| 规格 | 价格 | 库存 | 数量 |
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| 1mg |
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| 5mg |
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| 10mg |
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| Other Sizes |
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| 靶点 |
PKCα
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| 体外研究 (In Vitro) |
在之前的一篇论文(Saito等人,1998)中,我们报道了PKCα被认为是佛波酯对hGH-BP释放影响的介质,并且PKC特异性抑制剂双吲哚基马来酰亚胺III比IM-9细胞中表达的其他PKC(即PKCδ(IC50=5.7±0.5μM)和μ(IC50=6.0±0.2μM))更特异地抑制PKCα(IC50=0.26±0.05μM)。因此,我们随后研究了双吲哚基马来酰亚胺III对PDBu增强的胞外蛋白磷酸化的影响(图6)。双吲哚基马来酰亚胺III处理可剂量依赖性地抑制PDBu刺激诱导的几种蛋白质的磷酸化。磷酸化条带(42、45、53和83 kDa)的IC50值(n=3)范围为0.23至0.32μM,与PDBu增强双吲哚基马来酰亚胺III释放hGH-BP的IC50值相似(0.33±0.03μM)(Saito等人,1998)。这一发现表明,PDBu激活PKCα对于几种胞外蛋白的磷酸化是必要的,包括42(对应于图5中的43 kDa蛋白)、45、53和83 kDa蛋白以及增强的hGH BP释放[2]。
双吲哚基马来酰亚胺化合物如GF109203X是蛋白激酶C(PKC)活性的强效抑制剂。尽管双吲哚基马来酰亚胺对PKC不是完全选择性的,并且已知可以抑制其他一些蛋白激酶,但十多年来,这些试剂已被广泛用于研究PKC家族酶在细胞信号转导中的功能作用。在这里,我们建立了一种蛋白质组学方法,以进一步了解这类化合物的细胞效应。合适的双吲哚基马来酰亚胺类似物的功能性固定,结合亲和层析对细胞结合蛋白的特异性纯化,鉴定出了几种已知和以前未知的酶靶点。随后的体外结合和活性测定证实,蛋白激酶Ste20相关激酶和细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)以及非蛋白激酶腺苷激酶和醌还原酶2型是双吲哚基马来酰亚胺抑制剂的新靶点。正如CDK2所观察到的那样,通过固定密切相关的双吲哚基马来酰亚胺III、VIII和X,配体的微小化学变化极大地影响了靶结合。这些观察到的亲和力变化与体外CDK2抑制的IC(50)值以及分子对接CDK2晶体结构的结果相关。此外,亲和纯化的条件可以这样调整,即固定化的双吲哚基马来酰亚胺III仅在这些激酶激活后才与PKCα或核糖体S6蛋白激酶1选择性相互作用。因此,我们建立了一种快速鉴定细胞双吲哚基马来酰亚胺靶标的有效技术,并进一步证明了细胞蛋白质组中密切相关的激酶抑制剂的比较选择性分析[1]。 |
| 酶活实验 |
Ecto激酶测定[2]
IM-9细胞(2×106个细胞/ml,1.5 ml)用含有10 mM HEPES–NaOH(pH 7.4)的RPMI 1640洗涤两次,然后悬浮在含有0.6 mM CaCl2、0.6 mM MgCl2和2.5 mM NaF的RPMI1640培养基中。IM-9细胞在37°C下与或不与K-252b或双吲哚基马来酰亚胺III预孵育15分钟。磷酸化反应是通过添加[γ-32P]-ATP(74 GBq/mmol;最终5μM)和或不添加100 nM PDBu来启动的。细胞在37°C下孵育30分钟,加入1 mM ATP(终浓度)和0.25 mg BSA后,用0.5 M HClO4(终浓度”)终止反应。如前所述(Amano等人,1984),用0.5M HClO4洗涤酸不溶性细胞级分三次,然后用乙醇/乙醚(3/1)洗涤三次。用Laemmli缓冲液溶解不溶部分(Laemmly,1970)。将磷酸化蛋白(来自4.5-6×105个细胞)进行SDS-PAGE,然后用BAS1500进行分析。 Ki测定人氧化还原酶NQO2中BisIII的含量[1] 通过在610 nm和30°C下测量MTT的减少量,用分光光度法测定酶活性和抑制作用。在该试验中,我们使用NADH作为甲萘醌还原的电子供体,使用MTT作为甲萘二醇的连续再氧化。在96孔板中进行反应(200μl),其中含有50 mm KxHxPO4,pH 7.5,1μl醌还原酶2型(NQO2),40μm甲萘醌,200μm MTT,以及在不同固定BisIII浓度(0、1、30、60μm)存在下增加浓度的NADH(0-1000μm)。使用Lineweaver Burk应用程序,我们确定了不同BisIII浓度的表观Km(Km,app)值。Ki是通过绘制不同的Km,app与其相应的BisIII浓度来计算的。 体外激酶测定[1] 将瞬时表达与N端FLAG标签融合的全长SLK的COS-7细胞的裂解物与G蛋白琼脂糖结合的抗FLAG抗体在4°C下免疫沉淀3小时。结合后,用500μl TL缓冲液洗涤珠粒三次,用500µl激酶缓冲液洗涤一次(20 mm HEPES,pH 7.5,15 mm MgCl2,80 mm KCl,1 mm Na3VO4和0.1 mm DTT)。在60μl的总体积中进行SLK激酶活性测定。将结合到15μl排水珠上的免疫沉淀SLK与含有指定BisIII浓度的35μl激酶缓冲液混合,并在4°C下孵育10分钟。通过加入100μm ATP、1μCi[γ-32P]ATP和20μg髓鞘碱性蛋白开始激酶反应,并在30°C下孵育10分钟。CDK2测定的总体积为50μl。然后,将100 ng CDK2/CyclinA和指示的BisIII、BisVIII和BisX浓度在4°C的激酶缓冲液中预孵育10分钟。通过加入100μm ATP、2μCi[γ-32P]ATP和10μg组蛋白H1开始激酶反应,并在30°C下孵育20分钟。通过加入25μl 3×SDS样品缓冲液停止所有激酶反应。样品通过SDS电泳和放射自显影进行分析,使用磷显像进行定量。IC50计算使用GraFit 5.0进行。 |
