Bisindolylmaleimide III   中文名称: 双indolyl马来酰亚胺 III

PKCα

在之前的一篇论文（Saito等人，1998）中，我们报道了PKCα被认为是佛波酯对hGH-BP释放影响的介质，并且PKC特异性抑制剂双吲哚基马来酰亚胺III比IM-9细胞中表达的其他PKC（即PKCδ（IC50=5.7±0.5μM）和μ（IC50=6.0±0.2μM））更特异地抑制PKCα（IC50=0.26±0.05μM）。因此，我们随后研究了双吲哚基马来酰亚胺III对PDBu增强的胞外蛋白磷酸化的影响（图6）。双吲哚基马来酰亚胺III处理可剂量依赖性地抑制PDBu刺激诱导的几种蛋白质的磷酸化。磷酸化条带（42、45、53和83 kDa）的IC50值（n=3）范围为0.23至0.32μM，与PDBu增强双吲哚基马来酰亚胺III释放hGH-BP的IC50值相似（0.33±0.03μM）（Saito等人，1998）。这一发现表明，PDBu激活PKCα对于几种胞外蛋白的磷酸化是必要的，包括42（对应于图5中的43 kDa蛋白）、45、53和83 kDa蛋白以及增强的hGH BP释放[2]。

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双吲哚基马来酰亚胺化合物如GF109203X是蛋白激酶C（PKC）活性的强效抑制剂。尽管双吲哚基马来酰亚胺对PKC不是完全选择性的，并且已知可以抑制其他一些蛋白激酶，但十多年来，这些试剂已被广泛用于研究PKC家族酶在细胞信号转导中的功能作用。在这里，我们建立了一种蛋白质组学方法，以进一步了解这类化合物的细胞效应。合适的双吲哚基马来酰亚胺类似物的功能性固定，结合亲和层析对细胞结合蛋白的特异性纯化，鉴定出了几种已知和以前未知的酶靶点。随后的体外结合和活性测定证实，蛋白激酶Ste20相关激酶和细胞周期蛋白依赖性激酶2（CDK2）以及非蛋白激酶腺苷激酶和醌还原酶2型是双吲哚基马来酰亚胺抑制剂的新靶点。正如CDK2所观察到的那样，通过固定密切相关的双吲哚基马来酰亚胺III、VIII和X，配体的微小化学变化极大地影响了靶结合。这些观察到的亲和力变化与体外CDK2抑制的IC（50）值以及分子对接CDK2晶体结构的结果相关。此外，亲和纯化的条件可以这样调整，即固定化的双吲哚基马来酰亚胺III仅在这些激酶激活后才与PKCα或核糖体S6蛋白激酶1选择性相互作用。因此，我们建立了一种快速鉴定细胞双吲哚基马来酰亚胺靶标的有效技术，并进一步证明了细胞蛋白质组中密切相关的激酶抑制剂的比较选择性分析[1]。

Ecto激酶测定[2]
IM-9细胞（2×106个细胞/ml，1.5 ml）用含有10 mM HEPES–NaOH（pH 7.4）的RPMI 1640洗涤两次，然后悬浮在含有0.6 mM CaCl2、0.6 mM MgCl2和2.5 mM NaF的RPMI1640培养基中。IM-9细胞在37°C下与或不与K-252b或双吲哚基马来酰亚胺III预孵育15分钟。磷酸化反应是通过添加[γ-32P]-ATP（74 GBq/mmol；最终5μM）和或不添加100 nM PDBu来启动的。细胞在37°C下孵育30分钟，加入1 mM ATP（终浓度）和0.25 mg BSA后，用0.5 M HClO4（终浓度”）终止反应。如前所述（Amano等人，1984），用0.5M HClO4洗涤酸不溶性细胞级分三次，然后用乙醇/乙醚（3/1）洗涤三次。用Laemmli缓冲液溶解不溶部分（Laemmly，1970）。将磷酸化蛋白（来自4.5-6×105个细胞）进行SDS-PAGE，然后用BAS1500进行分析。

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Ki测定人氧化还原酶NQO2中BisIII的含量[1]
通过在610 nm和30°C下测量MTT的减少量，用分光光度法测定酶活性和抑制作用。在该试验中，我们使用NADH作为甲萘醌还原的电子供体，使用MTT作为甲萘二醇的连续再氧化。在96孔板中进行反应（200μl），其中含有50 mm KxHxPO4，pH 7.5，1μl醌还原酶2型（NQO2），40μm甲萘醌，200μm MTT，以及在不同固定BisIII浓度（0、1、30、60μm）存在下增加浓度的NADH（0-1000μm）。使用Lineweaver Burk应用程序，我们确定了不同BisIII浓度的表观Km（Km，app）值。Ki是通过绘制不同的Km，app与其相应的BisIII浓度来计算的。

