5,6-Dichlorobenzimidazole riboside   中文名称: 5,6-二氯苯并咪唑核糖甙

Carboxyl-terminal domain kinases, such as casein kinase II and cell cycle-dependent kinases (CDK)

在人结肠癌细胞中，5,6-二氯苯并咪唑核苷（10-80 μg/ml，72 小时）抑制 RNA 合成，导致 p53 依赖性死亡 [5]。通过调节 Mcl-1 和 BclxL，5,6-二氯苯并咪唑核苷（10-100 μM，72 小时）促进人 MCF-7 乳腺癌细胞凋亡。并对 caspase 家族成员进行剂量和时间依赖性激活 [6]。

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腺苷类似物5,6-二氯-1-β-D-呋喃核糖基苯并咪唑（DRB）是体内和体外RNA聚合酶II转录的特异性抑制剂[Tamm+Sehgal（1978）Adv.Virus Res.22187-258；Zandomeni&Weinmann（1984）J.Biol.Chem.25914804-14811]。对RNA聚合酶II特异性转录的影响似乎是通过其对核酪蛋白激酶II的抑制来介导的[Zandomeni，Carrera Zandomini，Shugar&Weinmann（1986）J.Biol.Chem.2613414-3419]。抑制研究表明，DRB对酪蛋白是一种混合型抑制剂，对核苷酸磷酸供体底物是一种竞争性抑制剂。就ATP和GTP而言，小牛胸腺酪蛋白激酶II的DRB抑制常数为7微M[1]

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RNA聚合酶II对链延长的调节可以对基因表达产生重要影响（Bentley，D.（1995）Curr。Opin。基因。第5210-216页；Yankulov，K.、Blau，J.、Purton，T.、Roberts，S.和Bentley，D.（1994）《细胞》77749-759）；然而，控制转录中这一步骤的机制尚不清楚。腺苷类似物5,6-二氯-1-β-D-呋喃核糖基苯并咪唑（DRB）长期以来一直被用作RNA聚合酶II延长的抑制剂，但其靶标尚不清楚。我们发现DRB是一种与一般转录因子TFIIH相关的Cdk活化激酶的强效抑制剂。该激酶的另外两种抑制剂H-7和H-8也抑制了转录延长。此外，TFIIH激酶特异性结合到单纯疱疹病毒VP16激活结构域，除了启动外，还刺激聚合酶II的延长（Yankulov，K.，Blau，J.，Purton，T.，Roberts，S.和Bentley，D.（1994）Cell 77749-759）。我们的研究结果表明，DRB通过抑制TFIIH相关激酶来影响转录，并且该激酶在RNA聚合酶II的伸长控制中起作用。[2]

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大多数现代人类癌症的化疗和放疗都使用DNA损伤途径，该途径诱导p53反应，导致G1期阻滞或细胞凋亡。然而，这种治疗可能会诱导突变和易位，导致继发性恶性肿瘤或复发性疾病，由于对治疗的耐药性，这些疾病的预后往往较差。在这里，我们报告了5,6-二氯-1-β-D-呋喃核糖基苯并咪唑（DRB），一种CDK7 TFIIH相关激酶、CKI和CKII激酶的抑制剂，在早期伸长阶段阻断RNA聚合酶II，以转录非依赖的方式触发人结肠腺癌细胞中p53依赖性凋亡。DRB在不使用DNA损伤的情况下杀死肿瘤衍生细胞的事实，为开发一种新的替代化疗方法来治疗表达野生型p53的肿瘤提供了可能性，从而降低了与治疗相关的继发性恶性肿瘤的风险。[5]

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癌症的有效治疗仍然是一个深刻的临床挑战，特别是由于许多患者不幸出现耐药性和转移。转录抑制剂5,6-二氯-1-β-D-呋喃核糖基苯并咪唑（DRB）作为细胞周期蛋白依赖性激酶9的选择性抑制剂，已被证明能有效诱导各种造血恶性肿瘤的细胞凋亡。然而，DRB对乳腺癌症的抗癌效果尚不清楚。在此，我们证明对癌症细胞系施用DRB可抑制细胞增殖并诱导凋亡细胞的典型迹象，包括膜联蛋白V阳性细胞的增加、DNA断裂以及胱天蛋白酶-7、胱天蛋白酶-9和聚ADP核糖聚合酶（PARP）的激活。DRB治疗导致髓细胞白血病1（Mcl-1）蛋白迅速下降，而其他抗凋亡蛋白的水平没有变化。Mcl-1的过表达降低了DRB诱导的PARP切割，而敲除Mcl-1增强了DRB对PARP激活的影响，表明Mcl-1缺失是DRB介导的MCF-7细胞凋亡的原因，但在T-47D中没有。此外，我们发现用AKT抑制剂（LY294002）或蛋白酶体抑制剂（MG-132）共同处理MCF-7细胞显著增强了DRB诱导的凋亡。这些数据表明，DRB与LY294002或MG-132联合使用可能对乳腺癌症细胞具有更大的治疗效力[6]。

