液氮中，用于制备裂解物和免疫印迹分析。[2]

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从KOPTK1 T-ALL人源异种移植小鼠疗效研究样本中对THZ1进行药代动力学研究。[1]
在疗效研究结束时，测定血浆和肝脏样本中THZ1的浓度。血浆采用标准离心技术制备，肝脏样本快速冷冻后储存于-80℃直至分析。分析当日，将血浆和肝脏样本在冰上解冻，分别与乙腈（体积比 1:5 或质量比 1:5）混合，用探头式超声波仪进行超声处理，然后通过 Millipore Multiscreen Solvinter 0.45 微米低吸附 PTFE 亲水滤板进行离心，之后进行 LC-MS/MS 分析。使用 ABSciex 5500 质谱仪测定浓度。THZ1 的检测采用 566.4 至 186.1 的质量跃迁。血浆药物浓度使用空白小鼠血浆标准品进行定量，肝脏药物浓度使用空白小鼠肝脏匀浆标准品进行定量。[1]

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使用 THZ1 治疗患者来源的异种移植 (PDX)。 [1]
将患者来源的异种移植细胞在体外用THZ1处理3小时，然后用DPBS洗涤3次以去除化合物。取一部分输入细胞，使用已知量的流式细胞仪校准微珠进行流式细胞术计数（数据未显示；Molecular Probes）。将剩余细胞接种到MS5-DL1饲养细胞上，培养基为无血清培养基⁷。72小时后，用胰蛋白酶剧烈吹打收集细胞，通过尼龙网过滤以去除饲养细胞，并使用已知量的流式细胞仪校准微珠进行流式细胞术计数。基于化合物处理后（即至少75%的细胞死亡）估计的平均扩增倍数为1.6倍，标准差为0.7，以及估计的最小平均值为0.4倍，该测试在3个样本的情况下，对于ap=0.05的差异具有80%的统计功效。

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KOPTK1 T-ALL人源异种移植小鼠疗效研究。[1]
将2×10⁶个表达荧光素酶的KOPTK-1细胞静脉注射到32只9周龄的NOD-SCIDIL2Rcγ null (NSG)雌性小鼠体内。在细胞注射后一周，使用IVIS Spectrum系统通过生物发光成像(BLI)确定白血病负荷。此时，根据平均生物发光强度（BLI）将小鼠分为以下治疗组：THZ1 10mg/kg qD组、THZ1 10mg/kg BID组和载体对照组（10% DMSO 溶于5%葡萄糖溶液）BID组（每组n=10）。排除两只小鼠，一只BLI最高，一只最低。所有治疗均通过尾静脉注射给药，注射体积为3.3µL/g（非盲法）。每3-5天对小鼠进行成像和称重。小鼠接受治疗4周，在最后一天，对小鼠进行成像、给药，并在给药后约5-6小时处死。处死后，通过心脏穿刺采集血液至EDTA抗凝管中；取部分血液（约300µL）用于血浆处理。从每只小鼠采集肝脏和脾脏组织，每个样本一半进行速冻，一半进行固定。对血浆和肝脏样本进行处理，用于THZ1的药代动力学分析。将脾脏组织匀浆并裂解，用于THZ1靶点结合的药效学分析。

配制于 10% DMSO 的 D5W 中；10 mg/kg；静脉注射

生物发光异种移植小鼠模型

[1]. Targeting transcription regulation in cancer with a covalent CDK7 inhibitor. Nature. 2014 Jul 31;511(7511):616-20.

[2]. Targeting MYC dependency in ovarian cancer through inhibition of CDK7 and CDK12/13. Elife. 2018 Nov 13;7. pii: e39030.

[3]. Targeting transcriptional addictions in small cell lung cancer with a covalent CDK7 inhibitor. Cancer Cell. 2014 Dec 8;26(6):909-22.

[4]. CDK7 inhibition suppresses super-enhancer-linked oncogenic transcription in MYCN-driven cancer. Cell. 2014 Nov 20;159(5):1126-39. ?.

