Pyraclostrobin (pyraclostrobin)   中文名称: 百克敏

Fungicidal; Bax; Bcl-2; autophagy; AMPK/mTOR

本文研究了吡唑醚菌酯/Pyraclostrobin对HepG2细胞的毒理学风险和体外中毒机制。还评估了吡唑醚菌酯对斑马鱼幼虫的肝毒性。研究发现，吡唑醚菌酯可诱导HepG2细胞DNA损伤和活性氧的产生，表明吡唑醚醚菌酯具有潜在的遗传毒性。荧光染色实验和细胞色素c、Bcl-2和Bax的表达结果表明，吡唑啉醚菌酯诱导线粒体功能障碍，导致细胞凋亡。单丹酰尸胺染色和自噬标志物相关蛋白LC3、p62、Beclin-1蛋白表达表明，吡唑醚菌酯促进了细胞自噬。此外，免疫印迹分析表明，吡唑醚菌酯诱导的自噬伴随着腺苷5'-单磷酸（AMP）激活蛋白激酶（AMPK）/mTOR信号通路的激活。

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吡唑菌酯对HepG2细胞存活率和增殖的影响[1]
采用MTT法测定吡唑醚菌酯对HepG2细胞的细胞毒性。HepG2细胞用不同浓度的吡唑醚菌酯处理24小时，细胞存活率与吡唑醚醚菌酯浓度呈负相关，并呈浓度依赖性（图1A）。吡唑醚菌酯对HepG2细胞的IC50值估计为30.22μmol/L（表1）。

通过细胞克隆实验研究吡唑菌酯对人HepG2细胞增殖的影响（图1B）。如图1D所示，暴露于唑醚菌酯（10、20、40和80μmol/L）6小时后，细胞克隆形成率分别为79.31%、31.03%、6.89%和1.72%。细胞克隆形成率随唑醚菌酯浓度的增加而急剧下降，呈浓度依赖关系。上述数据表明，吡唑醚菌酯杀菌剂显著抑制了HepG2细胞的存活和增殖。

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吡唑菌酯诱导HepG2细胞DNA损伤[1]
单细胞凝胶电泳（SCGE）是检测DNA损伤最灵敏、最快速的方法。通过检测迁移光密度、尾长和尾矩，可以评估DNA损伤的程度。表2总结了中性彗星试验的参数，表明彗星现象（尾部DNA%）非常明显。如图1E所示，与未处理的细胞相比，用10-80μmol/L吡唑醚菌酯处理的HepG2细胞显著增加了彗星的尾部DNA含量和形成的尾部长度。同时，图1C显示彗星阳性细胞的比例呈剂量依赖性增加。当唑醚菌酯的暴露浓度为0、10、20、40和80μmol/L时，DNA损伤细胞的百分比分别为7.12、33.69、46.64、67.31和77.74%。结果表明，吡唑醚菌酯可导致HepG2细胞DNA单链断裂。

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吡唑菌酯诱导HepG2细胞线粒体功能障碍[1]
线粒体膜电位（MMP）通过调节线粒体膜的选择性和通透性来维持线粒体的正常结构和功能（Tait和Green，2012）。为了研究HepG2细胞在暴露于吡唑醚菌酯6小时后是否发生线粒体功能障碍，通过荧光显微镜对线粒体膜电位（ΔΨm）进行了定量分析。如图2B和D所示，用Rho-123染色的HepG2细胞中的绿色荧光强度呈浓度依赖性下降趋势，表明吡唑醚菌酯导致HepG2细胞ΔΨm崩溃。

线粒体损伤可导致ROS的过度产生。因此，ROS敏感探针DCFH-DA用于检测HepG2细胞内ROS的产生。荧光强度可以反映细胞内ROS水平。如图2A和C所示，与对照细胞相比，经吡唑菌酯处理的HepG2细胞中DCF荧光信号强度显著增加，表明吡唑醚菌酯以剂量依赖的方式诱导细胞内ROS的产生。综上所述，这些发现表明吡唑醚菌酯诱导线粒体功能障碍，导致ROS的过度产生。

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吡唑菌酯对HepG2细胞凋亡相关蛋白水平的影响[1]
为了探索Pyraclostrobin/吡唑醚菌酯诱导细胞凋亡的潜在机制，用不同浓度的吡唑醚醚菌酯处理肝细胞癌细胞，并通过免疫印迹分析凋亡相关蛋白的表达。如图3C和D所示，随着吡唑醚菌酯浓度的增加，细胞质中细胞色素c（Cyt c）的含量呈浓度依赖性增加，这证明吡唑醚醚菌酯加速了Cyt c的释放。此外，促凋亡蛋白Bax表达减少，抗凋亡蛋白Bcl-2表达同时下调（图3A和B）。上述结果表明，吡唑醚菌酯损伤线粒体膜，导致Bax/Bcl-2的变化，从而激活凋亡途径。

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吡唑菌酯对HepG2细胞自噬囊泡和自噬相关蛋白的影响[1]
自噬的形态学特征是自噬囊泡的形成。MDC是一种自发荧光染料，用于标记吡唑醚菌酯处理的HepG2细胞，在荧光显微镜下进一步观察自噬溶酶体。图像显示HepG2细胞中的荧光强度增加，表明吡唑菌酯处理后自噬空泡的数量增加（图4A）。结果表明，吡唑醚菌酯能够诱导人HepG2细胞自噬体的形成和积累，并且吡唑醚醚菌酯的促进作用呈浓度依赖性。

