1A-116

F3II (IC50 = 4 µM); MDA-MB-231 (IC50 = 21 µM); Rac1; Apoptosis
RAC1 (Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1) GTPase, specifically its interaction with Guanine Exchange Factors (GEFs) such as TIAM1, Vav1, Vav2, Vav3, and DBL.
The binding is dependent on the Tryptophan 56 (W56) residue of RAC1.

1A-116（48 小时）对 MDA-MB-231 和 F3II 细胞的增殖具有浓度依赖性效应，IC50 值分别为 4 μM 和 21 μM [1]。1A-116（1 和 10 μM；12 小时）显著增加 F3II 细胞中 Rac1 的表达，并以浓度依赖的方式降低细胞内 Rac1-GTP 水平 [1]。1A-116 在 50 和 100 μM 浓度下，12 小时内可显著增强 Rac1-P-Rex1 反应 [1]。1A-116（20 μM；每 5 小时给药一次，持续 25 小时）以昼夜节律的方式抑制 LN229 细胞的增殖 [2]。在 10 小时后，1A-116（10 μM；16 小时）显著降低细胞迁移，表明其具有时间调控性。同步化后时间（HPS）：血清冲击后，以小时为单位测量经过的时间[2]。1A-116（20、50 μM；6 小时）以一种依赖于昼夜节律的方式感知细胞的灭活[2]。在 GEF-Rac1 水平上，1A-116（100 nM）显示出 Rac1 抑制活性，并降低由 Vav2 和 Rac1 介导的翻转层厚度，但不影响 PAK1[3]。在 LN229 人胶质母细胞瘤细胞中，1A-116（20 µM）以昼夜节律依赖的方式抑制细胞增殖，在同步化后 10 小时（HPS）抑制作用最强，在 23 小时（HPS）抑制作用最弱。在 10 小时（10 HPS）和 23 小时（23 HPS）时，1A-116 抑制增殖的 IC50 值分别为 10.93 ± 0.9 µM 和 30.85 ± 1.78 µM。这些昼夜节律效应在 BMAL1 缺陷型 LN229E1 细胞中消失。[2] 在 LN229 细胞中，与 23 小时相比，在 10 小时应用 1A-116（20 µM，6 小时）能更有效地诱导早期细胞凋亡（Annexin V 染色）。在更高浓度（50 µM）下，时间依赖性差异无统计学意义。[2] 1A-116（10 µM）仅在 10 小时应用时显著抑制 LN229 细胞向无细胞区域的迁移，而在 23 小时应用时则无此作用。该浓度对细胞活力无影响。 [2] 在 COS-1 细胞中，1A-116（50 µM，处理 24 小时）抑制了组成型活性 Rac1 (Q61L) 介导的 SRE 激活约 40%。它还抑制了活性 GEF 的 SRE 激活：Vav1 Δ1-189 (40-50%)、Vav2 Δ1-186 (40-50%)、Vav3 DH-PH-ZF (40-50%)、致癌 Dbl (60%) 和 Tiam1 C1199 (75%)。[3] 在 SRE-荧光素酶报告基因检测中，1A-116 (50 µM) 抑制了致癌 Rac1 P29S 突变体的活性。 [3] 在表达 Rac1 Q61L 的 COS-1 细胞中进行下拉实验，用 1A-116（50 µM，24 小时）处理可降低活性 Rac1-GTP 的水平。[3] 在表达 Rac1 Q61L-EGFP 的 COS-1 细胞中，用 1A-116（50 µM，16 小时）处理可消除 Rac1 诱导的周边皱褶和片状伪足的形成。[3] 在人角质形成细胞 (Ker-CT) 的三维类器官培养中，1A-116（100 nM）可逆转由活性 Vav2 或 Rac1 F28L 稳定过表达引起的上皮增生和紊乱，但对活性 PAK1 (Y423) 驱动的表型没有影响。 [3]

1A-116（静脉注射；3 mg/kg；每日一次，持续 21 天）显示出强效的抗转移作用，且未造成明显损伤，体内转移性肺病灶总数减少了 60%。[1] 1A-116（20 mg/kg；腹腔注射；每日一次；ZT12 组疗程 73 天；ZT3 组疗程 68 天）在荷瘤小鼠中，与 ZT3 组相比，ZT12 组治疗延长了小鼠的寿命。Zeitgeber 时间 12 (ZT12) 表示灯光熄灭的时间（今晚 7 点），而 ZT0 表示灯光亮起的时间（今晚 7 点）。[2] 1A-116 显示出良好的细胞壁可及性 [3]。

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在携带颅内 LN229 人胶质母细胞瘤异种移植瘤的裸鼠模型中，每日在 ZT12（关灯）时腹腔注射 1A-116（20 mg/kg）可显著延长中位生存期（73 天），与 ZT3（开灯）时治疗组（68 天）或载体组（ZT12：64.5 天，ZT3：63.5 天）相比，疗效更佳。[2]

