3α-AMINOCHOLESTANE (3AC)   中文名称: 3α-氨基胆甾烷（3AC）

SHIP1/SH2 domain-containing inositol-5′-phosphatase 1 (IC50 = 2.5 μM)
3α-Aminocholestane (3AC) therapy substantially reduces OPM2 cell viability. When compared to OPM2 cells, RPMI8226 and U266 cells exhibit much lower sensitivity to 3α-Aminocholestane treatment; yet, viability is significantly reduced at doses of ≥12.5 μM. After being treated for 36 hours with 3α-Aminocholestane, the proportion of cells in the S phase is significantly decreased, and the number of cells in the G2/M phase increases. On the other hand, in the less proliferative RPMI8226 and U266 cells, treatment with 3α-Aminocholestane blocks cell cycle progression in the G0 /G1 phase and results in a lower percentage of cells progressing through the S phase[2].

3α-氨基胆甾烷 (3AC) 疗法显着降低 OPM2 细胞活力。与 OPM2 细胞相比，RPMI8226 和 U266 细胞对 3α-氨基胆甾烷治疗的敏感性要低得多；然而，剂量≥12.5 μM 时活力显着降低。 3α-氨基胆甾烷处理36小时后，S期细胞比例明显下降，G2/M期细胞数量增加。另一方面，在增殖能力较低的 RPMI8226 和 U266 细胞中，用 3α-氨基胆甾烷治疗可阻断 G0 /G1 期的细胞周期进程，并导致进入 S 期的细胞百分比较低[2]。

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3α-氨基胆甾烷 (3AC) 选择性抑制 INPP5D (SHIP1) 的酶活性，IC50 约为 2.5 µmol/l，但对相关磷酸酶 INPP5L1 (SHIP2) 和 PTEN 的抑制活性不显著 (IC50 >20 µmol/l)。[1]
用 3α-氨基胆甾烷 (3AC) 处理患者来源的 Ph+ ALL 细胞可强烈诱导 SYK 的超活化（Y352位点磷酸化）。[1]
用 3α-氨基胆甾烷 (3AC) 处理患者来源的 TKI 耐药 Ph+ ALL 细胞可在四天内诱导细胞死亡。[1]
剂量反应分析显示，3α-氨基胆甾烷 (3AC) 对患者来源的 Ph+ ALL 细胞具有选择性毒性（IC50=2.8 µmol/l；n=5），而对成熟 B 细胞淋巴瘤细胞毒性较低（n=5）。[1]
用 SYK 抑制剂 PRT06207 预处理 Ph+ ALL 细胞，可在很大程度上保护细胞免受 3α-氨基胆甾烷 (3AC) 诱导的死亡，证明 Syk 的超活化是诱导细胞死亡所必需的。[1]
3α-氨基胆甾烷 (3AC) 在所有六例测试的、在 TKI 治疗下复发的 Ph+ ALL 病例（包括三例因 BCR-ABL1[T315I] 突变导致全局性 TKI 耐药的病例）中均诱导了大规模的细胞死亡（>95%）。相比之下，TKI 伊马替尼在 BCR-ABL1[T315I] 病例中无效。[1]

在 OPM2 攻击后，发现 3α-氨基胆甾烷 (3AC) 会导致体内多发性骨髓瘤 (MM) 生长减少（通过血浆中游离人 Igλ 轻链的量来测量）。此外，通过人 HLA-ABC 标记检测，与载体对照相比，用 3-氨基胆甾烷处理的小鼠的外周血显示出较少的循环 OPM2 细胞。最值得注意的是，用 3α-氨基胆甾烷治疗的小鼠在肿瘤攻击后的存活率大大提高。当用3α-氨基胆甾烷治疗的小鼠对治疗没有反应时，发现MM肿瘤有SHIP2的过度表达，这与体外处理OPM2细胞时相似，这意味着SHIP2表达较高的肿瘤细胞可能会被SHIP1选择抑制[2]。

