4-O-Methyl honokiol   中文名称: 4-O-和厚朴酚

PPARγ; NF-κB

4-O-Mmethyl honokiol 是从厚朴中分离出来的天然新木脂素，可作为 PPARγ 激动剂并降低 NF-κB 活性。 4-O-methylhonokio (20 μM) 可增强前列腺 PC-3 和 LNCap 细胞中的 PPARγ 表达、转录和 DNA 结合活性以及核转位。 4-O-Mmethyl honokiol (0-30 μM) 抑制 LNCaP 和 PC-3 癌细胞的生长，产生 G0/G1 期停滞并促进死亡，这种作用可以被 PPARγ 拮抗剂逆转。 4-O-methylhonokiol 可以降低 NF-κB 活性和癌细胞发育，但这种影响及其 PPARγ 的激活可以通过敲低 p21 来消除 [1]。 4-O-methylhonokiol（0.5、1 和 2 μM）可减少培养的星形胶质细胞以及培养的星形胶质细胞和小胶质细胞中 LPS 诱导的 NO、PGE2、ROS、TNF-α 和 IL-1β 的释放。神经胶质BV-2细胞中淀粉样蛋白的合成[2]。

---

在体外研究中，我们还发现4-O-甲基和厚朴酚抑制LPS刺激的培养星形胶质细胞中iNOS和COX-2的表达，以及活性氧、一氧化氮、前列腺素E2、肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-1β的产生。4-O-甲基和厚朴酚还通过抑制IκB降解以及p50和p65易位到脑核和培养的星形胶质细胞中来抑制NF-κB的转录和DNA结合活性。与对神经炎症的抑制作用一致，4-O-甲基和厚朴酚抑制了LPS诱导的Aβ1-42生成、β和γ分泌酶活性、淀粉样前体蛋白（APP）、BACE1和C99的表达，以及脑、培养的星形胶质细胞和小胶质细胞BV-2细胞中星形胶质细胞的激活和神经元细胞死亡[2]。

在 SW620 和 PC3 异种移植模型中，4-O-甲基和厚朴酚（40 或 80 mg/kg，每天腹膜内给药，持续 4 周）减少了 SW620 和 PC3 肿瘤的生长。在肿瘤组织中，4-O-methylhonokio显着提高 p21 和 PPARγ 的表达 [1]。 4-O-甲基和厚朴酚（0.5 或 1 mg/kg/天，持续 3 周）可以阻止 LPS 诱导的小鼠 COX-2 和 iNOS 的产生，并显着减轻 LPS 诱导的记忆障碍。在用脂多糖 (LPS) 处理的小鼠大脑中，4-O-甲基和厚朴酚也表现出对 Aβ1-42 形成的抑制作用，并激活小胶质细胞和星形胶质细胞 [2]。

---

MH/4-O-甲基和厚朴酚在体内异种移植物模型中抑制SW620和PC3肿瘤的生长[1]
在PC3异种移植物研究中，MH/4-O-甲基和厚朴酚每天腹腔注射给肿瘤体积在100至300 mm3之间的小鼠，持续4周。在第28天，记录最终的肿瘤重量。在PC3肿瘤异种移植物中，用40和80 mg·kg-1的MH以及10 mg·kg−1的顺铂治疗的小鼠肿瘤体积分别为对照组的71.0%、57.7%和46.6%。在PC3肿瘤异种移植物中，用40和80 mg·kg-1的MH/4-O-甲基和厚朴酚和10 mg·kg−1的顺铂治疗的小鼠肿瘤重量分别为对照组的40.1%、30.9%和22.1%（图5A）。通过H&E对肿瘤切片的免疫组织化学分析，以及针对PCNA和Ki67染色的增殖抗原显示，40和80 mg·kg−1都能剂量依赖性地抑制肿瘤细胞的生长（图5B）。此外，MH治疗的肿瘤组织中p65和p50的核染色强度有降低的趋势（图5B）。此外，MH治疗的肿瘤中PPARγ对抗PPARγ的免疫反应也比未治疗的肿瘤组织更强烈。与体外抑制作用相似，MH增强了PPARγ的DNA结合活性，但抑制了肿瘤组织中NF-κB的活性（图5C）。MH增加了肿瘤组织中bax和切割caspases-3的表达，但降低了bcl-2的表达（图5D）。免疫组织化学分析还显示，与对照组相比，MH治疗的肿瘤组织中切割的胱天蛋白酶-3阳性细胞的表达显著增加。MH治疗的肿瘤组织中凋亡细胞死亡也显著增加（图5B）。此外，MH显著增加了肿瘤组织中p21和PPARγ的表达（图5B-D）。