蛋白激酶测定[2]
20μl反应包含50 mM KCl、20 mM Tris-HCl、pH 8.0、7 mM MgCl2、2 mM DTT、5 mM 2-甘油磷酸、1μM微囊藻毒素、3.3μg/ml EcoRI线性化pAdH3 DNA、100μg/ml牛血清白蛋白、7.5μM ATP、4μCi的[g32P]ATP、1μg/ml降氨酸、1μg/ml亮肽、1μg/ml胃蛋白酶抑制剂和100 ng VP16亲和柱级分5（图2A除外）或0.1μl纯化的TFIIH（BTF2）HAP级分（Gerard等人，1991）。pAdH3含有腺病毒2的2.1-k激酶SmaI-HindIII片段，包括主要的晚期启动子。底物浓度如下：GST-CTD为40μg/ml，TFIIF为45μg/ml，以及TFIIE为60μg/ml。在这些重组底物中未检测到激酶活性。样品在30°C下用5μM未标记的ATP（和抑制剂，如有指示）预孵育30分钟，然后加入底物和[g-32P]ATP。在30°C下孵育1小时。在这些条件下，激酶反应在3小时以上呈线性。通过加入5μl 5×SDS负载缓冲液终止反应。通过磷光成像仪对固定的干燥凝胶进行定量。 先前描述了从爪蟾卵中免疫沉淀的CAK的蛋白激酶测定（Poon等人，1994）。激酶反应分别与50μg/ml的GST-CTD或GST-Cdk2（K33R）反应。

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蛋白激酶底物[2]
免疫亲和纯化的小牛胸腺pol II（Thompson等人，1990）是J.Greenblatt的礼物。含有小鼠CTD的所有52个七肽重复的GST-CTD由pGCTD（Peterson等人，1992）或其衍生物pET21a-GCTD生产。TFIIE p34和p56由R.Tjian博士提供的载体产生。通过将编码His6标签的寡核苷酸插入NdeI位点来修饰p34表达载体。在Ni2+琼脂糖上纯化之前，通过在冰上混合含有两个亚基的细菌细胞裂解物20分钟来分离p56-His6-p34复合物。TFIIF（rap74-rap30）由Z.Burton博士提供的载体表达。通过在NcoI位点插入His6标签来修饰rap74载体，并分离出针对TFIIE的His6-rap74-rap30复合物。激酶缺陷型Cdk2底物GST-Cdk2（K33R）之前已有描述（Poon等人，1994）。 ATP酶测定 ATP酶测定在蛋白激酶反应条件下进行。将0.2μl TFIIH HAP组分、300 ng VP16组分5或5μg HeLa核提取物在30°C下孵育2小时。在这些条件下，ATP酶反应在3小时以上呈线性。通过在7 mM H3P04中加入0.8 ml冰冷的5%活性炭（Sigma）终止反应。将混合物离心，通过计数上清液的等分试样来测量释放的无机磷酸盐。

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体外转录[2]
已经描述了RNA酶保护、重组GAL4-AH和GAL4-VP16以及质粒pSPVA（腺病毒VA1）和pGal5-HIV2-CAT的纯化（Yankulov等人，1994）。转录反应（20μl）包含250ng超螺旋质粒pGal5-HIV2-CAT和pSPVA、80μg HeLa核提取物（Dignam等人，1983）、100ng GAL4-AH或GAL4-VP16、1mM MgCl2、1mM亚精胺、4%聚乙二醇8000、0.5mM NTPs、50mM KCl、12mM Hepes、pH 7.9、10μM ZnCl2、2mM DTT、20mM磷酸肌酸、0.01%Nonidet P-40、15单位RNAguard（Pharmacia）。反应在30°C下孵育1小时，通过加入α-鹅膏蕈碱（5μg/ml）、1 mM CaCl2和2μl RQ-DNase I（Promega）停止。在30°C下10分钟后，加入SDS（0.4%）和蛋白酶K（400μg/ml），在37°C下孵育10分钟。使用HIV2和VA的反义探针对反应进行RNase保护处理（Yankulov等人，1994）。

蛋白质印迹分析[5]
细胞类型： LS174T、HT29、SW48
测试浓度： 80 μg/ml
孵育时间： 24 小时
实验结果： [5,6-3H] 尿苷掺入减少，p53 蛋白水平增加。

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细胞活力测定[6]
细胞类型： MCF-7、T-47D
测试浓度： 10、50、75,100 μM
孵育时间： 72 小时
实验结果： 以剂量依赖性方式抑制细胞生长。在浓度为 75 μM 时，导致较高的早期凋亡群体（5.7 ± 1.1 vs. 2 ± 0.4%）和晚期凋亡群体（15.9 ± 2.4 vs. 7.7 ± 0.9%）。

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蛋白质印迹分析[6]
细胞类型： MCF-7
测试浓度： 75 μM
孵育持续时间：0.5、2、6、10小时
实验结果：以时间依赖性方式降低Mcl-1蛋白水平，并在6小时后增加p53水平。

[1]. Zandomeni RO. Kinetics of inhibition by 5,6-dichloro-1-beta-D-ribofuranosylbenzimidazole on calf thymus casein kinase II. Biochem J. 1989 Sep 1;262(2):469-73.