为了进一步阐明吡唑菌酯触发自噬的机制，我们进行了蛋白质印迹，以确定用吡唑菌胺处理6小时的HepG2细胞中主要自噬相关蛋白的表达。LC3蛋白有两种形式：LC3-I和LC3-II，LC3-I转化为LC3-II被认为是自噬的标志。Beclin-1对自噬膜成核至关重要，它与自噬前体的结合使其成为自噬启动和进展的关键蛋白（Hao等人，2019）。与对照组相比，LC3-II/I和Beclin-1蛋白的表达率均增加，而p62的表达显著下降（图4B和C）。这些结果有力地证实了吡唑醚菌酯促进了HepG2细胞的自噬。此外，如图4D和E所示，暴露于唑醚菌酯后，mTOR和p70s6k的磷酸化水平逐渐受到抑制，AMPK磷酸化以剂量依赖的方式显著升高。基于上述数据，吡唑醚菌酯介导的HepG2细胞自噬涉及AMPK/mTOR信号通路。

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吡唑菌酯诱导线粒体和溶酶体的荧光共定位[1]
为了进一步确定受损的线粒体是否与溶酶体结合，使用荧光探针检测溶酶体质量。如图5所示，评估溶酶体活性的Lyso跟踪器Red的荧光强度在唑醚菌酯治疗组中逐渐增加。线粒体和溶酶体荧光的合并照片显示，线粒体逐渐被溶酶体降解。共定位结果表明，吡唑菌酯诱导的细胞中受损的线粒体可能被溶酶体吞噬。

吡唑菌酯/Pyraclostrobin是一种高效、广谱的甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂。随着吡唑醚菌酯在农作物病害防治中的广泛应用，其环境压力和对人类的潜在安全风险引起了人们的广泛关注。斑马鱼肝脏的可视化和油红染色表明，吡唑醚菌酯可诱导斑马鱼的肝脏变性和肝脂肪变性。总的来说，这些结果有助于更好地了解吡唑醚菌酯的肝毒性，并为其安全应用和风险控制提供科学依据。[1]

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本研究旨在评估吡唑醚菌酯/Pyraclostrobin对斑马鱼（Danio rerio）肝脏DNA损伤和抗氧化酶活性的毒性作用。根据该化学物质的96h半数致死浓度（96h LC50，0.056mg/L），将鱼类暴露于三种剂量（0.001、0.01和0.02mg/L），并在亚慢性毒性试验开始后的第7、14、21和28天取样。测定超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽S-转移酶（GST）、活性氧（ROS）和DNA损伤的水平。还测量了水中唑醚菌酯残留量。在暴露期间，三个处理组的浓度变化不超过5%，表明唑醚菌酯在此期间在水生环境中相对稳定。在实验过程中，ROS和MDA水平以剂量依赖的方式显著变化。酶活性在一定程度上受到抑制。DNA损伤明显增强。这些结果共同表明，吡唑醚菌酯可诱导斑马鱼的氧化应激和DNA损伤。[2]

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吡唑菌酯/Pyraclostrobin被广泛用于控制作物病害，据报道对水生生物具有高毒性。吡唑菌酯对真菌的分子靶点是线粒体，但其对水生生物线粒体的影响很少被研究。在这项研究中，斑马鱼幼虫在受精后4天（dpf）暴露于一系列吡唑醚菌酯96小时，以评估其急性毒性和对线粒体的影响。36μg/L或更高浓度的吡唑醚醚菌酯对幼虫的心脏和大脑产生了显著影响，包括心包水肿、脑损伤畸形、两个器官的组织学和线粒体结构损伤。RNA-Seq的结果显示，36μg/L的吡唑醚菌酯显著影响了与氧化磷酸化、心肌收缩、线粒体、神经系统发育和谷氨酸受体活性相关的基因转录本。进一步的测试表明，18和36μg/L剂量的吡唑菌酯降低了与心肌收缩相关的蛋白质浓度，损害了心脏功能，抑制了谷氨酸受体活性，抑制了斑马鱼幼虫的运动行为。在用18和36μg/L吡唑醚菌酯处理的幼虫中，也观察到线粒体复合物活性的负变化以及ATP含量的降低。这些结果表明，吡唑醚醚菌酯暴露会导致斑马鱼幼虫的心脏毒性和神经毒性，线粒体功能障碍可能是吡唑醚胺菌酯毒性的潜在机制[3]。

细胞活力测定[1]
如文献所述，MTT法可以检测HepG2细胞的存活率（Grela等人）。通过胰蛋白酶消化法收获HepG2细胞。用细胞计数仪将细胞密度调节至1×105个细胞/mL。将100μL细胞悬浮液倒入96孔板上，在37°C下在5%CO2培养箱中培养24小时。然后加入一系列浓度（10、20、40和80μmol/L）的Pyraclostrobin/吡唑菌酯。处理24小时后，向每个孔中加入20μL MTT试剂（5mg/mL）。在培养箱中静置4小时，吸收上层MTT溶液和培养基溶液，然后加入150μL DMSO溶解甲赞。然后，使用Synergy H1酶标仪（Bio-Teck，Winooski，VT，USA）测量每个孔在492和630nm处的吸光度。

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细胞增殖试验[1]
集落形成试验是细胞毒性的重要标志。将HepG2细胞以500个细胞/ml的密度接种在6-cm的细胞培养皿中24小时，然后接种10、20、40和80μmol/L的Pyraclostrobin/吡唑菌酯。对照组为含有0.1%DMSO的新鲜培养基。10天后，将培养基从孔中吸出。然后用5%戊二醛固定，10%Giemsa染色，用原子显微镜检查菌落计数。