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用 3α-氨基胆甾烷 (3AC) 治疗携带 TKI 耐药患者来源（BCR-ABL1[T315I]）Ph+ ALL 细胞的 NOD/SCID 移植受体小鼠，能显著延长总生存期（P=0.0002，对数秩检验）并通过生物发光成像显示降低白血病负荷。[1]

磷酸酶酶活性检测[2]
荧光偏振法如前所述。简而言之，重组SHIP1或SHIP2在潜在化学抑制剂存在的情况下与其底物PtdIns(3,4,5)P3混合。将反应产物与ptdins (3,4)P2检测蛋白和荧光PI(3,4)P2探针混合。新合成的ptdins (3,4)P2取代了检测蛋白，从而增强了混合物中未结合的荧光探针，并降低了平均极化单位。因此，确定的SHIP抑制剂（2-苯基苯并[h]喹啉-4-基）-[2]哌啶基-甲醇盐酸盐（1PIE）， 1-[（氯苯基）甲基]-2-甲基-5-（甲基硫）- 1h -吲哚-3-乙胺盐酸盐（2PIQ）和（2-adamantan-1-基-6,8-二氯喹啉-4-基）-吡啶-2-甲醇盐酸盐（6PTQ）随后通过孔雀石绿法或荧光偏振法检测重组SHIP1或SHIP2对游离磷酸盐产生的抑制作用。为了证明SHIP1和SHIP2对其他磷酸酶的选择性，我们从OPM2细胞中免疫沉淀SHIP1和肌醇5-磷酸酶ocl。为此，OPM2细胞在ip裂解缓冲液（20 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、1 mmol/L EGTA、1% Triton × 100、1 mmol/L苯基甲基磺酰氟和Halt蛋白酶抑制剂）中裂解，并使用小鼠IgG抗体免疫沉淀SHIP1或OCRL。用免疫沉淀（IP）裂解缓冲液洗涤4次，用tris缓冲盐水(TBS)/MgCl2 （10 mmol/L）洗涤1次，用TBS/MgCl2重悬。将SHIP抑制剂（200 μmol/L）加入微球5 min，免疫沉淀的SHIP1在100 μmol/L PtdIns(3,4,5)P3 存在下孵育，免疫沉淀的OCRL在100 μmol/L PtdIns(4,5)P2存在下孵育30 min。按照厂家说明加入孔雀石绿溶液，20 min后读板。3α-氨基胆甾(3AC)的鉴定见前文。

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研究引用指出，3α-氨基胆甾烷 (3AC) 选择性抑制 INPP5D (SHIP1) 的酶活性，IC50 约为 2.5 µmol/l，但对相关磷酸酶 INPP5L1 (SHIP2) 和 PTEN 的抑制活性不显著 (IC50 >20 µmol/l)。所提供的文本中未详细描述酶活性测定（如激酶活性、SPR、ITC、HTRF）的具体实验方案。[1]

细胞活力测定[2]
随着化合物浓度的增加，细胞被处理三次或更多次。根据制造商的说明，用细胞计数试剂盒测定细胞活力。用化合物处理细胞的OD除以对照细胞的OD，以未处理细胞的百分比表示细胞活力。结果用三个单独实验的平均值±标准误差表示。在PIP加回实验中，用10 μmol/L SHIP抑制剂处理MCF-7细胞2 h，洗净细胞，加入新鲜培养基。细胞在不含（0 μmol/L）或含有（10或20 μmol/L） PtdIns(3,4)P2-diC16 （P-3416）或PtdIns(3,5)P2-diC16 （P-3516）的条件下培养36 h，用Dojindo细胞计数试剂盒测定细胞活力。

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细胞活力测定[1]
将10万个人ALL细胞以50 μl的培养基接种于96孔板的每孔中。将伊马替尼或其他抑制剂稀释后，在100 μl培养基中按指定浓度孵育。3 d后，用细胞计数试剂盒-8测定活细胞数。以载药处理细胞的基线值作为参考（设为100%）计算折叠变化。