[2]. The transcriptional elongation inhibitor 5,6-dichloro-1-beta-D-ribofuranosylbenzimidazole inhibits transcription factor IIH-associated protein kinase. J Biol Chem. 1995 Oct 13;270(41):23922-5.

[3]. Cyclin C/CDK8 and cyclin H/CDK7/p36 are biochemically distinct CTD kinases. Oncogene. 1999 Jan 28;18(4):1093-102.

[4]. Schang LM. Cyclin-dependent kinases as cellular targets for antiviral drugs. J Antimicrob Chemother. 2002 Dec;50(6):779-92.

[5]. RNA synthesis block by 5, 6-dichloro-1-beta-D-ribofuranosylbenzimidazole (DRB) triggers p53-dependent apoptosis in human colon carcinoma cells. Oncogene. 1999 Oct 14;18(42):5765-72.

[6]. 5,6-Dichloro-1-β-D-ribofuranosylbenzimidazole (DRB) induces apoptosis in breast cancer cells through inhibiting of Mcl-1 expression. Sci Rep. 2023 Aug 3;13(1):12621.

[7]. Synthesis and biological properties of certain 5, 6-dichlorobenzimidazole ribosides. Journal of the American Chemical Society, 1957, 79(5): 1185-1188.

An RNA polymerase II transcriptional inhibitor. This compound terminates transcription prematurely by selective inhibition of RNA synthesis. It is used in research to study underlying mechanisms of cellular regulation.

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FIIH kinase phosphorylates pol II CTD, TATA-binding protein, and the large subunits of TFIIF and TFIIE in vitro (Ohkuma and Roeder, 1994; Fig. 2B). The relative importance of these phosphorylations for transcriptional elongation is not established. The modification of a known elongation factor, TFIIF, could stimulate processivity by stabilizing its interaction with pol II which is quite labile (Price et al., 1989). A role for the CTD in elongation is suggested by the observation that pol II is hypophosphorylated when it enters the preinitiation complex and when it pauses shortly after initiation, whereas the actively elongating form is hyperphosphorylated (Lu et al., 1991; O'Brien et al., 1994; Payne et al., 1989; Weeks et al., 1993). The timing of CTD phosphorylation therefore appears to coincide with the time when 5,6-dichloro-1-beta-D-ribofuranosylbenzimidazole (DRB)  is effective, during or immediately following initiation (Cisek and Corden, 1989; Kephart et al., 1992). Furthermore, 5,6-dichloro-1-beta-D-ribofuranosylbenzimidazole (DRB)  inhibits CTD phosphorylation in vivo (Dubois et al., 1994a, 1994b). These data are consistent with the idea that CTD phosphorylation by TFIIH is the 5,6-dichloro-1-beta-D-ribofuranosylbenzimidazole (DRB) -sensitive modification (Marshall and Price, 1992; Roberts and Bentley, 1992; Bentley, 1995), which stimulates elongation by pol II. [2]

C12H12N2O4CL2

319.14068

318.017

53-85-0

5894

White to off-white solid powder

1.8±0.1 g/cm3

606.2±65.0 °C at 760 mmHg

222-224ºC

320.4±34.3 °C

0.0±1.8 mmHg at 25°C

1.750

2.05

87.74

3

5

2

20

364

4

C1=C2C(=CC(=C1Cl)Cl)N(C=N2)[C@H]3[C@@H]([C@@H]([C@H](O3)CO)O)O

XHSQDZXAVJRBMX-DDHJBXDOSA-N

InChI=1S/C12H12Cl2N2O4/c13-5-1-7-8(2-6(5)14)16(4-15-7)12-11(19)10(18)9(3-17)20-12/h1-2,4,9-12,17-19H,3H2/t9-,10-,11-,12-/m1/s1

(2R,3R,4S,5R)-2-(5,6-dichlorobenzimidazol-1-yl)-5-(hydroxymethyl)oxolane-3,4-diol

53-85-0; 5,6-Dichlorobenzimidazole riboside; DRB; Dichlororibofuranosylbenzimidazole; NSC 401575; 5,6-Dichloro-1-beta-D-ribofuranosylbenzimidazole; MFCD00036785; 5,6-Dichloro-1-Beta-D-Ribofuranosyl-1h-Benzimidazole;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~100 mg/mL (~313.34 mM)
DMF : 100 mg/mL (~313.34 mM)
Ethanol : ~7.69 mg/mL (~24.10 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.83 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.83 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.83 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。