5,6-Dichlorobenzimidazole riboside   中文名称: 5,6-二氯苯并咪唑核糖甙

Carboxyl-terminal domain kinases, such as casein kinase II and cell cycle-dependent kinases (CDK)

在人结肠癌细胞中，5,6-二氯苯并咪唑核苷（10-80 μg/ml，72 小时）抑制 RNA 合成，导致 p53 依赖性死亡 [5]。通过调节 Mcl-1 和 BclxL，5,6-二氯苯并咪唑核苷（10-100 μM，72 小时）促进人 MCF-7 乳腺癌细胞凋亡。并对 caspase 家族成员进行剂量和时间依赖性激活 [6]。

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腺苷类似物5,6-二氯-1-β-D-呋喃核糖基苯并咪唑（DRB）是体内和体外RNA聚合酶II转录的特异性抑制剂[Tamm+Sehgal（1978）Adv.Virus Res.22187-258；Zandomeni&Weinmann（1984）J.Biol.Chem.25914804-14811]。对RNA聚合酶II特异性转录的影响似乎是通过其对核酪蛋白激酶II的抑制来介导的[Zandomeni，Carrera Zandomini，Shugar&Weinmann（1986）J.Biol.Chem.2613414-3419]。抑制研究表明，DRB对酪蛋白是一种混合型抑制剂，对核苷酸磷酸供体底物是一种竞争性抑制剂。就ATP和GTP而言，小牛胸腺酪蛋白激酶II的DRB抑制常数为7微M[1]

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RNA聚合酶II对链延长的调节可以对基因表达产生重要影响（Bentley，D.（1995）Curr。Opin。基因。第5210-216页；Yankulov，K.、Blau，J.、Purton，T.、Roberts，S.和Bentley，D.（1994）《细胞》77749-759）；然而，控制转录中这一步骤的机制尚不清楚。腺苷类似物5,6-二氯-1-β-D-呋喃核糖基苯并咪唑（DRB）长期以来一直被用作RNA聚合酶II延长的抑制剂，但其靶标尚不清楚。我们发现DRB是一种与一般转录因子TFIIH相关的Cdk活化激酶的强效抑制剂。该激酶的另外两种抑制剂H-7和H-8也抑制了转录延长。此外，TFIIH激酶特异性结合到单纯疱疹病毒VP16激活结构域，除了启动外，还刺激聚合酶II的延长（Yankulov，K.，Blau，J.，Purton，T.，Roberts，S.和Bentley，D.（1994）Cell 77749-759）。我们的研究结果表明，DRB通过抑制TFIIH相关激酶来影响转录，并且该激酶在RNA聚合酶II的伸长控制中起作用。[2]

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大多数现代人类癌症的化疗和放疗都使用DNA损伤途径，该途径诱导p53反应，导致G1期阻滞或细胞凋亡。然而，这种治疗可能会诱导突变和易位，导致继发性恶性肿瘤或复发性疾病，由于对治疗的耐药性，这些疾病的预后往往较差。在这里，我们报告了5,6-二氯-1-β-D-呋喃核糖基苯并咪唑（DRB），一种CDK7 TFIIH相关激酶、CKI和CKII激酶的抑制剂，在早期伸长阶段阻断RNA聚合酶II，以转录非依赖的方式触发人结肠腺癌细胞中p53依赖性凋亡。DRB在不使用DNA损伤的情况下杀死肿瘤衍生细胞的事实，为开发一种新的替代化疗方法来治疗表达野生型p53的肿瘤提供了可能性，从而降低了与治疗相关的继发性恶性肿瘤的风险。[5]

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癌症的有效治疗仍然是一个深刻的临床挑战，特别是由于许多患者不幸出现耐药性和转移。转录抑制剂5,6-二氯-1-β-D-呋喃核糖基苯并咪唑（DRB）作为细胞周期蛋白依赖性激酶9的选择性抑制剂，已被证明能有效诱导各种造血恶性肿瘤的细胞凋亡。然而，DRB对乳腺癌症的抗癌效果尚不清楚。在此，我们证明对癌症细胞系施用DRB可抑制细胞增殖并诱导凋亡细胞的典型迹象，包括膜联蛋白V阳性细胞的增加、DNA断裂以及胱天蛋白酶-7、胱天蛋白酶-9和聚ADP核糖聚合酶（PARP）的激活。DRB治疗导致髓细胞白血病1（Mcl-1）蛋白迅速下降，而其他抗凋亡蛋白的水平没有变化。Mcl-1的过表达降低了DRB诱导的PARP切割，而敲除Mcl-1增强了DRB对PARP激活的影响，表明Mcl-1缺失是DRB介导的MCF-7细胞凋亡的原因，但在T-47D中没有。此外，我们发现用AKT抑制剂（LY294002）或蛋白酶体抑制剂（MG-132）共同处理MCF-7细胞显著增强了DRB诱导的凋亡。这些数据表明，DRB与LY294002或MG-132联合使用可能对乳腺癌症细胞具有更大的治疗效力[6]。