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流式细胞术[1]
流式细胞术中使用的抗体见补充表6。对于细胞周期分析，根据制造商的说明使用BrdU流式细胞术试剂盒或Click-iT EdU流式细胞术检测试剂盒。为了评估细胞内ROS水平，将ALL细胞与1 μM 5-（和6-）氯甲基-2 ',7 ' -二氯二氢荧光素（CM-H2DCFDA）在37℃下孵育7分钟，使染料被ROS氧化。用PBS洗涤后，将细胞在37°C的PBS中再孵育15分钟，使细胞内酯酶使氧化形式的CM-H2DCFDA完全去乙酰化。然后通过流式细胞术直接分析荧光水平，对活细胞进行门控。

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Western blotting [1]
细胞缓冲液中添加蛋白酶抑制剂鸡尾酒和磷酸酶抑制剂鸡尾酒套装II，用于裂解细胞。每个样品10 μg的蛋白裂解物在微型预制凝胶上分离，并转移到硝化纤维素膜上。蛋白质检测采用一抗、碱性磷酸酶偶联二抗和化学发光底物。一抗的详细情况见补充表7。

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小鼠细胞的集落形成试验[1]
本实验使用了10,000个bcr - abl1转化的ALL细胞或100,000个cml样细胞。将细胞重悬于小鼠MethoCult培养基中，并在直径3cm的培养皿上镀上一盘水以防止蒸发。7 ~ 14天后，计数菌落。

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用于信号激活的 Western blot 分析：用 3α-氨基胆甾烷 (3AC)（10 µmol/l）处理患者来源的 Ph+ ALL 细胞指定时间点（0、4、8、16、60 分钟）。然后裂解细胞，蛋白质裂解物通过凝胶电泳分离，转膜，并使用针对 SYK (Y352)、SRC (Y416)、BTK (Y223) 和 PLCγ2 (Y1217) 磷酸化形式的抗体进行检测，以评估近端 pre-BCR 信号传导的超活化。[1]
用于细胞活力测定：将 100,000 个人类 ALL 细胞接种在 96 孔板中。将 3α-氨基胆甾烷 (3AC) 稀释并在指定浓度下孵育。3 天后，使用细胞计数试剂盒测定细胞活力。以载体处理细胞的基线值为参考计算倍数变化。[1]
为了测试 SYK 超活化在 3α-氨基胆甾烷 (3AC) 诱导死亡中的作用，在添加 3α-氨基胆甾烷 (3AC)（7.5 µmol/l）之前，用 SYK 抑制剂 PRT06207（2.5 µmol/l）预处理 ALL 细胞两天，并监测活力。[1]
用不同浓度的 3α-氨基胆甾烷 (3AC) 处理患者来源的 Ph+ ALL 细胞（n=5）和成熟 B 细胞淋巴瘤细胞（n=5），生成剂量反应曲线以确定 IC50 值。[1]

3α-氨基胆甾烷悬浮于 0.3% Klucel/H2O 溶液中，浓度为 11.46 mM，通过腹腔注射 100 μL 溶液给药。NOD/SCID/γcIL2R (NSG) 小鼠 OPM2 肿瘤攻毒研究 [2]
将 1 × 10⁷ 个 OPM2 细胞腹腔注射到 NOD/SCID/γcIL2R (NSG) 小鼠（美国缅因州巴港杰克逊实验室）中，6 小时后，小鼠接受 3α-氨基胆甾烷 (3AC) 或载体的初始注射。3α-氨基胆甾烷 (3AC) 悬浮于 0.3% Klucel/H2O 溶液中，浓度为 11.46 mmol/L，通过腹腔注射 100 μL 溶液给药。载体对照组小鼠注射100 μL 0.3% Klucel/H2O溶液。处理组小鼠体内3α-氨基胆甾烷（3AC）的最终浓度为60 μmol/L。随后，小鼠在接下来的6天内每天接受3α-氨基胆甾烷（3AC）或载体治疗，之后在剩余的15周生存研究中每周治疗两次。在某些情况下，当兽医认为小鼠濒死并建议实施安乐死后，切除载体组或3α-氨基胆甾烷（3AC）组小鼠的肿瘤，并制备单细胞悬液，用于SHIP2表达的Western blot分析。