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DNA损伤分析[1]
碱性彗星试验是检测DNA损伤最灵敏、最快速的方法（Cetinkaya等人，2016；Zhang等人，2019）。将Pyraclostrobin/吡唑菌酯稀释至0、10、20、40和80μmol/L。向每个孔中加入2mL试验溶液，并将其放回培养箱中12小时。然后将细胞放入4°C的离心机中收集沉淀。将PBS洗涤沉淀3次以去除唑菌酯，并将预热的低熔点琼脂糖凝胶与含有PBS的细胞以1∶5的比例混合。混合后，将100μL凝胶滴到载玻片上（Ghassemi Barghi等人，2016）。琼脂糖在4°C下凝固15分钟，将载玻片浸入4°C的新鲜裂解液（10%DMSO、10 mM Trise HCl、2.5 M NaCl、100 mM EDTA、1%Triton X-100，pH 10）中30分钟。裂解后，用去离子水冲洗载玻片三次，并在4°C的新鲜碱性电泳溶液中浸泡10分钟。电泳在20 V下进行20分钟。电泳后，用中和缓冲液冲洗载玻片3次，然后用去离子水清洗3次。然后加入PI试剂（20mg/mL）染色5分钟。最后，用荧光显微镜检查载玻片，并通过图像分析系统分析DNA损伤程度。

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线粒体膜电位分析[1]
罗丹明123（Rho-123）用于检测Δψm，以分析线粒体是否损伤HepG2细胞（Ferlini和Scambia，2007）。细胞在6孔板中用特定浓度的Pyraclostrobin吡唑菌酯处理12小时。细胞表面用PBS缓冲液洗涤3次，然后在黑暗中用Rho-123染色15分钟。通过荧光显微镜检测吡唑醚菌酯处理的HepG2细胞的荧光强度。

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细胞内ROS测量[1]
DCFH-DA是检测细胞内ROS水平变化的常用方法。用特定浓度的Pyraclostrobin/吡唑醚菌酯处理吡唑醚酶6小时，用冷PBS缓冲液洗涤HepG2细胞两次。然后向每个孔中加入1 mL DCFH-DA（10 M）染色溶液，在5%CO2和37°C的培养箱中孵育30分钟。通过荧光显微镜观察并记录ROS的荧光（在488和530 nm处激发）强度。

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蛋白质印迹[1]
为了研究吡唑菌酯醚诱导HepG2细胞死亡的潜在机制，使用Western blot分析了特异性蛋白质。用指定浓度的唑醚菌酯处理6小时后，用冷PBS（pH 7.4）洗涤细胞3次并收获。然后将细胞在4°C、12000 rpm下离心15分钟。我们收集上清液并通过BCA测定蛋白质浓度。经过8-15%SDS-PAGE处理后，通过电泳将相同体积的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用5%牛奶在Tris缓冲盐水吐温（TBST；10 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，0.1%吐温-20，pH 7.5）中密封膜2小时。然后，将膜在4°C下与第一抗体一起孵育过夜，在室温下与第二抗体一起孵育1小时。用增强化学发光（ECL）试剂处理后，出现可视化信号。最后，用ImageJ软件扫描所有蛋白带，并将IDVS定量并归一化为β-actin。

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自噬分析[1]
单丹磺酰尸胺（MDC）可以特异性标记自噬囊泡的形成（Cárdenas等人，2010）。将Pyraclostrobin/吡唑菌酯稀释至0、10、20、40和80μmol/L。向每个孔中加入2 mL试验溶液，并将其放回5%CO2和37°C的培养箱中6小时。然后使用吸孔中的含药物培养基用PBS溶液洗涤细胞表面3次，然后向每个孔添加1 mL MDC染料。在培养箱中孵育30分钟后，吸出MDC染色溶液，用PBS溶液清洗细胞表面3次。通过荧光显微镜观察并记录MDC荧光强度。

斑马鱼幼体毒性试验[1]
\nAB-野生型成年斑马鱼和Tg(fabp10a:dsRed; ela3l:EGFP)转基因品系购自中国斑马鱼资源中心。斑马鱼在循环水养殖系统中培养（温度28℃；光暗周期14:10小时）。按照先前建立的程序（Lu et al., 2022），选择等比例的雄性和雌性斑马鱼进行产卵。收集受精后72小时（72 hpf）的斑马鱼幼体，并分别暴露于吡唑醚菌酯（0、0.01、0.02、0.04和0.08 μmol/L）中，持续至72 hpf，每组20尾斑马鱼幼体。暴露后，使用荧光显微镜观察并成像斑马鱼。\n

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\n\n在进行急性毒性试验和亚慢性毒性试验前24小时，每天定时投喂鱼饵。每两天更换一半水，并使用虹吸法清除粪便、残留鱼饵和死鱼，以避免干扰试验结果。急性毒性试验为静态试验，旨在测定吡唑醚菌酯的96小时LC50值。导致急性毒性的浓度分别为0、0.001、0.01、0.05、0.06、0.07、0.08和0.1 mg/L。每个样本包含10条随机选择的鱼和1.5 L暴露溶液。根据Passino和Smith（1987）的研究，采用96小时LC50值评估农药对斑马鱼的急性毒性（mg/L），具体如下：小于1 mg/L为高毒性；1～10 mg/L为中等毒性；10～100 mg/L为轻微毒性；100～1000 mg/L为几乎无害；大于1000 mg/L为相对无害。吡唑醚菌酯的亚慢性毒性试验设置了对照组和三个暴露于不同浓度吡唑醚菌酯（0.001、0.01和0.02 mg/L）的实验组。随机选取120尾鱼，分别放入装有20 L水的容器中，并置于三个浓度组之一。亚慢性毒性试验为半静态试验，每隔2天同时更换一半暴露溶液，以维持整个亚慢性毒性试验期间吡唑醚菌酯的浓度。分别于第7、14、21和28天对鱼进行三次重复取样，分析活性氧（ROS）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽S-转移酶（GST）、丙二醛（MDA）和DNA损伤的水平。对照组使用1 mL溶于相同来源的除氯自来水中的丙酮溶液，以避免溶剂干扰。急性毒性试验和亚慢性毒性试验中，每个试验均进行三次重复[2]。\n