| 细胞实验 |
BisIII、BisVIII和BisX浓度的标准化[1]
将所有三种双吲哚基马来酰亚胺化合物溶解在100%二甲亚砜中。使用其在372 nm和460 nm处的最大吸收值对库存进行分光光度归一化(Spectramax Plus 384;Molecular Devices,加利福尼亚州森尼维尔),并在-20°C的氩气下在黑暗中储存。 双吲哚基马来酰亚胺的固定化[1] 为了固定化,将排水的环氧活化琼脂糖6B重新悬浮在2倍体积的20 mm BisIII、BisVIII或BisX中,这些BisX溶解在50%二甲基甲酰胺/0.1 M Na2CO3 pH 11中。加入10 mm NaOH后,在30°C下在黑暗中偶联过夜。用50%二甲基甲酰胺/0.1 M Na2CO3洗涤三次后,用pH 11的1 M乙醇胺封闭剩余的反应基团。随后的洗涤步骤按照制造商的说明进行。为了生成对照基质(Ctrl),将环氧活化的Sepharose 6B直接与pH 11的1m乙醇胺反应,并如上所述进行同等处理。基质在4°C的黑暗中储存。 细胞裂解和体外联合实验[1] COS-7和HeLa细胞通常在含有50 mm HEPES、pH 7.5、150 mm NaCl、0.5%Triton X-100、1 mm EDTA、1 mm EGTA、3 mm CaCl2以及添加剂(10 mm氟化钠、1 mm原钒酸盐、10μg/ml抑肽酶、10μg/ml亮肽、1 mm苯甲基磺酰氟、0.2 mm二硫苏糖醇)和辅因子(100μg/ml磷脂酰丝氨酸(PS)、20μg/ml DAG)的Triton X-1100裂解缓冲液(TL缓冲液)中裂解。对于分析性体外关联实验,裂解物通过离心预冷并平衡至1 m NaCl。然后将300μl高盐裂解物与20μl沥干的双吲哚基马来酰亚胺基质(Bis基质)在4°C下孵育3小时。随后,Bis基质用500μl TL缓冲液加1 m NaCl洗涤两次,用500μl TL缓冲液洗涤一次;这两个步骤都是在没有添加剂的情况下进行的,共因子浓度降低到十分之一。在旨在检测特异性SLK和AK与BisIII珠结合的实验中,CaCl2和辅因子未包含在裂解和洗涤缓冲液中。当分析Rsk1与BisIII珠的刺激依赖性结合时,从裂解和洗涤缓冲液中省略CaCl2和辅因子,NaCl浓度保持在150 mm。对于HuH-7细胞PKCα结合的活化依赖性检测,裂解缓冲液为20 mm HEPES、pH 7.5、150 mm NaCl、0.25%Triton X-100、0.1 mm EDTA、0.2 mm EGTA加添加剂。如有指示,添加0.5 mm CaCl2和助因子。在相应的洗涤缓冲液中,共因子浓度也降低到十分之一,该洗涤缓冲液是不含添加剂的裂解缓冲液。通过在1.5x SDS样品缓冲液中煮沸亲和珠来洗脱结合的蛋白质。SDS-PAGE后,将蛋白质转移到硝化纤维膜上,用相应的抗体进行免疫印迹。使用2.5×109个细胞、16-苄基二甲基正十六烷基氯化铵(16-BAC)/SDS-PAGE分离和质谱分析进行的制备结合实验基本上如上所述进行,但修改为包含3 mm CaCl2、100μg/ml PS和20μg/ml DAG,并从裂解缓冲液中省略甘油。此外,在样品加载后,用含有3 mm CaCl2、20μg/ml PS和4μg/ml DAG的缓冲液洗涤BisIII柱。 |
| 参考文献 |
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| 其他信息 |
双吲哚基马来酰亚胺 III 属于马来酰亚胺类和吲哚类化合物。它是一种 EC 2.7.11.13(蛋白激酶 C)抑制剂。其功能与马来酰亚胺类似。
在本研究中,我们使用 HeLa 细胞的总细胞提取物作为蛋白质来源,用于鉴定双吲哚基马来酰亚胺结合蛋白。值得注意的是,所有用于固定化的双吲哚基马来酰亚胺化合物均为市售试剂。因此,我们建立的纯化方案可以轻松应用于表征其他细胞系、组织提取物甚至整个生物体中 PKC 抑制剂靶向的亚蛋白组,从而全面揭示这类广泛使用的信号转导抑制剂在分子水平上的作用机制。[1] 我们之前报道过,佛波醇酯佛波醇 12,13-二丁酸酯 (PDBu) 可增加 IM-9 细胞中人生长激素结合蛋白 (hGH-BP) 的释放,并且这种佛波醇酯增强的释放是由蛋白激酶 Ca (PKCα) 介导的。在本研究中,我们进一步探讨了佛波醇酯增强 hGH-BP 释放的机制。用 PDBu 处理 IM-9 细胞后,细胞内可溶性组分中的 hGH-BP (55-60 kDa) 含量并未增加。刺激后,用胰蛋白酶处理细胞以去除细胞表面的生长激素受体(hGHRs)后,在培养上清液中未检测到hGH-BPs,且用巴弗洛霉素A1或氯喹处理也不影响PDBu增强的hGH-BP释放。这些结果表明,PDBu刺激释放的hGH-BPs来源于细胞表面的hGHRs,而非细胞内生成。广谱蛋白激酶抑制剂K-252a和K-252b以几乎相同的剂量依赖性抑制了PDBu增强的hGH-BP释放,尽管K-252b进入IM-9细胞的量远低于K-252a,提示K-252b可能抑制细胞外的外激酶。PDBu实际上增强了多种细胞外蛋白的磷酸化,而这种增强的磷酸化作用可被K-252b处理完全抑制。此外,PKCα特异性抑制剂双吲哚基马来酰亚胺III(Bisindolylmaleimide III)能够抑制PDBu增强的hGH-BP释放,并抑制PDBu增强的细胞外蛋白磷酸化。另一方面,不透膜的PKC抑制剂PKC抑制肽19-31并未抑制PDBu增强的释放,这表明PDBu的靶点PKCα并不位于细胞外表面。综上所述,这些结果提示,除了细胞内PKCα外,一种未知的胞外激酶的激活也可能参与PDBu增强的hGH-BP释放。[2] |