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小鼠外周血中人Igλ轻链的酶联免疫吸附试验[2]
在OPM2攻击4周后，将小鼠采血至血清收集管中，并在5000g离心5分钟后收集血细胞沉淀，获得血清。使用Biovendor公司的Ig轻链检测试剂盒，按照制造商的说明测定人Igλ轻链的含量。

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小鼠血液中循环OPM2细胞的检测[2]
在OPM2攻击4周后，将小鼠采血至血液收集管中，裂解红细胞。将白细胞与抗CD16/32抗体孵育以阻断Fc受体结合，然后用抗人HLA-ABC抗体（克隆W6/32）进行染色。样本采集使用LSRII流式细胞仪（Becton Dickinson公司），采集完成后，通过排除DAPI（二氨基苯基吲哚）染色阳性的细胞，将死细胞排除在分析之外。

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患者来源的Ph+ ALL细胞（例如，携带BCR-ABL1[T315I]突变的BLQ5细胞系）经编码萤火虫荧光素酶的慢病毒载体转导。然后将这些细胞通过尾静脉注射注入亚致死剂量照射的NOD/SCID小鼠体内。[1]
携带白血病异种移植瘤的小鼠每日腹腔注射3α-氨基胆甾烷（3AC）（50 mg/kg）或载体对照。[1]
使用IVIS系统进行生物发光成像，在体内监测白血病进展。在成像前 15 分钟腹腔注射 D-荧光素。[1]
采用 Kaplan-Meier 分析比较治疗组和对照组小鼠的总生存期。[1]

[1]. Signalling thresholds and negative B-cell selection in acute lymphoblastic leukaemia. Nature. 2015 May 21;521(7552):357-61.

[2]. Therapeutic Potential of SH2 Domain-Containing Inositol-5′-Phosphatase 1 (SHIP1) and SHIP2 Inhibition in Cancer. Mol Med. 2012 Feb 10;18:65-75.