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\n\n急性毒性试验[3]
\n将4日龄的斑马鱼幼鱼随机转移至24孔板中，分别用33、36、40、44和48 μg/L的吡唑醚菌酯处理至8日龄。设置空白对照和溶剂对照。每孔板包含20条幼鱼，每条幼鱼置于2 mL溶液中，每个浓度重复三次（每孔板为一个重复）。所有受试幼鱼均在培养箱中培养（27 ± 1 °C；14:10小时光照/黑暗周期）。每24小时更换一次试验溶液。每天使用光学显微镜（Olympus BH-2）检查幼虫的死亡率和畸形情况，并用倒置显微镜记录。畸形幼虫的百分比通过将畸形个体数除以每个重复组中所有存活个体数来计算。\n

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\n\n组织学和亚细胞结构分析[3]
\n斑马鱼幼虫在与上述相同的培养条件下，于4至8日龄（dpf）暴露于0和36 μg/L的吡唑醚菌酯。每个重复组包含100条幼虫，每个浓度重复三次。选择36 μg/L吡唑醚菌酯的剂量主要是因为首次在该浓度下观察到斑马鱼幼虫死亡。暴露结束后，收集幼虫进行组织学和亚细胞结构分析，每个重复组（n = 3）各取15条幼虫。
\n用于组织学分析的幼虫在4℃下用4%多聚甲醛（PFA）固定过夜，然后用梯度乙醇脱水，最后进行石蜡包埋。包埋后的幼虫切片（2–3 μm厚），并用苏木精-伊红（HE）染色。使用NanoZoomer S210成像系统获取图像，并用NDP采集图像。
\n用于亚细胞结构分析的幼虫在2.5%戊二醛中固定至少2小时，并用0.1 M磷酸盐缓冲液（pH = 7.2）洗涤3次。然后，将样品在1%锇酸中固定2小时，并用0.1 M磷酸盐缓冲液（pH = 7.2）洗涤3次。经梯度丙酮脱水后，所有标本均包埋于环氧树脂中。使用超薄切片机从选定区域制备超薄切片，并用醋酸铀和柠檬酸铅染色。在透射电镜下观察幼虫的亚细胞结构。\n

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\n\nRNA-Seq 分析和 RT-qPCR 验证 [3]
\n收集 40 只暴露于 0 和 36 μg/L 吡唑醚菌酯（4 dpf 至 8 dpf）的幼虫，并使用旋转柱法提取总 RNA。使用 NanoPhotometer 分光光度计（德国 Implen 公司）和 Agilent Bioanalyzer 2100（美国安捷伦科技有限公司）测定 RNA 浓度和质量。不同样本的 RNA-Seq 由诺禾致源公司完成。将校正后 p 值 (padj) < 0.05 的基因定义为差异表达基因 (DEGs)。基于各处理组的 DEGs 列表（padj < 0.05），分别使用 KOBAS (2.0) 和 GOseq (2.12 版) 进行 KEGG 通路和 GO 分析。RNA-Seq 分析的详细步骤见补充材料。

\n选取 15 个候选基因，使用 RT-qPCR 对暴露于 0 和 36 μg/L 吡唑醚菌酯（4 dpf 至 8 dpf）的斑马鱼幼体 RNA 样本进行验证。提取总 RNA，并使用 FastQuant RT 试剂盒（天根生物，北京，中国）以 1 μg RNA 为模板进行第一链 cDNA 合成。使用 Primer Premier 6.0 软件设计了斑马鱼特异性引物，用于扩增目标基因（表 S2）。RT-qPCR 实验按照先前发表的方案进行（Li 等，2018b）。目标基因的 mRNA 水平采用 2−ΔΔCT 法计算，并以管家基因 β-actin 进行标准化（Livak 和 Schmittgen，2001）。每个样本均进行 3 次生物学重复和 3 次技术重复。设置阴性对照（水空白和未进行逆转录的总 RNA），并通过热变性（熔解曲线分析）验证产物特异性（图 S15）。

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\n\nWestern blotting [3]
\n斑马鱼幼体分别用 0、9、18 和 36 μg/L 的吡唑醚菌酯处理 96 小时（n = 3 个重复，每个重复 40 条幼体）。在8日龄时，将幼虫在液氮中匀浆，提取总蛋白进行Western blot分析。取蛋白样品（约50 μg）进行10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。将膜封闭后，印迹膜与小鼠抗DHPR抗体（1:500）和兔抗β-肌动蛋白IgG抗体（1:4000）孵育，随后与辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（山羊抗小鼠抗体（1:3000）和山羊抗兔抗体（1:3000））孵育。将ECL试剂应用于膜上4分钟。使用化学发光成像系统评估蛋白信号。Western blot结果使用Quantity One软件进行定量分析。\n

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\n\n幼虫运动行为分析[3]
\n斑马鱼幼虫在4至8日龄（dpf）期间，于24孔板中分别用0、9、18和36 μg/L的吡唑醚菌酯处理（n = 3个重复，每个重复20条幼虫），处理条件与急性处理相同。毒性试验。暴露结束后，使用配备 e2v CMOS 传感器的 USB 3.0 彩色摄像机监测幼虫在 10 分钟内的自由游泳活动。平均速度和游动距离的数据由 LoliTrack 4.2.0 版本软件获取。

