4'-O-Methylresveratrol   中文名称: 白藜芦醇-4'-甲醚

NLRP3; NF-κB
RAGE (receptor for advanced glycation end products); MAPK pathway components including p38, JNK, and ERK1/2; NF-κB p65; NLRP3 inflammasome [1]

晚期糖基化终产物（AGEs）可与AGE受体（RAGE）相互作用，作为一种无菌危险信号诱导炎症。4′-甲氧基白藜芦醇（4′MR）是一种源自龙脑香科的多酚，其抗炎作用尚未得到研究。本研究旨在利用RAW264.7巨噬细胞，探讨4′MR在AGEs诱导的炎症模型中的保护作用。结果表明，4′MR显著抑制了多种促炎细胞因子和趋化因子（如白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1））以及两种典型的促炎酶（诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和环氧合酶2（COX2））的基因表达。此外，4′MR显著降低了氧化应激水平，表现为ROS生成、蛋白羰基和高级氧化蛋白产物水平的降低，其机制是通过下调NADPH氧化酶。进一步分析表明，4′MR减弱了MGO-BSA诱导的RAGE过表达。它还阻断了AGE-RAGE的下游信号通路，特别是包括p38和JNK在内的MAPK信号通路，进而降低了NF-κB的激活。此外，4′MR显著抑制了NOD样受体pyrin结构域蛋白3（NLRP3）炎症小体的激活，包括NLRP3和切割型caspase-1，并减少了成熟IL-1β的分泌。综上所述，我们的研究结果表明，4′MR的抗炎作用主要通过抑制RAGE介导的MAPK/NF-κB信号通路和NLRP3炎症小体的激活来实现。 4′MR 可能是一种治疗炎症相关疾病的新型药物。[1]

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在 10 μM 浓度下，4′-甲氧基白藜芦醇显著抑制了 200 μg/mL MGO-BSA 处理 RAW264.7 巨噬细胞 24 小时后，AGEs（200 μg/mL MGO-BSA）诱导的促炎细胞因子和趋化因子（IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1）以及促炎酶（iNOS 和 COX-2）的 mRNA 表达。[1]
- 该化合物在 24 小时后使 AGEs 处理细胞上清液中的一氧化氮 (NO) 水平降低了约 2.04 倍 (p < 0.05) [1]
- 10 μM 的 4′-甲氧基白藜芦醇使活性氧 (ROS) 的产生降低了约 43% (p < 0.05)与 AGEs 处理组相比，4'-甲氧基白藜芦醇 (10 μM) 在 24 小时时可显著降低 RAGE 的 mRNA 和蛋白水平，降低幅度分别为 0.05、32% (p < 0.001) 和 15% (p < 0.05) [1]。
- 该化合物在 24 小时时可分别下调 NADPH 氧化酶亚基 NOX1 和 NOX2 的 mRNA 表达约 35.4% (p < 0.05) 和 25.8% (p < 0.05) [1]。
- 4'-甲氧基白藜芦醇 (10 μM) 在 24 小时时可减弱 AGE 诱导的 RAGE 的 mRNA 和蛋白水平的过表达 (p < 0.05) [1]。
- 处理 45 分钟后，该化合物可显著抑制 AGE 诱导的 p38 MAPK (p < 0.05) 和 JNK (p < 0.05) 的磷酸化。 0.05），以及 NF-κB p65 (p < 0.05)，但不影响 ERK1/2 磷酸化 [1]
- 4'-甲氧基白藜芦醇 (10 μM，24 小时) 使 AGE 诱导的 NLRP3 蛋白水平降低约 1.85 倍，使 caspase-1 裂解水平降低约 2.04 倍 (p < 0.05) [1]
- 该化合物在 24 小时时减弱了 AGE 诱导的培养上清液中成熟 IL-1β 的分泌，ELISA 检测结果为 [1]

细胞内活性氧（ROS）生成测定[1]
4'-O-甲基白藜芦醇对ROS生成的影响采用我们之前研究的方法进行测定。为定量细胞内ROS水平，将RAW264.7巨噬细胞接种于96孔板中培养24小时，然后用200 µg/mL BSA或MB刺激，并加入或不加入10 µM的4'-O-甲基白藜芦醇，继续培养24小时。培养结束后，吸出上清液，用温PBS洗涤细胞两次。然后将细胞在含有25 µM 2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）的DF10培养基中于37℃孵育1小时。之后，用温PBS洗涤细胞两次。最后，在每个孔中加入200 µL HBSS后，使用微孔板读数仪测定DCFH-DA激活细胞的荧光强度，激发波长为528 nm，发射波长为485 nm。结果以非糖基化BSA的百分比表示。