使用 AutoDock Vina 进行计算机模拟对接实验。结合口袋以 Rac1 的 W56 残基的 Cα 原子为中心，网格大小为 14 Å。将 1A-116 与来自 PDB 的 50 个 Rac1 构象进行对接，结果显示平均结合亲和力为 -6.02 ± 0.315 kcal/mol。[3]
与 Rac1 构象中 RMSD 值最大的两个构象（1E96A 和 2YINC）对接表明，1A-116 通过其胍基与 W56 形成氢键。与 1E96A 的结合亲和力为 -5.867 ± 0.1803 kcal/mol，与 2YINC 的结合亲和力为 -6.122 ± 0.2539 kcal/mol。 [3]
Rac1 W56F 和 Cdc42 F56W 突变体的分子对接实验表明，Rac1 W56F 的结合亲和力降低（-5.59 ± 0.0139 kcal/mol，野生型为 -6.08 ± 0.226 kcal/mol），而 Cdc42 F56W 的结合亲和力增加（-6.09 ± 0.00994 kcal/mol，野生型为 -5.69 ± 0.0170 kcal/mol），证实了 W56 位点的关键作用。预测的 Rac1 P29S 突变体的结合亲和力为 -6.18 ± 0.0402 kcal/mol。[3]

细胞增殖实验[1][2]
细胞类型： MDA-MB-231、F3II、LN229 细胞
测试浓度： 20 µM
孵育时间： 48 小时；间隔 5 小时，共 25 小时。
实验结果： 细胞增殖受到浓度依赖性和昼夜节律性抑制。

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细胞活力检测[3]
细胞类型： 致癌性Vav2/Rac1 F28L/PAK1酪氨酸423突变的Ker-CT人角质形成细胞
测试浓度： 100 nM
孵育时间：
实验结果： 在GEF-Rac1水平上抑制Rac1活性。

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细胞迁移检测[2]
细胞类型： LN229细胞
测试浓度： 10 µM
孵育时间： 16小时
实验结果： 10小时后细胞迁移能力降低，呈时间依赖性。

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细胞凋亡分析[2]
细胞类型：LN229 细胞
测试浓度：20、50 µM
孵育时间：6 小时
实验结果：细胞凋亡以昼夜节律依赖的方式诱导。

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蛋白质印迹分析[1]
细胞类型：F3II 细胞
测试浓度：1、10 µM
孵育时间：12 小时
实验结果：阻断 Rac1-P-Rex1 相互作用。以浓度依赖的方式降低细胞内 Rac1-GTP 水平。

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在增殖实验中，LN229 或 LN229E1 细胞（96 孔板中每孔 3×10^3 个细胞）经 2 小时血清冲击（50% FBS）同步化。在同步化后不同时间点（HPS），用 1A-116（0-100 µM）或溶剂处理细胞 72 小时。通过 0.1% 结晶紫摄取（570 nm 处的吸光度）或 Calcein AM 染色（520 nm 处的荧光）检测细胞生长。增殖抑制率 (Ip) 计算公式为：Ip = 1 -（药物处理组的摄取量 / 溶剂处理组的摄取量）。 [2]
对于细胞活力检测，将同步化的 LN229 细胞（96 孔板，每孔 2.5×10³ 个细胞）在 10 或 23 小时后用 1A-116（5 或 10 µM）或溶剂处理。16 小时后，通过计数 Calcein AM 染色的荧光细胞来测量细胞活力。[2]
对于细胞迁移检测，将同步化的 LN229 细胞（12 孔板，每孔 2.5×10⁵ 个细胞）接种于孔板中，并用硅胶塞形成无细胞区域。在处理时间移除硅胶塞，并在 10 或 23 小时后用 1A-116（10 µM）或溶剂处理细胞。16 小时后，用 Calcein AM 对细胞进行染色，并使用 ImageJ 软件测量迁移细胞覆盖的面积。 [2]
对于细胞凋亡检测，将同步化的LN229细胞（96孔板，每孔3×10³个细胞）用1A-116（20或50 µM）或载体处理6小时，处理时间分别为10小时或23小时。使用荧光标记的Annexin V检测早期细胞凋亡。[2]
对于定量实时PCR (qPCR)，将同步化的LN229细胞（6孔板，每孔8×10⁵个细胞）每隔4小时收集一次细胞，持续24小时。提取RNA并合成cDNA。使用SYBR Green进行qPCR，检测Bmal1、Per1、Rac1和Tiam1的mRNA水平，并以Actin进行标准化。 [2]
对于细胞内蛋白质印迹实验，将同步化的LN229细胞（96孔板中每孔3×10³个细胞）每隔3小时固定一次，持续24小时，并用针对TIAM1、BMAL1或PER1的单克隆抗体进行染色。[2]
对于SRE-荧光素酶检测，将COS-1细胞（6孔板中每孔4×10⁵个细胞）与编码活性GEF或GTP酶的质粒以及SRE-Luc和Renilla报告质粒共转染。然后用1A-116（50 µM）或溶剂处理细胞24小时，并使用双荧光素酶报告基因检测系统测定荧光素酶活性。 [3] 对于 Rac1 pull-down 实验，表达 Rac1 Q61L 的 COS-1 细胞用 1A-116 (50 µM) 或溶剂处理 24 小时。将细胞裂解液与偶联谷胱甘肽琼脂糖珠的 GST-PAK1 孵育，以下拉活性 Rac1-GTP。用抗 Rac1 抗体通过蛋白质印迹法检测结合的 Rac1。[3] 对于 3D 类器官培养，将 Ker-CT 细胞 (2×10⁵) 接种于聚碳酸酯插入物上培养 2 天，然后换用 3D-Barrier 培养基并进行气升法。气升法后第 6 天，用 1A-116 (100 nM) 处理培养物。培养11天后，将细胞固定、石蜡包埋、切片，并用苏木精-伊红染色。[3]
免疫荧光实验中，将表达Rac1 Q61L-EGFP的COS-1细胞接种于聚赖氨酸包被的盖玻片上，并用1A-116（50 µM）或溶剂处理24小时。细胞固定后，用Alexa Fluor 635-鬼笔环肽（用于F-肌动蛋白）和DAPI（用于细胞核）染色，并通过共聚焦显微镜进行分析。[3]