吸收、分布和排泄
口服给药。本研究考察了雄性和雌性Wistar大鼠（至少7周龄）口服14C标记的吡唑醚菌酯（纯度>98%）后，其在体内的吸收、分布和排泄情况。标记物分别在甲苯环或氯苯环上进行放射性标记。……在一系列四项实验中，分别于给药后6、12和24小时收集粪便样本，并在接下来的168小时内每隔24小时收集一次，直至90%的放射性物质被排出体外。在前三项实验中，每组四只雄性大鼠和四只雌性大鼠分别单次口服50 mg/kg体重的14C标记的甲苯环吡唑醚菌酯、14C标记的氯苯环吡唑醚菌酯或未标记的吡唑醚菌酯。在第四项实验中，每组四只雌雄大鼠分别单次口服5 mg/kg体重的¹⁴C-甲苯基标记的吡唑醚菌酯。实验结束后，处死动物，并检测其心脏、肝脏、脾脏、骨骼、皮肤、肺脏、卵巢、骨髓、胴体、肌肉、肾脏、睾丸、脑、胰腺、子宫、脂肪组织、胃及其内容物、甲状腺、肾上腺、血液/血浆以及肠道及其内容物的放射性。此外，在两项使用放射性标记吡唑醚菌酯的实验中，分别收集两只雄性大鼠的呼出气体，以测定¹⁴C标记气体的呼出量。另进行了两项实验，检测分别给予5 mg/kg和50 mg/kg体重的¹⁴C-甲苯基标记吡唑醚菌酯后血液中的放射性浓度。分别于给药后0.5、1、2、4、8、24、48、72、96和120小时采集动物血样（100-200 μL），并测定全血和血浆中的放射性含量。在给药后0.5、8、20和42小时（5 mg/kg体重）以及0.5、24、36和72小时（50 mg/kg体重）处死动物，并检测其组织分布。检测的组织包括心脏、肝脏、脾脏、骨骼、皮肤、肺脏、卵巢、骨髓、胴体、肌肉、肾脏、睾丸、脑、胰腺、子宫、脂肪组织、胃及其内容物、甲状腺、肾上腺、血液/血浆以及肠道及其内容物。为了检测吡唑醚菌酯的胆汁排泄情况，对动物的胆管进行插管，并在给予每剂量组（雌雄各四只，每组剂量均为 5 或 50 mg/kg 体重）的 ¹⁴C-甲苯基标记的吡唑醚菌酯后，每隔 3 小时收集一次胆汁，持续 48 小时（持续时间取决于动物的健康状况和后期时间点的排泄率）。在单次给予 5 或 50 mg/kg 体重的 ¹⁴C-甲苯基标记的吡唑醚菌酯的大鼠中，血浆放射性浓度在 0.5 至 1 小时后达到峰值；雄性大鼠在 5 或 50 mg/kg 体重剂量组以及雌性大鼠在 8 小时后出现第二个峰值；雌性大鼠在 50 mg/kg 体重剂量组于 24 小时后出现第二个峰值。考虑到高剂量，女性达到峰值时间的显著差异很可能至少部分是由于缺乏8至24小时之间的采样点造成的。第二个峰值出现后，血浆浓度在120小时后下降至<0.1 μg当量/g。男性和女性的终末半衰期相似，但5 mg/kg体重剂量下的终末半衰期比50 mg/kg体重剂量下的终末半衰期长50%。血浆浓度-时间曲线下面积与各性别的剂量大致成正比，表明在较高剂量下吸收并未饱和。
单次口服 50 mg/kg 体重的 14C-甲苯基标记吡唑醚菌酯后，0.5 小时后，大鼠胃肠道中放射性浓度最高（肠道：28 至 39 微克当量/克；肠道内容物：63 至 92 微克当量/克；胃：325 至 613 微克当量/克；胃内容物：1273 至 1696 微克当量/克）。肝脏（13～25 μg当量/g）的放射性浓度高于肾脏（4～7 μg当量/g）和血浆（2～6 μg当量/g），骨骼（0.1～0.3 μg当量/g）和脑（1～2 μg当量/g）的放射性浓度最低。72小时后，组织和器官的放射性浓度均低于2.6 μg当量/g。在给予5 mg/kg体重剂量后，0.5小时后，胃肠道（肠道：5 μg当量/g；肠内容物：7～9 μg当量/g；胃：49～89 μg当量/g；胃内容物：160～205 μg当量/g）的放射性浓度也最高。42小时后，组织和器官的放射性浓度均低于0.7 μg当量/g。在预先用未标记的吡唑醚菌酯处理14天的大鼠中，单次口服5 mg/kg体重的¹⁴C-甲苯基标记的吡唑醚菌酯，120小时后，甲状腺（0.18至0.35 μg当量/g）和肝脏（0.1 μg当量/g）中的放射性浓度最高。在所有其他组织中，记录到的放射性浓度均低于0.1 μg当量/g。吡唑醚菌酯的快速且几乎完全的排泄，以及在观察期内组织浓度下降至较低水平，表明其蓄积的可能性很低。在所有四项大鼠口服实验中，放射性的总回收率为91%至105%。单次口服 5 或 50 mg/kg 体重的 14C-甲苯基标记吡唑醚菌酯后 48 小时内，10% 至 13% 的给药放射性物质经尿液排出，74% 至 91% 经粪便排出。120 小时后，尿液和粪便中排出的放射性总量分别为 11% 至 15% 和 81% 至 92%。在预先用未标记的吡唑醚菌酯处理 14 天的大鼠中观察到了类似的排泄模式，然后单次口服 5 mg/kg 体重的 14C-甲苯基标记的吡唑醚菌酯（48 小时后尿液中 12% 至 13%，粪便中 76% 至 77%；120 小时后尿液中 12% 至 14%，粪便中 79% 至 81%），在单次口服 50 mg/kg 体重的氯苯基标记的吡唑醚菌酯的大鼠中也观察到了类似的排泄模式（48 小时后尿液中 11% 至 15%，粪便中 68% 至 85%；120 小时后尿液中 12% 至 16%，粪便中 74% 至 89%）。在以 50 mg/kg 体重剂量给予大鼠 14C-甲苯基或 14C-氯苯基标记的吡唑醚菌酯后，大鼠呼出气体中未检测到放射性。在组织和器官中，120 小时后残留的放射性在 50 mg/kg 体重剂量下低于 1 mg 当量/g，在 5 mg/kg 体重剂量下低于 0.1 mg 当量/g。在给予 5 或 50 mg/kg 体重剂量的 14C-甲苯基标记的吡唑醚菌酯后 48 小时内，35% 至 38% 的给药放射性通过胆汁排出，结合尿液排泄的观察结果，表明约 50% 的给药剂量已被吸收。
皮肤给药。本研究评估了16只雄性Wistar大鼠单次经皮涂抹14C标记的吡唑醚菌酯（溶于Solvesso）后的吸收情况，以及在有限范围内评估了其分布和排泄情况。涂抹剂量分别为0.015、0.075或0.375 mg/cm²，相当于每只动物0.15、0.75和3.75 mg，或约0.8、4和18 mg/kg体重。动物暴露于试验物质4小时（每组4只大鼠）或8小时（每组12只大鼠），并在暴露开始后4、8、24或72小时处死每组的4只大鼠。给药前24小时，剃除肩部约10 cm²区域的毛发，并用丙酮清洗。将硅胶环粘在皮肤上，用注射器（10 μL/cm²）注射测试物质制剂，注射前后均称重。然后将尼龙网粘在硅胶环表面，并用多孔绷带覆盖。暴露期结束后，移除保护罩，用肥皂溶液清洗暴露的皮肤。处死动物后，检测排泄物、血细胞、血浆、肝脏、肾脏、胴体、处理过和未处理的皮肤中的放射性浓度。同时检测笼子、皮肤清洗液以及包括硅胶环在内的保护罩中的放射性。所有组别中，放射性回收率均达到99%至110%。在暴露8小时后，72小时处死动物时，1.6%至2.6%的给药剂量被吸收，22%至26%存在于皮肤或皮肤清洗液中，72%至80%存在于保护罩中。尿液和粪便中分别仅排出0.2%至0.4%和0.9%至1.8%的吡唑醚菌酯。
有关吡唑醚菌酯（共6个）的更多吸收、分布和排泄（完整）数据，请访问HSDB记录页面。