B细胞的选择取决于B细胞抗原受体（BCR）信号强度的中间水平：信号强度低于最低阈值（例如，无功能性BCR）或高于最高阈值（例如，自身反应性BCR）均会导致阴性选择。约25%的急性淋巴细胞白血病（ALL）病例中，细胞携带致癌的BCR-ABL1酪氨酸激酶（费城染色体阳性），该激酶模拟组成型激活的pre-BCR信号。目前的治疗方法主要集中于开发更有效的酪氨酸激酶抑制剂，以将致癌信号抑制到低于生存最低阈值的水平。我们检验了以下假设：靶向过度激活（高于最高阈值）将激活清除自身反应性B细胞的缺失检查点，并选择性地杀死ALL细胞。我们通过检测小鼠 BCR-ABL1 细胞中近端前 B 细胞受体 (pre-BCR) 信号传导的各个组成部分发现，Syk 酪氨酸激酶活性的逐步增加是诱导细胞死亡的必要且充分条件。Syk 过度激活在功能上等同于 ALL 细胞上自身反应性 BCR 的急性激活。尽管发生了致癌转化，这种基本的阴性选择机制在 ALL 细胞中仍然有效。与正常前 B 细胞不同，患者来源的 ALL 细胞高表达抑制性受体 PECAM1、CD300A 和 LAIR1。遗传学研究表明，Pecam1、Cd300a 和 Lair1 通过募集抑制性磷酸酶 Ptpn6（参考文献 7）和 Inpp5d（参考文献 8）来调节致癌信号强度，从而发挥关键作用。我们利用一种新型小分子INPP5D（也称为SHIP1）抑制剂，证实了SYK的药理学过度激活和B细胞阴性选择的参与代表了一种克服人类ALL耐药性的潜在新策略。
针对INPP5D的小分子抑制剂3-α-氨基胆甾烷（3AC）（扩展数据图10f）选择性地抑制了INPP5D（SHIP1；IC50 ~2.5 μmol/l）的酶活性，但对相关的磷酸酶INPP5L1（SHIP2）和PTEN（IC50 >20 μmol/l）没有影响。用3AC处理患者来源的Ph+ ALL细胞可诱导SYK的强烈过度激活（图4a）。在患者来源的髓系CML样本中，Syk活性的基线水平非常低，且对3AC治疗无反应（扩展数据图10g）。对患者来源的Ph+ ALL细胞中3AC介导的INPP5D抑制的生化表征显示，近端pre-BCR信号分子被强效且短暂地过度激活（图4a）。用3AC处理患者来源的TKI耐药Ph+ ALL细胞，可在4天内诱导细胞死亡。重要的是，用SYK抑制剂（PRT06207）预处理Ph+ ALL细胞可显著保护Ph+ ALL细胞免受3AC诱导的细胞死亡（图4b），表明Syk的过度激活是诱导细胞死亡所必需的。剂量反应分析显示，与成熟B细胞淋巴瘤（n=5；扩展数据图10h）相比，3AC对患者来源的Ph+ ALL细胞具有选择性毒性（IC50=2.8 μmol/l；n=5）。接下来，我们研究了6例Ph+ ALL患者的药物反应，这些患者均在TKI治疗后复发，其中包括3例因BCR-ABL1T315I突变而出现全身性TKI耐药的病例。正如预期的那样，TKI伊马替尼治疗对BCR-ABL1T315I病例无效（扩展数据图10i）。相反，无论BCR-ABL1突变状态如何，3AC均能在所有6例Ph+ ALL病例中诱导大量细胞死亡（>95%）（扩展数据图10i）。同样，用3AC治疗携带TKI耐药患者来源（BCR-ABL1T315I）Ph+ ALL细胞的NOD/SCID移植受体小鼠，显著延长了总生存期（P=0.0002，log-rank检验；图4c），并降低了白血病负荷（图4d）。虽然还需要进一步研究来优化针对该通路的药物靶向治疗，但这些实验表明，SYK 的瞬时过度激活和阴性 B 细胞选择的参与是克服 Ph+ ALL 耐药性的一种强有力的新策略。[1]