动物/疾病模型：雌性BALB/c近交系小鼠（8至10周龄；平均体重20克）[1]
剂量：3毫克/千克
给药途径：静脉注射（iv）；每日一次，持续21天。
实验结果：显示出较高的抗转移活性。

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动物/疾病模型：雄性NIH Swiss FoxN1(Δ/Δ)裸鼠（2月龄；胶质母细胞瘤模型）[2]。
剂量：20毫克/千克
给药途径：腹腔注射（ip）（ZT3、ZT12）；每日一次，ZT12持续73天，ZT3持续68天。
实验结果： 与 ZT3 治疗组相比，ZT12 治疗组的荷瘤小鼠存活时间更长。

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对于胶质母细胞瘤异种移植模型，2 月龄雄性无胸腺裸鼠（NIH Swiss foxN1Δ/Δ）饲养于 12 小时光照：12 小时黑暗循环（ZT0 时开灯，当地时间上午 7 点；ZT12 时关灯，当地时间晚上 7 点）。动物适应环境一周。使用立体定位仪（坐标：Bregma 点 -2°，ML，AP，0°，DV，-3.4°）将约 2×10⁵ 个活的 LN229 细胞颅内植入右侧纹状体。手术在 ZT3 至 ZT11 之间进行。小鼠恢复至少7天，期间皮下注射氨苄青霉素（6 mg/kg），并在饮用水中添加布洛芬（0.05 mg/mL）。在时间药理学治疗中，小鼠在ZT3或ZT12时每日腹腔注射1A-116（20 mg/kg，溶于200 µL溶剂H₂O）或溶剂。每周测量两次生存时间，并通过尸检和甲酚紫染色组织学分析确认肿瘤的存在。[2]

[1]. Preclinical development of novel Rac1-GEF signaling inhibitors using a rational design approach in highly aggressive breast cancer cell lines. Anticancer Agents Med Chem. 2014;14(6):840-51.

[2]. Timing of Novel Drug 1A-116 to Circadian Rhythms Improves Therapeutic Effects against Glioblastoma. Pharmaceutics. 2021 Jul 16;13(7):1091.

[3]. Computational and in vitro Pharmacodynamics Characterization of 1A-116 Rac1 Inhibitor: Relevance of Trp56 in Its Biological Activity. Front Cell Dev Biol. 2020 Apr 15;8:240.

1A-116是一种小分子Rac1抑制剂，采用基于分子对接的虚拟筛选方法进行合理设计开发。其设计目的是通过靶向Rac1上的Trp56残基来阻断Rac1与其鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）之间的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）。[3]
1A-116符合Lipinski的“五规则”和Veber的类药性规则（例如，分子量307.32 g/mol，预测logP值为4.67，具有2个氢键供体、3个氢键受体、3个可旋转键，极性表面积为50.41 Ų），表明其具有良好的口服生物利用度。[3]
该化合物在恶性胶质瘤细胞中显示出促凋亡和抗侵袭活性，并在多种癌细胞系中显示出抗增殖作用。其疗效受生物钟调节，通过其靶标 TIAM1 的节律性表达实现。[2][3]
1A-116 可抑制致癌 Rac1 P29S 突变体的活性，该突变体是日光照射型黑色素瘤中的一种驱动突变。[3]

C16H16F3N3

307.31355381012

307.129

C, 62.53; H, 5.25; F, 18.55; N, 13.67

1430208-73-3

1430208-73-3

71543346

White to off-white solid powder

4

50.4

2

4

3

22

385

0

DVIJFJSZZNOTLP-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C16H16F3N3/c1-10-7-11(2)9-12(8-10)21-15(20)22-14-6-4-3-5-13(14)16(17,18)19/h3-9H,1-2H3,(H3,20,21,22)

1-(3,5-dimethylphenyl)-2-[2-(trifluoromethyl)phenyl]guanidine

1A 116; 1A116; 1A-116

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: 61~100 mg/mL (198.5~325.4 mM)
Ethanol: ~61 mg/mL (~198.5 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (8.14 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: 2.5 mg/mL (8.14 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (8.14 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。