[5]. Targeting super-enhancer-associated oncogenes in oesophageal squamous cell carcinoma. Gut. 2016 May 10. pii: gutjnl-2016-311818.

THZ1 属于吲哚类化合物，其结构为 1H-吲哚，在 3 位被 5-氯-2-[3-(4-{[(2E)-4-(二甲氨基)丁-2-烯酰基]氨基}苯甲酰胺基)苯胺基]嘧啶-4-基取代。它是一种选择性强效的 CDK7 共价抑制剂，在癌细胞系中表现出抗增殖作用。它可作为 EC 2.7.11.22（细胞周期蛋白依赖性激酶）抑制剂和抗肿瘤药物发挥作用。THZ1 属于吲哚类、氨基嘧啶类、苯甲酰胺类、有机氯化合物、烯酰胺类和仲羧酰胺类化合物。肿瘤癌基因包括一些转录因子，它们利用通用转录机制来维持肿瘤发生状态，但迄今为止，直接药理学抑制这些转录因子仍然十分困难。然而，转录机制包含多种酶促辅助因子，例如细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK），这些因子可作为开发新型治疗候选药物的靶点。本文报道了一种共价 CDK7 抑制剂 THZ1 的发现和表征。THZ1 具有前所未有的能力，能够靶向位于经典激酶结构域之外的远端半胱氨酸残基，从而为实现 CDK7 的选择性提供了一种意想不到的途径。癌细胞系分析表明，包括人 T 细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）在内的部分癌细胞系对 THZ1 具有异常的敏感性。Jurkat T-ALL 细胞的全基因组分析显示，THZ1 对 RUNX1 的转录具有不成比例的影响，提示对 THZ1 的敏感性可能源于 RUNX1 超级增强子赋予的脆弱性以及 RUNX1 在这些肿瘤细胞核心转录调控回路中的关键作用。因此，通过药理学手段调控 CDK7 激酶活性可能为识别和治疗依赖转录维持致癌状态的肿瘤类型提供一种途径。[1]

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高级别浆液性卵巢癌的特征是广泛的拷贝数变异，其中 MYC 癌基因扩增发生在近一半的肿瘤中。我们证实，卵巢癌细胞高度依赖 MYC 来维持其致癌生长，这表明 MYC 是治疗这种难治性恶性肿瘤的潜在靶点。然而，直接靶向 MYC 已被证明十分困难。我们筛选了靶向转录和表观遗传调控的小分子，发现 THZ1（一种 CDK7、CDK12 和 CDK13 抑制剂）能显著下调 MYC 的表达。值得注意的是，仅靶向 CDK7 无法完全抑制 MYC 的表达，而需要联合抑制 CDK7、CDK12 和 CDK13。在11个源自接受过大量预处理的卵巢癌患者的异种移植模型中，THZ1的给药可显著抑制肿瘤生长，同时抑制MYC的表达。我们的研究表明，使用THZ1等药物靶向这些转录CDK可能是治疗MYC依赖性卵巢恶性肿瘤的有效方法。[2]

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小细胞肺癌（SCLC）是一种侵袭性强、死亡率高的疾病，因此迫切需要寻找有效的药物策略来靶向SCLC的生物学特性。我们利用高通量细胞筛选方法，对多种化合物库进行筛选，发现SCLC对转录靶向药物敏感，尤其是对THZ1——一种新近发现的细胞周期蛋白依赖性激酶7（CDK7）共价抑制剂。我们发现，包括MYC家族原癌基因和神经内分泌谱系特异性因子在内的超级增强子相关转录因子基因的表达对THZ1治疗高度敏感。我们提出，这些转录因子的下调在一定程度上导致了小细胞肺癌（SCLC）对转录抑制剂的敏感性，而THZ1代表了一种针对SCLC的靶向治疗原型药物。[3]