| 分子式 |
C23H20N4O2
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|---|---|
| 分子量 |
384.430504798889
|
| 精确质量 |
384.158
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| CAS号 |
137592-43-9
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| PubChem CID |
2398
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| 外观&性状 |
Brown to reddish brown solid powder
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| 密度 |
1.4±0.1 g/cm3
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| 沸点 |
708.7±60.0 °C at 760 mmHg
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| 闪点 |
382.4±32.9 °C
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| 蒸汽压 |
0.0±2.3 mmHg at 25°C
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| 折射率 |
1.739
|
| LogP |
3.15
|
| tPSA |
92.91
|
| 氢键供体(HBD)数目 |
3
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| 氢键受体(HBA)数目 |
3
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| 可旋转键数目(RBC) |
5
|
| 重原子数目 |
29
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| 分子复杂度/Complexity |
705
|
| 定义原子立体中心数目 |
0
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| SMILES |
O=C1C(=C(C(N1)=O)C1=CNC2C=CC=CC1=2)C1=CN(CCCN)C2C=CC=CC1=2
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| InChi Key |
APYXQTXFRIDSGE-UHFFFAOYSA-N
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| InChi Code |
InChI=1S/C23H20N4O2/c24-10-5-11-27-13-17(15-7-2-4-9-19(15)27)21-20(22(28)26-23(21)29)16-12-25-18-8-3-1-6-14(16)18/h1-4,6-9,12-13,25H,5,10-11,24H2,(H,26,28,29)
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| 化学名 |
3-[1-(3-aminopropyl)indol-3-yl]-4-(1H-indol-3-yl)pyrrole-2,5-dione
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| 别名 |
3-[1-(3-AMINOPROPYL)-1H-INDOL-3-YL]-4-(1H-INDOL-3-YL)-1H-PYRROLE-2,5-DIONE; 3-(1-(3-Aminopropyl)-1H-indol-3-yl)-4-(1H-indol-3-yl)-1H-pyrrole-2,5-dione; bisindolylmaleimide iii; 137592-43-9; CHEBI:41059; 3-[1-(3-aminopropyl)indol-3-yl]-4-(1H-indol-3-yl)pyrrole-2,5-dione; Bisindolylmaleimide III, Hydrochloride; BIM III;
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| HS Tariff Code |
2934.99.9001
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| 存储方式 |