细胞生长试验[1]
将细胞（每孔5×104个细胞）铺在24孔板上。使用排除性台盼蓝测定法，在用MH（0-30μM）处理0-72小时的细胞中评估4-O-甲基和厚朴酚/MH的细胞生长抑制作用。

---

萤光素酶活性的转染和测定[1]
将细胞（每孔1×105个细胞）铺在24孔板中，根据制造商的规范，使用OPTI-MEN中的质粒和脂质体PLUS的混合物，用pNF-κB-Luc质粒（5×NF-κB；Stratagene，La Jolla，CA，USA）或质粒pFA-GAL4-PPARγ瞬时转染。在TNF-α（10 ng·mL-1）不存在（用于PPARγ活性测定）或存在（用于NF-κB活性测定）的情况下，用4-O-甲基和厚朴酚MH处理转染细胞8小时。为了诱导NF-κB萤光素酶活性，我们用TNF-α（10-ng·mL−1）共处理细胞。使用萤光素酶测定试剂盒测量萤光素酶活性。

---

流式细胞术细胞周期分析[1]
亚融合细胞在培养基中用4-O-甲基和厚朴酚MH（0-30μM）处理0-72小时。分析方法如其他地方所述（Ban等人，2009a）。

---

下拉分析[1]
制备MH/4-O-甲基和厚朴酚珠缀合物，并如前所述进行下拉分析（Shim等人，2008）。MH与溴化氰（CNBr）活化的Sepharose 4B结合。简而言之，将MH（1 mg）溶解在500μL偶联缓冲液（0.1 M NaHCO3和0.5 M NaCl，pH 6.0）中。将溴化氰活化的琼脂糖4B溶胀，用1mM HCl洗涤，然后用偶联缓冲液洗涤。将溴化氰活化的Sepharose 4B珠加入含MH的偶联缓冲液中，在4°C下孵育24小时。用三个循环的交替pH洗涤缓冲液（缓冲液1，0.1 M醋酸盐和0.5 M NaCl，pH 4.0；缓冲液2，0.1 M Tris-HCl和0.5 M氯化钠，pH 8.0）洗涤MH偶联的Sepharrose 4B。然后用结合缓冲液（0.05 M Tris-HCl和0.15 M NaCl，pH 7.5）平衡MH偶联的珠粒。如前所述，在不存在MH的情况下制备对照非偶联CNBr-活化的Sepharose 4B珠。对于下拉测定，将来自PC-3前列腺癌症细胞的PPARγ蛋白或细胞裂解物与MH-Sephorse 4B珠在反应缓冲液（50mM Tris，pH 7.5，5mM EDTA，150mM NaCl，1mM二硫代苏糖醇，0.01%Nonidet P-40，2μg·mL−1 BSA，0.02mM PMSF，1×蛋白酶抑制剂）中孵育。用缓冲液（50 mM Tris，pH 7.5，5 mM EDTA，150 mM NaCl，1 mM二硫苏糖醇，0.01%Nonidet P-40，0.02 mM PMSF）洗涤珠子五次，用PPARγ抗体或细胞裂解物通过免疫印迹分析结合到珠子上的蛋白质。

---

培养的细胞同时用LPS（1μg/ml）和溶解在0.05%乙醇中的几种浓度（0.5、1、2μM）的4-O-甲基和厚朴酚处理，24小时后收获细胞。进行蛋白质印迹，测定Aβ水平和分泌酶活性。[2]

---

---

一氧化氮和PGE2测定[2]
星形胶质细胞在96孔板中生长，然后在不存在或存在不同浓度的4-O-甲基和厚朴酚的情况下与LPS（1μg/ml）一起孵育24小时。通过Griess反应评估上清液中亚硝酸盐的积累。将每50μl培养上清液与等体积的Griess试剂[0.1%N-（1-萘基）-乙二胺，1%磺胺在5%磷酸中]混合，在室温下孵育10分钟。在微孔板吸光度读数器中测量540 nm处的吸光度，并使用一系列已知浓度的亚硝酸钠作为标准。根据制造商的说明，在星形胶质细胞的培养上清液中，使用PGE2酶免疫测定（EIA）试剂盒（研发系统）测定PGE2浓度。

---

活性氧（ROS）的产生[2]
为了监测培养的星形胶质细胞中ROS的细胞内积累，使用了荧光探针2'，7'-二氯荧光素二乙酸酯（DCF-DA）。在存在或不存在4-O-甲基和厚朴酚l（0.5、1、2μM）的情况下，用LPS（1μg/ml）处理24小时后，在含有145 mM NaCl、5 mM氯化钾（KCl）、1 mM氯化镁（MgCl2）、1 mmol氯化钙（CaCl2）、4 mM碳酸氢钠（NaHCO3）、5.5 mM葡萄糖、10 mM HEPES的改良Kreb缓冲液中洗涤细胞，pH 7.4。将细胞悬浮液转移到塑料管中。通过在黑暗中注射5μM DCF-DA开始测量。在37°C下孵育30分钟后，用荧光计在Ex=485和Em=538 nm下测定生成量。