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代谢/代谢物
对毒代动力学研究中使用的动物以及额外给予50 mg/kg体重/天单次剂量（以提供更多分析材料）的动物组的组织、排泄物和胆汁进行了吡唑醚菌酯代谢物的分析。为了确定血浆、肝脏和肾脏中的代谢物，另一些动物组分别以5和50 mg/kg体重的单次剂量给予¹⁴C-甲苯基或¹⁴C-氯酚环标记的吡唑醚菌酯，并在8小时后处死。采用高效液相色谱（HPLC）、液相色谱-质谱联用（LC-MS）和核磁共振（NMR）技术鉴定代谢物。吡唑醚菌酯的代谢主要通过三条途径进行，这三条途径主要涉及吡唑醚菌酯分子三个主要部分的改变。甲苯基甲氧基氨基甲酸酯部分的甲氧基很容易丢失，只有少数主要代谢物保留了该基团。芳香环和/或吡唑环的羟基化之后，会发生葡萄糖醛酸化，偶尔还会发生硫酸盐化。许多代谢物来源于吡唑醚菌酯的氯酚-吡唑或甲苯基甲氧基氨基甲酸酯部分，这些代谢物是在醚键断裂后，经环羟基化和葡萄糖醛酸化或硫酸盐化而产生的。不同性别和不同剂量组的代谢物组成相似。胆汁和尿液中未检测到未代谢的母体化合物，粪便中也仅检测到少量。从尿液中回收的已鉴定代谢物中，主要化合物包括：环羟基化的吡唑醚菌酯；吡唑环上羟基化的氯酚吡唑部分（含或不含硫酸盐结合物）；甲苯基甲氧基氨基甲酸酯部分的葡萄糖醛酸苷；以及甲苯基甲氧基氨基甲酸酯部分的苯甲酸衍生物。在粪便中，主要代谢物是去甲氧基化和吡唑环羟基化的吡唑醚菌酯。在胆汁中，主要代谢物是吡唑环4'位羟基化的吡唑醚菌酯的葡萄糖醛酸苷，该化合物以及在粪便中发现的去甲氧基化衍生物也是从血浆和肝脏中分离出的主要代谢物。甲氧基氨基甲酸酯部分的脱甲氧基化反应似乎主要发生在肠道，因为胆汁中的主要代谢物保留了该基团的完整结构，而粪便中的主要代谢物则是脱甲氧基衍生物。从肾脏中分离出的大部分放射性标记物以未改变的母体化合物和脱甲氧基衍生物的形式存在。
Wistar大鼠分别接受氯苯基标记的吡唑醚菌酯（化学纯度>98%，放射化学纯度>98%）或甲苯基标记的吡唑醚菌酯（化学纯度>98%，放射化学纯度>98%）给药，并用纯度为99.8%的未标记吡唑醚菌酯（BAS 500 F）调整至所需剂量。给药8小时后采集组织样本，以达到用于分析的最大组织浓度。数据未显示性别差异。剂量水平（5 或 50 mg/kg）和既往治疗史（预先使用 50 mg/kg/天的吡唑醚菌酯治疗 2 周）对代谢分布无明显影响。粪便中最丰富的代谢物是 500M08（去甲氧基化的活性成分，其在吡唑环的 4 位发生羟基化），约占总给药剂量的 38%。其他重要的粪便代谢物进一步发生羟基化：通常在氯苯环上，有时也在甲苯环上。主要的胆汁代谢物是 500M46（由活性成分吡唑基团的 4 位碳发生羟基化和葡萄糖醛酸化形成）。大多数次要的胆汁代谢物也是葡萄糖醛酸苷。没有一种尿液代谢物占给药剂量的比例超过 3%。尿液中的主要代谢产物是醚氧裂解的各种产物（通常形成葡萄糖醛酸苷或苯甲酸衍生物），或500M06（500M46的脱甲氧基化产物）。血浆中可检测到的残留物仅限于500M06和500M46（约占给药剂量的0.02%）。这些代谢物以及母体吡唑醚菌酯在肝脏中的含量较高（这三种残留物合计约占给药剂量的0.5%）。肾脏中仅能检测到吡唑醚菌酯，含量约为给药剂量的0.03%。因此，被吸收的吡唑醚菌酯能被有效地代谢为极性产物，并能有效地从体内清除。
代谢物为甲基-N-(((1-(4-氯苯基)吡唑-3-基)氧基]甲苯基)氨基甲酸酯 (BF 500-3)
主要代谢途径包括吡唑和其他环系的脱甲氧基化和羟基化，随后进行葡萄糖醛酸化。