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体外激酶测定[1]
将瞬时表达与N端FLAG标签融合的全长SLK的COS-7细胞的裂解物与G蛋白琼脂糖结合的抗FLAG抗体在4°C下免疫沉淀3小时。结合后，用500μl TL缓冲液洗涤珠粒三次，用500µl激酶缓冲液洗涤一次（20 mm HEPES，pH 7.5，15 mm MgCl2，80 mm KCl，1 mm Na3VO4和0.1 mm DTT）。在60μl的总体积中进行SLK激酶活性测定。将结合到15μl排水珠上的免疫沉淀SLK与含有指定BisIII浓度的35μl激酶缓冲液混合，并在4°C下孵育10分钟。通过加入100μm ATP、1μCi[γ-32P]ATP和20μg髓鞘碱性蛋白开始激酶反应，并在30°C下孵育10分钟。CDK2测定的总体积为50μl。然后，将100 ng CDK2/CyclinA和指示的BisIII、BisVIII和BisX浓度在4°C的激酶缓冲液中预孵育10分钟。通过加入100μm ATP、2μCi[γ-32P]ATP和10μg组蛋白H1开始激酶反应，并在30°C下孵育20分钟。通过加入25μl 3×SDS样品缓冲液停止所有激酶反应。样品通过SDS电泳和放射自显影进行分析，使用磷显像进行定量。IC50计算使用GraFit 5.0进行。

BisIII、BisVIII和BisX浓度的标准化[1]
将所有三种双吲哚基马来酰亚胺化合物溶解在100%二甲亚砜中。使用其在372 nm和460 nm处的最大吸收值对库存进行分光光度归一化（Spectramax Plus 384；Molecular Devices，加利福尼亚州森尼维尔），并在-20°C的氩气下在黑暗中储存。

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双吲哚基马来酰亚胺的固定化[1]
为了固定化，将排水的环氧活化琼脂糖6B重新悬浮在2倍体积的20 mm BisIII、BisVIII或BisX中，这些BisX溶解在50%二甲基甲酰胺/0.1 M Na2CO3 pH 11中。加入10 mm NaOH后，在30°C下在黑暗中偶联过夜。用50%二甲基甲酰胺/0.1 M Na2CO3洗涤三次后，用pH 11的1 M乙醇胺封闭剩余的反应基团。随后的洗涤步骤按照制造商的说明进行。为了生成对照基质（Ctrl），将环氧活化的Sepharose 6B直接与pH 11的1m乙醇胺反应，并如上所述进行同等处理。基质在4°C的黑暗中储存。

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细胞裂解和体外联合实验[1]
COS-7和HeLa细胞通常在含有50 mm HEPES、pH 7.5、150 mm NaCl、0.5%Triton X-100、1 mm EDTA、1 mm EGTA、3 mm CaCl2以及添加剂（10 mm氟化钠、1 mm原钒酸盐、10μg/ml抑肽酶、10μg/ml亮肽、1 mm苯甲基磺酰氟、0.2 mm二硫苏糖醇）和辅因子（100μg/ml磷脂酰丝氨酸（PS）、20μg/ml DAG）的Triton X-1100裂解缓冲液（TL缓冲液）中裂解。对于分析性体外关联实验，裂解物通过离心预冷并平衡至1 m NaCl。然后将300μl高盐裂解物与20μl沥干的双吲哚基马来酰亚胺基质（Bis基质）在4°C下孵育3小时。随后，Bis基质用500μl TL缓冲液加1 m NaCl洗涤两次，用500μl TL缓冲液洗涤一次；这两个步骤都是在没有添加剂的情况下进行的，共因子浓度降低到十分之一。在旨在检测特异性SLK和AK与BisIII珠结合的实验中，CaCl2和辅因子未包含在裂解和洗涤缓冲液中。当分析Rsk1与BisIII珠的刺激依赖性结合时，从裂解和洗涤缓冲液中省略CaCl2和辅因子，NaCl浓度保持在150 mm。对于HuH-7细胞PKCα结合的活化依赖性检测，裂解缓冲液为20 mm HEPES、pH 7.5、150 mm NaCl、0.25%Triton X-100、0.1 mm EDTA、0.2 mm EGTA加添加剂。如有指示，添加0.5 mm CaCl2和助因子。在相应的洗涤缓冲液中，共因子浓度也降低到十分之一，该洗涤缓冲液是不含添加剂的裂解缓冲液。通过在1.5x SDS样品缓冲液中煮沸亲和珠来洗脱结合的蛋白质。SDS-PAGE后，将蛋白质转移到硝化纤维膜上，用相应的抗体进行免疫印迹。使用2.5×109个细胞、16-苄基二甲基正十六烷基氯化铵（16-BAC）/SDS-PAGE分离和质谱分析进行的制备结合实验基本上如上所述进行，但修改为包含3 mm CaCl2、100μg/ml PS和20μg/ml DAG，并从裂解缓冲液中省略甘油。此外，在样品加载后，用含有3 mm CaCl2、20μg/ml PS和4μg/ml DAG的缓冲液洗涤BisIII柱。

[1]. Proteome-wide identification of cellular targets affected by bisindolylmaleimide-type protein kinase C inhibitors. Mol Cell Proteomics. 2004 May;3(5):490-500.