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许多肿瘤表现出磷脂酰肌醇 3-激酶 (PI3K)-PtdIns(3,4,5)P(3)-蛋白激酶 B (PKB/Akt) 信号通路的激活增强。长期以来，人们认为脂质磷酸酶 SH2 结构域肌醇-5'-磷酸酶 1 (SHIP1) 和 SHIP2 通过水解 PtdIns(3,4,5)P(3) 生成 PtdIns(3,4)P(2) 来拮抗该通路诱导的生存信号，从而发挥肿瘤抑制作用。然而，越来越多的证据表明，PtdInd(3,4)P(2)能够激活Akt，并且是Akt激活所必需的，这提示SHIP1/2酶可能作为原癌基因发挥作用。我们近期报道了一种新型的SHIP1选择性化学抑制剂（3α-氨基胆甾烷[3AC]），该抑制剂能够杀伤恶性血液细胞。在本研究中，我们进一步探讨了3AC治疗对多发性骨髓瘤（MM）的生化影响，并证实SHIP1抑制可使MM细胞系停滞于细胞周期的G0/G1期或G2/M期，从而导致caspase激活和细胞凋亡。此外，我们还发现，用SHIP1抑制剂3AC治疗小鼠可阻断MM细胞的体内生长。此外，我们还鉴定了三种新型的泛SHIP1/2抑制剂，它们能够通过G2/M期阻滞、caspase激活和细胞凋亡诱导有效杀伤MM细胞。有趣的是，在缺乏SHIP1表达的SHIP2表达乳腺癌细胞中，泛SHIP1/2抑制也会降低活细胞数量，而添加外源性PtdIns(3,4)P(2)可以挽救这一现象。总之，本研究表明，抑制SHIP1和SHIP2可能在多种肿瘤类型的治疗中具有广泛的临床应用价值。
除了作为磷酸酶外，SHIP1还具有掩蔽受体尾部以防止其他信号蛋白募集的功能，或者作为Shc、DOK1和Grb2等蛋白的衔接蛋白，因此被认为可以降低Ras信号传导。理论上，用3AC阻断磷酸酶活性可能不会影响SHIP1的这些其他功能。然而，我们观察到，在MM细胞中，经3AC长期处理后，SHIP1蛋白表达降低，这表明这些支架蛋白功能可能不再发挥作用。最近的研究表明，SHIP-1磷酸化后会被泛素化并靶向蛋白酶体降解。然而，我们并未观察到在用3AC预处理后，IGF-1刺激的MM细胞中SHIP-1磷酸化水平的差异（未发表的观察结果，GM Fuhler）。因此，3AC处理后SHIP-1蛋白酶体降解的原因尚不清楚。[2]

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3α-氨基胆甾烷 (3AC)是一种新型的小分子磷酸酶INPP5D (SHIP1)抑制剂。[1]
它代表了一种通过抑制负调控因子INPP5D来过度激活SYK激酶活性的药理学策略。这会激活B细胞内在的负选择检查点，防止酪氨酸激酶信号过度激活，从而导致前B细胞急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞的选择性死亡。 [1]
这种机制有望克服耐药性，尤其是在TKI耐药的Ph+ ALL中，包括携带BCR-ABL1[T315I]突变的病例。[1]
对INPP5D抑制和随后的SYK过度激活的敏感性似乎是B系白血病细胞（如Ph+ ALL）特有的，在所测试的条件下，髓系白血病（如CML）或正常前B细胞中未观察到。[1]

C27H49N

387.69

387.386

C, 83.65; H, 12.74; N, 3.61

2206-20-4

5351709

White to off-white solid powder

104.5-105.5℃ (methanol )

9.1

26

1

1

5

28

540

9

C[C@H](CCCC(C)C)[C@H]1CC[C@@H]2[C@@]1(CC[C@H]3[C@H]2CC[C@@H]4[C@@]3(CC[C@H](C4)N)C)C

RJNGJYWAIUJHOJ-FBVYSKEZSA-N

InChI=1S/C27H49N/c1-18(2)7-6-8-19(3)23-11-12-24-22-10-9-20-17-21(28)13-15-26(20,4)25(22)14-16-27(23,24)5/h18-25H,6-17,28H2,1-5H3/t19-,20+,21-,22+,23-,24+,25+,26+,27-/m1/s1

(3R,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-10,13-dimethyl-17-((R)-6-methylheptan-2-yl)hexadecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-amine

3α-Aminocholestane; 3AC; 3-AC; 2206-20-4; 3alpha-Aminocholestane; 3; A-Aminocholestane; (3alpha,5alpha)-Cholestan-3-amine; (3R,5S,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-10,13-dimethyl-17-[(2R)-6-methylheptan-2-yl]-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-amine; 3??-Aminocholestane; 3+/--Aminocholestane; 3 AC

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 3.25 mg/mL (8.38 mM) (饱和度未知) in 10% EtOH + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 32.5 mg/mL的澄清EtOH储备液加入到400 μL PEG300中并混合均匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 3.25 mg/mL (8.38 mM) (饱和度未知) in 10% EtOH + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 32.5 mg/mL 澄清 EtOH 储备液添加到 900 μL 玉米油中并充分混合。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。