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蛋白质羰基和AOPP水平测定[1]
用200 µg/mL BSA或MB处理细胞24小时后（有或无10 µM 4'-O-甲基白藜芦醇），使用匀浆器制备细胞培养物裂解液。使用BCA蛋白测定试剂盒测定总蛋白浓度。蛋白质羰基含量以每毫克总蛋白的nmol数表示，使用蛋白质羰基测定试剂盒，并按照制造商的说明进行测定。高级氧化蛋白产物（AOPP）的含量测定方法如我们之前的研究所述。简而言之，使用浓度分别为 0、10、20、40、80 和 100 µmol/L 的氯胺 T 绘制标准曲线，并使用 300 µL 蛋白裂解液进行样品检测。向含有氯胺 T 或样品的试管中加入 75 µL 1.16 M KI 和 150 µL 乙酸作为反应物。随后，立即使用酶标仪在 340 nm 波长处测量其吸光度。AOPP 的含量以氯胺 T 为基准进行计算，结果以每毫克总蛋白中氯胺 T 当量的纳摩尔数表示。

RNA 分离和 qPCR 分析[1]
将 RAW264.7 巨噬细胞（10⁶ 个细胞/孔）培养于添加 200 µg/mL BSA 或 MB 的 DF10 培养基中，并分别添加或不添加 10 µM 4'-O-甲基白藜芦醇，培养 24 小时。采用标准 TRIzol 法，按照制造商说明书提取总 RNA。使用分光光度计测定提取的 RNA 浓度。使用 PrimeScript RT 试剂盒，按照制造商说明书进行逆转录，合成 cDNA。使用 QuantiFast SYBR-Green RT-PCR 试剂盒进行目标基因的实时定量 PCR。以 18S rRNA 表达作为内参。所用正向和反向引物序列见附录 A（表 A1）。使用 LightCycler 96 qPCR 仪，采用 ΔCT 法分析结果。

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NO 和 IL-1β 水平的测定[1]
将 RAW264.7 巨噬细胞（10⁶ 个细胞/孔）在添加了 200 µg/mL BSA 或 MB 的 DF10 培养基中培养 24 小时，培养基中添加或不添加 10 µM 4'-O-甲基白藜芦醇，收集上清液用于测定一氧化氮 (NO) 和白细胞介素 1β (IL-1β) 的含量。NO 和 IL-1β 的水平采用小鼠 NO 和 IL-1β ELISA 试剂盒，并按照制造商的说明进行测定。

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蛋白质提取和Western Blot分析[1]
将RAW264.7巨噬细胞（10⁶个细胞/孔）接种于六孔板中，饥饿培养4小时后，在添加200 µg/mL BSA或MB的DF10培养基中培养45分钟，培养基中添加或不添加10 µM 4'-O-甲基白藜芦醇。然后，用预冷的PBS洗涤细胞两次，并在冰上用200 µL RIPA裂解缓冲液裂解细胞15分钟。将裂解液转移至2 mL离心管中，离心（12,000×g，10分钟，4℃）收集上清液。使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。每孔上样30 µg蛋白进行SDS-PAGE电泳，并将蛋白转移至PVDF膜上。将膜在室温下用5%脱脂牛奶封闭1小时，然后在4℃下与一抗（ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK、p38 MAPK、p-p38 MAPK、p65、p-p65、NLRP3和cleaved caspase-1的稀释度为1:1000；RAGE和β-actin的稀释度为1:3000）孵育过夜，期间轻柔摇晃。用PBST洗涤3次，每次5分钟后，将PVDF膜在室温下与HRP标记的二抗（1:1000）孵育30分钟。最后，使用增强化学发光（ECL）试剂显色，并用ChemiDoc® MP Image Lab成像系统检测免疫反应条带。使用图像实验室软件对条带密度进行定量分析。