在体内异种移植动物模型中进行抗肿瘤活性研究[1]
所有涉及动物的研究均按照ARRIVE动物实验报告指南进行报告（Kilkenny等，2010；McGrath等，2010）。将SW620和PC3细胞（每只动物0.1 mL PBS中含1 × 10⁷个细胞）皮下注射到小鼠右侧腹部。20天后，当肿瘤平均体积达到300–400 mm³或约50 mm³（前列腺癌）时，向荷瘤裸鼠腹腔注射MH/4-O-甲基厚壳碱（溶于0.1% DMSO，剂量分别为40和80 mg·kg⁻¹），每周两次，持续3周。同时，每周腹腔注射一次顺铂（10 mg·kg⁻¹）作为阳性对照。用0.1% DMSO处理的组被指定为对照组。肿瘤体积用游标卡尺测量，并按以下公式计算：(A × B²)/2，其中A为两个维度中较大的一个，B为较小的一个。本研究中4-O-甲基霍诺基醇的剂量（0.5和1 mg/kg/天）参考了我们之前的研究。将4-O-甲基霍诺基醇（15和30 μg/只小鼠）添加到饮用水中（每只小鼠每日平均饮水量为5 ml），并在诱导记忆障碍前让小鼠自由饮水3周，如图1B所示。[2] 脂多糖诱导的记忆障碍小鼠模型[2] 所有小鼠均饲养在自动维持温度为21-25°C、相对湿度为45-65%且光照周期可控的房间内。多项研究报道，重复腹腔注射LPS可诱导小鼠出现类似阿尔茨海默病（AD）的认知障碍。因此，我们采用此方法构建AD小鼠模型。将LPS（终浓度为0.1 mg/ml）溶解于生理盐水中，分装后于-20°C保存备用。连续7天，每日腹腔注射LPS（250 μg/kg）或对照（生理盐水）。随后，采用两种不同的行为学测试（水迷宫和被动回避测试）评估小鼠的学习和记忆能力。两次测试间隔一天，以使小鼠适应新的环境，如图1B所示。

---

水迷宫测试[2]
水迷宫测试也是一种广泛认可的记忆测试方法，我们按照Morris等人的方法进行测试。迷宫测试使用SMART-CS程序和设备进行。一个圆形塑料水池（高35 cm，直径100 cm）内注满温度为22-25°C的乳白色水。一个逃生平台（高：14.5厘米，直径：4.5厘米）被放置在水面以下0.5-1厘米处。在训练试验中，小鼠被放入水池中，并被允许在平台上停留10秒，然后在第二次试验间隔期间被放回笼中。在60秒内未找到平台的小鼠在试验结束时被放置在平台上10秒。它们被允许自由游泳，直到找到逃生平台。这些试验在单个平台上进行，并采用三种不同的旋转起始位置。每只小鼠的逃生潜伏期、逃生距离、游泳速度和游泳模式均由位于水池中央上方的摄像头通过SMART-LD程序进行监测。

---

探针测试[2]
为了评估记忆巩固情况，在5天的习得测试后24小时进行探针试验。在该试验中，平台从水池中移除，小鼠被允许自由游泳。在这些测试中，记录了小鼠在目标象限停留的时间百分比以及60秒内穿越目标区域的次数。小鼠在目标象限停留的时间被用来衡量学习后记忆巩固的程度。目标象限停留时间也被用作空间记忆的指标。每只小鼠的游泳模式都由位于水池中央上方的摄像头进行监测，该摄像头连接到上述SMART-LD程序。

[1]. 4-O-methylhonokiol, a PPARγ agonist, inhibits prostate tumour growth: p21-mediated suppression of NF-κB activity. Br J Pharmacol. 2013 Mar;168(5):1133-45.

[2]. Inhibitory effect of 4-O-methylhonokiol on lipopolysaccharide-induced neuroinflammation, amyloidogenesis and memory impairment via inhibition of nuclear factor-kappaB in vitro and in vivo models. J Neuroinflammation. 2012 Feb 19;9:35.