蛋白激酶测定[2]
20μl反应包含50 mM KCl、20 mM Tris-HCl、pH 8.0、7 mM MgCl2、2 mM DTT、5 mM 2-甘油磷酸、1μM微囊藻毒素、3.3μg/ml EcoRI线性化pAdH3 DNA、100μg/ml牛血清白蛋白、7.5μM ATP、4μCi的[g32P]ATP、1μg/ml降氨酸、1μg/ml亮肽、1μg/ml胃蛋白酶抑制剂和100 ng VP16亲和柱级分5（图2A除外）或0.1μl纯化的TFIIH（BTF2）HAP级分（Gerard等人，1991）。pAdH3含有腺病毒2的2.1-k激酶SmaI-HindIII片段，包括主要的晚期启动子。底物浓度如下：GST-CTD为40μg/ml，TFIIF为45μg/ml，以及TFIIE为60μg/ml。在这些重组底物中未检测到激酶活性。样品在30°C下用5μM未标记的ATP（和抑制剂，如有指示）预孵育30分钟，然后加入底物和[g-32P]ATP。在30°C下孵育1小时。在这些条件下，激酶反应在3小时以上呈线性。通过加入5μl 5×SDS负载缓冲液终止反应。通过磷光成像仪对固定的干燥凝胶进行定量。 先前描述了从爪蟾卵中免疫沉淀的CAK的蛋白激酶测定（Poon等人，1994）。激酶反应分别与50μg/ml的GST-CTD或GST-Cdk2（K33R）反应。

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蛋白激酶底物[2]
免疫亲和纯化的小牛胸腺pol II（Thompson等人，1990）是J.Greenblatt的礼物。含有小鼠CTD的所有52个七肽重复的GST-CTD由pGCTD（Peterson等人，1992）或其衍生物pET21a-GCTD生产。TFIIE p34和p56由R.Tjian博士提供的载体产生。通过将编码His6标签的寡核苷酸插入NdeI位点来修饰p34表达载体。在Ni2+琼脂糖上纯化之前，通过在冰上混合含有两个亚基的细菌细胞裂解物20分钟来分离p56-His6-p34复合物。TFIIF（rap74-rap30）由Z.Burton博士提供的载体表达。通过在NcoI位点插入His6标签来修饰rap74载体，并分离出针对TFIIE的His6-rap74-rap30复合物。激酶缺陷型Cdk2底物GST-Cdk2（K33R）之前已有描述（Poon等人，1994）。 ATP酶测定 ATP酶测定在蛋白激酶反应条件下进行。将0.2μl TFIIH HAP组分、300 ng VP16组分5或5μg HeLa核提取物在30°C下孵育2小时。在这些条件下，ATP酶反应在3小时以上呈线性。通过在7 mM H3P04中加入0.8 ml冰冷的5%活性炭（Sigma）终止反应。将混合物离心，通过计数上清液的等分试样来测量释放的无机磷酸盐。

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体外转录[2]
已经描述了RNA酶保护、重组GAL4-AH和GAL4-VP16以及质粒pSPVA（腺病毒VA1）和pGal5-HIV2-CAT的纯化（Yankulov等人，1994）。转录反应（20μl）包含250ng超螺旋质粒pGal5-HIV2-CAT和pSPVA、80μg HeLa核提取物（Dignam等人，1983）、100ng GAL4-AH或GAL4-VP16、1mM MgCl2、1mM亚精胺、4%聚乙二醇8000、0.5mM NTPs、50mM KCl、12mM Hepes、pH 7.9、10μM ZnCl2、2mM DTT、20mM磷酸肌酸、0.01%Nonidet P-40、15单位RNAguard（Pharmacia）。反应在30°C下孵育1小时，通过加入α-鹅膏蕈碱（5μg/ml）、1 mM CaCl2和2μl RQ-DNase I（Promega）停止。在30°C下10分钟后，加入SDS（0.4%）和蛋白酶K（400μg/ml），在37°C下孵育10分钟。使用HIV2和VA的反义探针对反应进行RNase保护处理（Yankulov等人，1994）。

蛋白质印迹分析[5]
细胞类型： LS174T、HT29、SW48
测试浓度： 80 μg/ml
孵育时间： 24 小时
实验结果： [5,6-3H] 尿苷掺入减少，p53 蛋白水平增加。

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细胞活力测定[6]
细胞类型： MCF-7、T-47D
测试浓度： 10、50、75,100 μM
孵育时间： 72 小时
实验结果： 以剂量依赖性方式抑制细胞生长。在浓度为 75 μM 时，导致较高的早期凋亡群体（5.7 ± 1.1 vs. 2 ± 0.4%）和晚期凋亡群体（15.9 ± 2.4 vs. 7.7 ± 0.9%）。

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蛋白质印迹分析[6]
细胞类型： MCF-7
测试浓度： 75 μM
孵育持续时间：0.5、2、6、10小时
实验结果：以时间依赖性方式降低Mcl-1蛋白水平，并在6小时后增加p53水平。

[1]. Zandomeni RO. Kinetics of inhibition by 5,6-dichloro-1-beta-D-ribofuranosylbenzimidazole on calf thymus casein kinase II. Biochem J. 1989 Sep 1;262(2):469-73.