[2]. Role of ecto-kinase in phorbol ester-enhanced growth hormone-binding protein release from human IM-9 cells. Mol Cell Endocrinol. 1999 Jun 25;152(1-2):65-72.

Bisindolylmaleimide III is a member of maleimides and a member of indoles. It has a role as an EC 2.7.11.13 (protein kinase C) inhibitor. It is functionally related to a maleimide.

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In this work, we have used total cell extracts from HeLa cells as a protein source for the identification of bisindolylmaleimide-binding proteins. Importantly, all bisindolylmaleimide compounds used for immobilization are commercially available reagents. Thus, our established purification protocol can be easily applied to characterize PKC inhibitor-targeted subproteomes in other cell lines, tissue extracts, or even whole organisms and thereby provide a comprehensive picture how this widely used class of signal transduction inhibitors exerts its effects on the molecular level.[1]

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Previously we reported that a phorbol ester, phorbol 12, 13-dibutyrate (PDBu), increased the release of human growth hormone-binding protein (hGH-BP) in IM-9 cells, and that this phorbol ester-enhanced release was mediated by protein kinase Ca (PKCalpha). In the present study, the mechanisms of the phorbol ester-enhanced hGH-BP release were further investigated. Treatment of IM-9 cells with PDBu did not increase hGH-BPs (55-60 kDa) in the intracellular soluble fraction. When the cells were treated with trypsin to remove human growth hormone receptors (hGHRs) on the cell surface after stimulation, no hGH-BPs were detected in the culture supernatants, nor did treatment with bafilomycin A1 or chloroquine affect the PDBu-enhanced hGH-BP release. These results suggest that hGH-BPs released by PDBu stimulation are derived from cell surface hGHRs and not generated within the cells. Protein kinase inhibitors with broad specificities, K-252a and K-252b, inhibited the PDBu-enhanced release with almost the same dose-dependency, although only a trace amount of K-252b was incorporated into IM-9 cells than K-252a, suggesting that K-252b probably inhibits an ecto-kinase extracellularly. PDBu actually enhanced the phosphorylation of several extracellular proteins, and this enhanced phosphorylation was completely inhibited by K-252b treatment. Moreover, the PKCalpha-specific inhibitor Bisindolylmaleimide III which inhibits PDBu enhanced hGH-BP release inhibited the PDBu-enhanced phosphorylation of extracellular proteins. On the other hand, the impermeable PKC inhibitor PKC inhibitor peptide 19-31 did not inhibit PDBu-enhanced release, suggesting that the target PKCalpha for PDBu is not present on the extracellular surface. Taken together, these results suggest that, in addition to intracellular PKCalpha, activation of an undefined ecto-kinase may also be involved in the PDBu-enhanced hGH-BP release. [2]

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C23H20N4O2

384.430504798889

384.158

137592-43-9

2398

Brown to reddish brown solid powder

1.4±0.1 g/cm3

708.7±60.0 °C at 760 mmHg

382.4±32.9 °C

0.0±2.3 mmHg at 25°C

1.739

3.15

92.91

3

3

5

29

705

0

O=C1C(=C(C(N1)=O)C1=CNC2C=CC=CC1=2)C1=CN(CCCN)C2C=CC=CC1=2

APYXQTXFRIDSGE-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C23H20N4O2/c24-10-5-11-27-13-17(15-7-2-4-9-19(15)27)21-20(22(28)26-23(21)29)16-12-25-18-8-3-1-6-14(16)18/h1-4,6-9,12-13,25H,5,10-11,24H2,(H,26,28,29)

3-[1-(3-aminopropyl)indol-3-yl]-4-(1H-indol-3-yl)pyrrole-2,5-dione

3-[1-(3-AMINOPROPYL)-1H-INDOL-3-YL]-4-(1H-INDOL-3-YL)-1H-PYRROLE-2,5-DIONE; 3-(1-(3-Aminopropyl)-1H-indol-3-yl)-4-(1H-indol-3-yl)-1H-pyrrole-2,5-dione; bisindolylmaleimide iii; 137592-43-9; CHEBI:41059; 3-[1-(3-aminopropyl)indol-3-yl]-4-(1H-indol-3-yl)pyrrole-2,5-dione; Bisindolylmaleimide III, Hydrochloride; BIM III;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : 25 mg/mL (65.03 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 1.25 mg/mL (3.25 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 12.5 mg/mL澄清的DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；再向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；然后加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: 1.25 mg/mL (3.25 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶.
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 12.5 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。