毒性数据
LC50（大鼠）> 310 mg/m3/4h < 1,070 mg/m3/4h

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非人类毒性值
LC50 大鼠（Wistar雄性和雌性）皮肤接触 >2000 mg/kg 体重（无死亡）
LC50 大鼠（Wistar雄性和雌性）吸入（仅限头部和鼻腔），4 小时 >0.310 mg/L，<1.070 mg/L
LD50 大鼠（Wistar雄性和雌性）口服 >5000 mg/kg 体重（无死亡）

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非人类毒性值
LC50 大鼠（Wistar雄性和雌性）皮肤接触 >2000 mg/kg 体重（无死亡）
LC50 大鼠（Wistar雄性和雌性）吸入（仅限头部和鼻腔），4 小时>0.310 mg/L，<1.070 mg/L
大鼠（Wistar雄性和雌性）口服LD50 >5000 mg/kg体重（无死亡）

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人体毒性摘录
/体征和症状/ 吞咽可能致命。造成严重的暂时性眼损伤。造成皮肤刺激。经皮肤吸收有害。 /标题/

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非人类毒性摘录/实验动物：急性暴露/在Magnusson-Kligman最大化试验中，对20只豚鼠的左右肩部分别皮内注射（2 x 0.1 mL）以下物质：弗氏佐剂（溶于0.9%氯化钠水溶液，比例为1:1）、5%吡唑醚菌酯（溶于弗氏佐剂）和5%吡唑醚菌酯（溶于1% Tylose CB 30 000水溶液，简称Tylose）。注射24小时后评估注射部位。一周后，将 1 mL 5% 吡唑醚菌酯（溶于泰洛斯）涂抹于 2 × 4 cm 的纱布片上，然后局部涂抹于相同部位，之后用封闭敷料覆盖 48 小时，随后评估各部位的情况。第 22 天，所有动物均接受 0.5 mL 1% 吡唑醚菌酯（溶于泰洛斯）和泰洛斯（仅溶于泰洛斯）的攻击试验（右侧腹部），左侧腹部则涂抹泰洛斯。第 29 天进行第二次攻击试验，此时将试验物质涂抹于左侧腹部，将赋形剂涂抹于右侧腹部。移除封闭敷料后 24 小时和 48 小时，对所有攻击部位进行评估。试验期间无动物死亡，所有动物体重均正常增长。尽管皮内注射弗氏佐剂、5%吡唑醚菌酯弗氏佐剂溶液和5%吡唑醚菌酯泰洛斯溶液均导致所有动物出现中度融合性红斑（Draize评分=2）和肿胀，封闭式局部涂抹5%吡唑醚菌酯泰洛斯溶液也观察到类似情况，但首次和第二次使用1%吡唑醚菌酯泰洛斯溶液和单独使用泰洛斯溶液进行激发试验，在24小时或48小时后均未对任何动物产生任何影响。使用技术级α-己基肉桂醛（85%）和Lutrol E 400 DAB（Lutrol公司）作为阳性对照的试验证实了该方法的敏感性。在本研究中，吡唑醚菌酯对豚鼠没有皮肤致敏作用。
/实验动物：急性暴露/眼部刺激。将吡唑醚菌酯（0.1 mL；纯度 98.2%）滴入一只雄性新西兰白兔和五只雌性新西兰白兔的右眼结膜囊内。24 小时后，用自来水冲洗掉试验药物。左眼未接受治疗，作为对照。研究期间无动物死亡。所有动物在治疗后 3 天内均出现结膜充血（评分 1-3 分），其中 6 只兔子中有 5 只在治疗后 1 小时出现结膜肿胀（评分 1 分），6 只兔子中有 6 只在治疗后第 1 天出现结膜肿胀（平均评分 1.2 分），6 只兔子中有 3 只在治疗后第 2 天出现结膜肿胀（评分 1 分），6 只兔子中有 2 只在治疗后第 3 天出现结膜肿胀（评分 1 分）。6 只兔子中有 1 只在治疗后 1 小时出现结膜分泌物（评分 1 分）。未观察到角膜或虹膜反应，所有结膜反应均在第8天消退。6只兔子在治疗后第1天均出现眼睑边缘脱毛。在本研究条件下，吡唑醚菌酯对兔子的眼部刺激性较弱。[JMPR毒理学专著。食品中农药残留 - 2003 - 联合国粮农组织/世界卫生组织农药残留联合会议 吡唑醚菌酯。
/实验动物：急性暴露/口服给药。所有动物口服吡唑醚菌酯后均出现呼吸困难、步态蹒跚、竖毛和腹泻等临床症状，这些症状在第6天消退。未发现病理学改变。在一项以丙酮为溶剂的急性吸入研究中，浓度为1.070 mg/L和5.300 mg/L的所有动物均在暴露当天死亡。浓度为0.310 mg/L时，观察到两只雄性动物鼻腔流血、竖毛和毛发污渍（10只动物全部出现）。所有存活动物的症状均在第7天消退。当使用Solvesso作为溶剂时，浓度为7.3 mg/L时所有雄性动物和五只雌性动物中的四只死亡，而较低两个浓度下各有一只动物死亡。在浓度为 0.89 mg/L 时未出现死亡。
/实验动物：急性暴露/皮肤刺激：将未稀释的吡唑醚菌酯（500 mg，纯度 98.2%）涂抹于六只新西兰白兔背部/侧腹剃毛后的完整皮肤上，并用半封闭式绷带包扎 4 小时。暴露结束后，移除试验物质，并用聚乙二醇和水冲洗处理区域。未出现死亡。所有动物在移除绷带 1 小时后均出现红斑，大多数动物的红斑持续至第 8 天，三只动物的红斑持续至第 15 天。红斑的最高 Draize 评分为 3 分，第 1 天和第 8 天的平均评分分别为 2 分和 1.5 分。在第1天，6只兔子中有4只出现Draize评分1级的水肿，除2只兔子外，其余兔子的水肿在第8天均消退，但有1只兔子的水肿持续到第15天。由此得出结论，吡唑醚菌酯是一种轻微但持续时间较长的皮肤刺激剂。