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细胞培养：小鼠 RAW264.7 巨噬细胞在添加 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素的 DMEM 培养基中，于 37°C、5% CO2 气氛下培养。4'-甲氧基白藜芦醇浓度低于 30 μM 时未观察到明显的细胞毒性作用，因此所有实验均使用 10 μM 的浓度 [1]
- AGEs 的制备：将 10 mg/mL 无内毒素的牛血清白蛋白 (BSA) 与 55 mM 甲基乙二醛在 37°C 下孵育 6 天，然后在 4°C 下用 PBS 透析 2 天，最后用 0.22 μm 滤膜过滤，制备甲基乙二醛修饰的牛血清白蛋白 (MGO-BSA)。 MGO-BSA 的荧光强度比 BSA 高 70 倍（激发波长 370 nm，发射波长 440 nm）[1]
- ROS 测定：将细胞用 200 μg/mL BSA 或 MGO-BSA 处理 24 小时，处理过程中加入或不加入 10 μM 4'-甲氧基白藜芦醇，然后在 37°C 下用 25 μM DCFH-DA 培养基孵育 1 小时。使用酶标仪在激发波长 485 nm 和发射波长 528 nm 处测量荧光强度。结果以未糖基化 BSA 对照组的百分比表示[1]
- 蛋白质羰基和 AOPP 测定：处理 24 小时后制备细胞裂解液。采用 BCA 法测定总蛋白浓度。使用商业试剂盒测定蛋白质羰基水平。 AOPP水平采用化学方法测定：将300 μL蛋白裂解液与75 μL 1.16 M KI和150 μL乙酸混合，立即在340 nm处测定吸光度。以氯胺T（0-100 μmol/L）为标准品。结果以每毫克总蛋白中氯胺T当量（nmol）表示[1]
- RNA提取和qPCR：处理24小时后，采用TRIzol法提取总RNA。使用逆转录试剂盒合成cDNA。使用SYBR Green试剂盒进行实时PCR，以18S rRNA作为内参。TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1、COX-2、iNOS、NOX1、NOX2、RAGE和18S rRNA的引物序列已提供。采用ΔCT法进行分析[1]
- NO和IL-1β测定：处理24小时后，收集培养上清液。根据制造商说明，使用小鼠特异性ELISA试剂盒测定NO和IL-1β水平[1]
- 蛋白提取和Western blot：细胞饥饿4小时后，分别处理45分钟（用于MAPK/NF-κB）或24小时（用于RAGE、NLRP3、cleaved caspase-1）。用RIPA缓冲液在冰上裂解细胞15分钟，然后在4℃下以12,000×g离心10分钟。采用BCA法测定蛋白浓度。每泳道上样 30 μg 蛋白，经 SDS-PAGE 电泳分离后转移至 PVDF 膜，用 5% 脱脂奶粉封闭，与一抗（ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK、p38 MAPK、p-p38 MAPK、p65、p-p65、NLRP3、cleaved caspase-1，稀释度 1:1000；RAGE 和 β-actin，稀释度 1:3000）于 4°C 孵育过夜，然后与 HRP 标记的二抗（稀释度 1:1000）于室温孵育 30 分钟。采用增强化学发光法显色，并使用成像软件进行定量分析 [1]

[1]. 4'-Methoxyresveratrol Alleviated AGE-Induced Inflammation via RAGE-Mediated NF-κB and NLRP3 Inflammasome Pathway. Molecules. 2018 Jun 14;23(6).

5-[2-(4-甲氧基苯基)乙烯基]苯-1,3-二醇是一种芪类化合物。(E)-5-(4-甲氧基苯乙烯基)苯-1,3-二醇已在生姜、龙血树以及其他有相关数据的生物体中被报道。

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4'-甲氧基白藜芦醇（3,5-二羟基-4'-甲氧基芪）是一种源自龙脑香科和买麻藤科植物的植物芪类化合物。此前已有报道称，4'-甲氧基白藜芦醇在前列腺癌细胞中具有抗雄激素活性，并在体外具有抗真菌活性，但此前尚无关于其抗炎作用的报道[1]。
- 4'-甲氧基白藜芦醇的抗炎机制主要通过抑制RAGE介导的MAPK/NF-κB信号通路（涉及p38和JNK，但不涉及ERK）以及NLRP3炎症小体的激活，从而降低氧化应激和促炎基因的表达。该化合物还部分通过下调RAGE及其后续的NOX表达来减少ROS的产生[1]。
- 由于芪类结构上的甲氧基，该化合物可能比白藜芦醇具有更高的生物利用度和抗氧化能力[1]。

C15H14O3

242.26986

242.094

C, 74.36; H, 5.82; O, 19.81

33626-08-3

33626-08-3

6255462

White to off-white solid powder

1.252

446.5±14.0 °C at 760 mmHg

223.8±20.1 °C

0.0±1.1 mmHg at 25°C

1.692

3.62

49.69

2

3

3

18

259

0

COC1=CC=C(C=C1)C=CC1=CC(O)=CC(O)=C1

IHVRWFJGOIWMGC-NSCUHMNNSA-N

InChI=1S/C15H14O3/c1-18-15-6-4-11(5-7-15)2-3-12-8-13(16)10-14(17)9-12/h2-10,16-17H,1H3/b3-2+

5-[(E)-2-(4-methoxyphenyl)ethenyl]benzene-1,3-diol

4'-O-Methylresveratrol; 33626-08-3; (E)-5-(4-Methoxystyryl)benzene-1,3-diol; Desoxyrhapontigenin; RESVERATROL 4'-METHYL ETHER; 4'O-Methylresveratrol; 4-Methoxyresveratrol; Deoxyrhapontigenin; 3,5-Dihydroxy-4'-methoxystilbene;

2934.99.03.00

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 本产品在运输和储存过程中需避光。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: 48~50 mg/mL (198.1~206.4 mM)
Ethanol: ~48 mg/mL (~198.1 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (10.32 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (10.32 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。