[2]. The transcriptional elongation inhibitor 5,6-dichloro-1-beta-D-ribofuranosylbenzimidazole inhibits transcription factor IIH-associated protein kinase. J Biol Chem. 1995 Oct 13;270(41):23922-5.

[3]. Cyclin C/CDK8 and cyclin H/CDK7/p36 are biochemically distinct CTD kinases. Oncogene. 1999 Jan 28;18(4):1093-102.

[4]. Schang LM. Cyclin-dependent kinases as cellular targets for antiviral drugs. J Antimicrob Chemother. 2002 Dec;50(6):779-92.

[5]. RNA synthesis block by 5, 6-dichloro-1-beta-D-ribofuranosylbenzimidazole (DRB) triggers p53-dependent apoptosis in human colon carcinoma cells. Oncogene. 1999 Oct 14;18(42):5765-72.

[6]. 5,6-Dichloro-1-β-D-ribofuranosylbenzimidazole (DRB) induces apoptosis in breast cancer cells through inhibiting of Mcl-1 expression. Sci Rep. 2023 Aug 3;13(1):12621.

[7]. Synthesis and biological properties of certain 5, 6-dichlorobenzimidazole ribosides. Journal of the American Chemical Society, 1957, 79(5): 1185-1188.

RNA聚合酶II转录抑制剂。该化合物通过选择性抑制RNA合成，使转录提前终止。它被用于研究细胞调控的潜在机制。

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FIIH激酶在体外可磷酸化RNA聚合酶II的C端结构域（CTD）、TATA结合蛋白以及TFIIF和TFIIE的大亚基（Ohkuma和Roeder，1994；图2B）。这些磷酸化对转录延伸的相对重要性尚未确定。已知延伸因子TFIIF的修饰可能通过稳定其与不稳定的RNA聚合酶II的相互作用来促进转录的持续性（Price等，1989）。 CTD在延伸过程中发挥作用的推测可由以下观察结果得出：RNA聚合酶II在进入起始前复合物以及起始后不久暂停时处于低磷酸化状态，而活跃延伸状态下则处于高磷酸化状态（Lu et al., 1991; O'Brien et al., 1994; Payne et al., 1989; Weeks et al., 1993）。因此，CTD磷酸化的时机似乎与5,6-二氯-1-β-D-呋喃核糖基苯并咪唑（DRB）发挥作用的时间相吻合，即在起始过程中或起始后立即发生（Cisek and Corden, 1989; Kephart et al., 1992）。此外，5,6-二氯-1-β-D-呋喃核糖基苯并咪唑 (DRB) 在体内抑制 CTD 磷酸化（Dubois 等，1994a，1994b）。这些数据与 TFIIH 对 CTD 的磷酸化是 5,6-二氯-1-β-D-呋喃核糖基苯并咪唑 (DRB) 敏感的修饰这一观点相符（Marshall 和 Price，1992；Roberts 和 Bentley，1992；Bentley，1995），该修饰可刺激 pol II 的延伸。[2]

C12H12N2O4CL2

319.14068

318.017

53-85-0

5894

White to off-white solid powder

1.8±0.1 g/cm3

606.2±65.0 °C at 760 mmHg

222-224ºC

320.4±34.3 °C

0.0±1.8 mmHg at 25°C

1.750

2.05

87.74

3

5

2

20

364

4

C1=C2C(=CC(=C1Cl)Cl)N(C=N2)[C@H]3[C@@H]([C@@H]([C@H](O3)CO)O)O

XHSQDZXAVJRBMX-DDHJBXDOSA-N

InChI=1S/C12H12Cl2N2O4/c13-5-1-7-8(2-6(5)14)16(4-15-7)12-11(19)10(18)9(3-17)20-12/h1-2,4,9-12,17-19H,3H2/t9-,10-,11-,12-/m1/s1

(2R,3R,4S,5R)-2-(5,6-dichlorobenzimidazol-1-yl)-5-(hydroxymethyl)oxolane-3,4-diol

53-85-0; 5,6-Dichlorobenzimidazole riboside; DRB; Dichlororibofuranosylbenzimidazole; NSC 401575; 5,6-Dichloro-1-beta-D-ribofuranosylbenzimidazole; MFCD00036785; 5,6-Dichloro-1-Beta-D-Ribofuranosyl-1h-Benzimidazole;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~100 mg/mL (~313.34 mM)
DMF : 100 mg/mL (~313.34 mM)
Ethanol : ~7.69 mg/mL (~24.10 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.83 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.83 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.83 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。