[1]. Characterization of hepatotoxic effects induced by pyraclostrobin in human HepG2 cells and zebrafish larvae. Chemosphere, 2023, 340: 139732.
[2]. Acute and subchronic toxicity of pyraclostrobin in zebrafish (Danio rerio). Chemosphere, 2017, 188: 510-516.
[3]. Mitochondrial dysfunction-based cardiotoxicity and neurotoxicity induced by pyraclostrobin in zebrafish larvae. Environmental Pollution, 2019, 251: 203-211.

吡唑醚菌酯是一种氨基甲酸酯，是[2-({[1-(4-氯苯基)-1H-吡唑-3-基]氧基}甲基)苯基]甲氧基氨基甲酸的甲酯。它是一种杀菌剂，用于防治多种主要植物病原菌，包括小麦颖枯病菌（Septoria tritici）、柄锈菌属（Puccinia spp.）和小麦颖枯病菌（Pyrenophora teres）。它具有多种功能，包括作为线粒体细胞色素bc1复合物抑制剂、外源性物质、环境污染物和抗真菌农药。它属于吡唑类、氨基甲酸酯类、芳香醚类、单氯苯类、甲氧基氨基甲酸酯类抗真菌剂和氨基甲酸酯类杀菌剂。
已有报道称灵芝中存在吡唑醚菌酯，并有相关数据。
吡唑醚菌酯是一种广谱叶面杀菌剂，属于甲氧基甲酸酯类化学化合物。其作用机制是通过抑制线粒体呼吸，从而降低真菌细胞内可用的ATP含量。它可用于防治多种常见作物的真菌病害，包括：浆果、球根、葫芦科、结果类、根茎类蔬菜和樱桃。

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作用机制
吡唑醚菌酯属于甲氧基甲酸酯类杀菌剂。甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂通过阻断呼吸链内的电子传递来抑制线粒体呼吸，进而导致重要的细胞生化过程严重紊乱，最终抑制真菌生长。

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本研究发现，吡唑醚菌酯诱导的DNA损伤和线粒体功能障碍导致细胞内活性氧（ROS）过度生成，最终导致线粒体介导的细胞凋亡，并对HepG2细胞产生毒性作用。p62蛋白水平的降低以及LC3-II和Beclin-1蛋白的积累表明，吡唑醚菌酯可能诱导自噬。研究还发现，吡唑醚菌酯的细胞毒性与AMPK/mTOR介导的自噬和氧化性DNA损伤有关。此外，吡唑醚菌酯还能诱导斑马鱼肝损伤和肝脂肪变性。本研究表明，吡唑醚菌酯可导致人肝细胞的遗传毒性和斑马鱼幼体的肝毒性，这有助于更好地了解吡唑醚菌酯对人类安全的潜在风险，并为吡唑醚菌酯诱导肝毒性的机制提供理论基础。[1]

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本研究结果揭示了吡唑醚菌酯对斑马鱼（Danio rerio）造成的生化反应和DNA损伤。主要结论如下：
(1)吡唑醚菌酯对斑马鱼具有高毒性。
(2)吡唑醚菌酯可诱导斑马鱼肝脏的氧化应激和氧化损伤。
(3)本研究中最敏感的生物标志物是彗星试验获得的OTMs。
(4)在整个实验期间，吡唑醚菌酯在水生环境中相对稳定。

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本研究总体上证实了吡唑醚菌酯对斑马鱼幼体的线粒体毒性作用。一项新的发现是，吡唑醚菌酯会破坏幼体心脏和大脑的组织学和亚细胞结构，改变心肌收缩通路和神经相关基因及蛋白的表达水平，损害幼体的心脏功能和运动行为。这些变化可能是由吡唑醚菌酯诱导的线粒体功能障碍引起的。本研究结果有助于更好地理解吡唑醚菌酯对水生生物的毒性。[3]

C19H18CLN3O4

387.82

387.098

C, 58.84; H, 4.68; Cl, 9.14; N, 10.84; O, 16.50

175013-18-0

6422843

Off-white to light yellow solid powder

1.3±0.1 g/cm3

501.1±60.0 °C at 760 mmHg

63.7-65.2°

256.8±32.9 °C

0.0±1.3 mmHg at 25°C

1.592

4.25

65.82

0

5

7

27

476

0

COC(=O)N(C1=CC=CC=C1COC2=NN(C=C2)C3=CC=C(C=C3)Cl)OC

HZRSNVGNWUDEFX-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C19H18ClN3O4/c1-25-19(24)23(26-2)17-6-4-3-5-14(17)13-27-18-11-12-22(21-18)16-9-7-15(20)8-10-16/h3-12H,13H2,1-2H3

methyl N-[2-[[1-(4-chlorophenyl)pyrazol-3-yl]oxymethyl]phenyl]-N-methoxycarbamate

Pyraclostrobin; 175013-18-0; Pyraclostrobine; Headline; Cabrio; Pyrachlostrobin; BAS-500F; UNII-DJW8M9OX1H;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 本产品在运输和储存过程中需避光。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : 100 mg/mL (257.85 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (5.36 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (5.36 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。