Powder -20°C 3 years 4°C 2 years In solvent -80°C 6 months -20°C 1 month |
| 运输条件 |
Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)
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| 溶解度 (体外实验) |
DMSO : 25 mg/mL (65.03 mM)
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|---|---|
| 溶解度 (体内实验) |
配方 1 中的溶解度: ≥ 1.25 mg/mL (3.25 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加,逐一添加), 澄清溶液。
例如,若需制备1 mL的工作液,可将100 μL 12.5 mg/mL澄清的DMSO储备液加入到400 μL PEG300中,混匀;再向上述溶液中加入50 μL Tween-80,混匀;然后加入450 μL生理盐水定容至1 mL。 *生理盐水的制备:将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中,得到澄清溶液。 配方 2 中的溶解度: 1.25 mg/mL (3.25 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加,逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶. 例如,若需制备1 mL的工作液,可将 100 μL 12.5 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中,混匀。 *20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备(4°C,1 周):将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中,得到澄清溶液。 请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案: 1、请先配制澄清的储备液(如:用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液)); 2、取适量母液,按从左到右的顺序依次添加助溶剂,澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明,并不一定代表此产品 的实际溶解配方): 10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline); 假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中,混合均匀/澄清;向上述体系中加入50 μL Tween-80,混合均匀/澄清;然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL; 3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例; 4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出,可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶; 5、为保证最佳实验结果,工作液请现配现用! 6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液,请查看说明书或联系我们; 7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。 |
| 制备储备液 | 1 mg | 5 mg | 10 mg | |
| 1 mM | 2.6013 mL | 13.0063 mL | 26.0125 mL | |
| 5 mM | 0.5203 mL | 2.6013 mL | 5.2025 mL | |
| 10 mM | 0.2601 mL | 1.3006 mL | 2.6013 mL |
1、根据实验需要选择合适的溶剂配制储备液 (母液):对于大多数产品,InvivoChem推荐用DMSO配置母液 (比如:5、10、20mM或者10、20、50 mg/mL浓度),个别水溶性高的产品可直接溶于水。产品在DMSO 、水或其他溶剂中的具体溶解度详见上”溶解度 (体外)”部分;
2、如果您找不到您想要的溶解度信息,或者很难将产品溶解在溶液中,请联系我们;
3、建议使用下列计算器进行相关计算(摩尔浓度计算器、稀释计算器、分子量计算器、重组计算器等);
4、母液配好之后,将其分装到常规用量,并储存在-20°C或-80°C,尽量减少反复冻融循环。
计算结果:
工作液浓度: mg/mL;
DMSO母液配制方法: mg 药物溶于 μL DMSO溶液(母液浓度 mg/mL)。如该浓度超过该批次药物DMSO溶解度,请首先与我们联系。
体内配方配制方法:取 μL DMSO母液,加入 μL PEG300,混匀澄清后加入μL Tween 80,混匀澄清后加入 μL ddH2O,混匀澄清。
(1) 请确保溶液澄清之后,再加入下一种溶剂 (助溶剂) 。可利用涡旋、超声或水浴加热等方法助溶;
(2) 一定要按顺序加入溶剂 (助溶剂) 。