已有报道称，4-O-甲基厚朴酚存在于厚朴（Magnolia officinalis）、弗吉尼亚厚朴（Magnolia virginiana）和卵叶厚朴（Magnolia obovata）中，并有相关数据报道。

---

背景与目的：本研究旨在探讨厚朴成分之一的4-O-甲基厚朴酚（MH）对人前列腺癌细胞的影响及其作用机制。
实验方法：本研究检测了MH在前列腺癌细胞和正常细胞中的抗癌作用，并利用小鼠异种移植模型在体内验证了其作用。
主要结果：MH可增加前列腺癌细胞PC-3和LNCap中PPARγ的表达。下拉实验和分子对接研究表明，MH可直接与PPARγ结合。MH还能增强PPARγ的转录活性，但降低NF-κB的活性。 MH抑制人前列腺癌细胞的生长，而PPARγ拮抗剂GW9662可减弱这种抑制作用。MH诱导细胞凋亡，这与G0/G1期细胞周期阻滞有关。MH增加细胞周期调节因子p21和凋亡蛋白的表达，同时降低Rb磷酸化和抗凋亡蛋白的表达。用p21 siRNA或p21突变质粒转染PC3细胞（该突变质粒靶向细胞周期蛋白D1/细胞周期蛋白依赖性激酶4结合位点）可消除MH对细胞生长、细胞活力及相关蛋白表达的影响。动物实验表明，MH抑制肿瘤生长、NF-κB活性和抗凋亡蛋白的表达，同时增加肿瘤组织中PPARγ的转录活性和表达，以及凋亡蛋白和p21的表达。
结论和意义：MH通过激活PPARγ、抑制NF-κB和阻滞细胞周期来抑制人前列腺癌细胞的生长。因此，MH可能是一种治疗前列腺癌的有效工具。[1]

---

背景：神经炎症在阿尔茨海默病（AD）的发病机制和进展中起着重要作用。我们之前已证实，脂多糖（LPS）诱导的神经炎症会导致记忆障碍。本研究探讨了厚朴（Magnolia officinalis）成分之一的4-O-甲基厚朴酚对脂多糖（LPS）诱导的记忆障碍的潜在预防作用及其机制。方法：我们研究了4-O-甲基厚朴酚（溶于0.05%乙醇，浓度分别为0.5和1 mg/kg）是否能预防腹腔注射LPS（250 μg/kg，每日一次，共7次）诱导的阿尔茨海默病（AD）模型小鼠的记忆功能障碍和淀粉样蛋白生成。此外，我们还研究了4-O-甲基厚朴酚（0.5、1和2 μM）对LPS处理的培养星形胶质细胞和BV-2小胶质细胞的抗神经炎症和抗淀粉样蛋白生成作用。结果：口服4-O-甲基厚朴酚可剂量依赖性地改善LPS诱导的记忆障碍。此外，4-O-甲基厚朴酚可抑制LPS诱导的炎症蛋白表达，包括诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和环氧合酶-2（COX-2），以及脑内星形胶质细胞的活化（胶质纤维酸性蛋白；GFAP的表达）。体外研究也发现，4-O-甲基厚朴酚可抑制LPS刺激的培养星形胶质细胞中iNOS和COX-2的表达，以及活性氧、一氧化氮、前列腺素E2、肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-1β的产生。4-O-甲基厚朴酚还通过抑制IκB的降解以及p50和p65向脑组织和培养星形胶质细胞核的转位，抑制NF-κB的转录活性和DNA结合活性。与抑制神经炎症的作用一致，4-O-甲基厚朴酚抑制了LPS诱导的Aβ1-42生成、β-和γ-分泌酶活性以及淀粉样前体蛋白（APP）、BACE1和C99的表达，并抑制了脑组织、培养的星形胶质细胞和BV-2小胶质细胞中星形胶质细胞的活化和神经元细胞死亡。
结论：这些结果表明，4-O-甲基厚朴酚通过抗炎机制抑制LPS诱导的淀粉样蛋白生成。因此，4-O-甲基厚朴酚可能是一种对抗神经炎症相关疾病或阿尔茨海默病进展的有效药物。[2]

C19H20O2

280.3609

280.146

C, 81.40; H, 7.19; O, 11.41

68592-15-4

155160

Orange to red viscous liquid

1.054g/cm3

396.5ºC at 760 mmHg

176.2ºC

1.569

4.524

29.46

1

2

6

21

339

0

O(C([H])([H])[H])C1C([H])=C([H])C(=C([H])C=1C([H])([H])C([H])=C([H])[H])C1=C(C([H])=C([H])C(C([H])([H])C([H])=C([H])[H])=C1[H])O[H]

OQFHJKZVOALSPV-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C19H20O2/c1-4-6-14-8-10-18(20)17(12-14)15-9-11-19(21-3)16(13-15)7-5-2/h4-5,8-13,20H,1-2,6-7H2,3H3

2-(4-methoxy-3-prop-2-enylphenyl)-4-prop-2-enylphenol

4-O-Methylhonokiol; 68592-15-4; 4-O-Methyl honokiol; METHYLHONOKIOL; 4-methoxyhonokiol;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~100 mg/mL (~356.68 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (8.92 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

---

配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (8.92 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

---

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。