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MYC癌蛋白被认为通过扩增基因转录来刺激肿瘤细胞的生长和增殖，这种机制阻碍了大多数以抑制MYC功能作为潜在癌症疗法的尝试。我们使用细胞周期蛋白依赖性激酶7 (CDK7) 的共价抑制剂来破坏神经母细胞瘤细胞中扩增的MYCN的转录，结果表明该癌蛋白下调，从而导致MYCN驱动的整体转录扩增被大幅抑制。这种反应转化为高危神经母细胞瘤小鼠模型中肿瘤的显著消退，且未出现全身毒性。MYCN过表达细胞的显著治疗选择性与超级增强子相关基因（包括MYCN和神经母细胞瘤中其他已知的致癌驱动基因）的优先下调相关。这些结果表明，通过选择性靶向促进肿瘤细胞整体转录扩增的机制，CDK7抑制剂可能对由MYC家族癌蛋白驱动的癌症具有治疗价值。目的：食管鳞状细胞癌（OSCC）是一种侵袭性恶性肿瘤，也是食管癌的主要组织学亚型。尽管近年来大规模基因组分析提高了对OSCC遗传异常的认识，但目前已发现的可靶向基因组病变仍然很少，且尚无分子靶向治疗方法。本研究旨在寻找该肿瘤中的潜在药物靶点。设计：采用高通量小分子抑制剂筛选方法，筛选出有效的抗OSCC化合物。通过全转录组测序（RNA-Seq）和染色质免疫沉淀测序（ChIP-Seq）来解析CDK7抑制剂在OSCC中的作用机制。我们进行了多种体外和体内细胞实验，以确定候选基因对口腔鳞状细胞癌（OSCC）恶性表型的影响。[4]

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结果：通过无偏倚的高通量小分子抑制剂筛选，我们发现了一种高效的抗OSCC化合物THZ1，它是一种特异性的CDK7抑制剂。RNA测序结果显示，低剂量THZ1处理可选择性抑制多种致癌转录本。值得注意的是，对这些THZ1敏感转录本的基因组特征进行进一步分析表明，它们通常与超级增强子（SE）相关。此外，仅SE分析就揭示了许多OSCC谱系特异性的主调控因子。最后，对THZ1敏感转录本和SE相关转录本的整合分析鉴定出多个新的OSCC癌基因，包括PAK4、RUNX1、DNAJB1、SREBF2和YAP1，其中PAK4是一种潜在的药物靶向激酶。结论：我们的整合方法构建了一个SE相关主调控因子和致癌转录本的目录，这可能显著促进对OSCC生物学的理解以及更具创新性的疗法的开发。[5]

C31H28CLN7O2

566.05

565.199

C, 65.78; H, 4.99; Cl, 6.26; N, 17.32; O, 5.65

1604810-83-4

bio-THZ1;1604811-14-4;THZ1-R;1621523-07-6;THZ1 Hydrochloride

73602827

Off-white to yellow solid powder

1.4±0.1 g/cm3

1.735

5.08

115

4

6

9

41

896

0

CN(C)C/C=C/C(=O)NC1=CC=C(C=C1)C(=O)NC2=CC=CC(=C2)NC3=NC=C(C(=N3)C4=CNC5=CC=CC=C54)Cl

OBJNFLYHUXWUPF-IZZDOVSWSA-N

InChI=1S/C31H28ClN7O2/c1-39(2)16-6-11-28(40)35-21-14-12-20(13-15-21)30(41)36-22-7-5-8-23(17-22)37-31-34-19-26(32)29(38-31)25-18-33-27-10-4-3-9-24(25)27/h3-15,17-19,33H,16H2,1-2H3,(H,35,40)(H,36,41)(H,34,37,38)/b11-6+

N-[3-[[5-chloro-4-(1H-indol-3-yl)pyrimidin-2-yl]amino]phenyl]-4-[[(E)-4-(dimethylamino)but-2-enoyl]amino]benzamide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: 5 mg/mL (8.83 mM) in 10% DMSO + 90% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液；超声助溶。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.42 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.42 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 2.08 mg/mL (3.67 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100μL 20.8mg/mL澄清的DMSO储备液加入到900μL 20％SBE-β-CD生理盐水中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。