Zapnometinib (PD0184264; ATR-002)

MEK (IC50 = 5.7 nM)
Zapnometinib targets mitogen-activated protein kinase kinase (MAP2K; MAPK/ERK kinase; MEK). It is a potent, non-ATP-competitive inhibitor of MEK1/2, targeting the central Raf/MEK/ERK signaling pathway. The compound selectively binds to and inhibits the activity of MEK.

在A549细胞、MDCK细胞和人外周血单核细胞（PBMC）中，扎普诺替尼（0.1 nM-1 μM）分别以30.96 nM、357 nM和15 nM的IC50值抑制MEK[1]。在人PBMC中，扎普诺替尼（100 μM；4小时）抑制离子霉素（PMA/I）诱导的ERK1/2磷酸化[1]。扎普诺替尼（1-100 μM）可降低H3N2和IV H1N1pdm09病毒的滴度[1]。在人外周血单核细胞中，扎普诺替尼（100 μM；4 小时）可抑制离子霉素引起的 ERK1/2 磷酸化。扎普诺替尼（1-100 μM）可降低 H3N2 和 H1N1pdm09 病毒滴度。

扎普诺替尼（8.4–75 mg/kg/天；每日三次口服）可降低小鼠肺部病毒滴度，并提高其在致命性H1N1pdm09感染后的存活率[1]。静脉注射或口服扎普诺替尼（150 mg/kg）后，小鼠的AUC值分别为860.02和1953.68 μg·h/mL[1]。扎普诺替尼（8.4–75 mg/kg/天；每日三次口服）可降低小鼠肺部病毒滴度，并提高其在致命性H1N1pdm09感染后的存活率。当剂量为75 mg/kg/天或25 mg/kg/天时，病毒滴度显著降低。

无细胞激酶活性测定：[1]
将96孔微孔板用单克隆抗ERK（细胞外信号调节激酶）抗体包被，抗体稀释度为1:1000（100 μl/孔），包被液为TBST缓冲液（50 mM Tris-HCl，0.9% NaCl，0.05% Tween 20），包被时间过夜。用100 μl/孔TBST缓冲液洗涤（3次，每次5分钟）后，加入100 μl/孔1% BSA的PBS溶液，室温封闭60分钟。加入激酶反应样品（见下文）前，再次洗涤微孔板。为了测定抑制剂的IC50值，配制了最终测试浓度（DMSO溶液中浓度分别为1 μM、500 nM、100 nM、50 nM、10 nM、5 nM、1 nM、0.5 nM和0.1 nM）。活性GST c-Raf1-DD在杆状病毒感染的SF9细胞中表达，而GST-MEK1和His-ERK2在大肠杆菌中表达。GST标签蛋白通过与谷胱甘肽琼脂糖珠结合进行纯化，His标签ERK2则通过镍螯合柱进行纯化。将三种纯化的重组激酶按 3:2:3 的比例混合于激酶缓冲液（10 mM MgCl₂、25 mM β-甘油磷酸钠、25 mM HEPES；pH 7.5、5 mM 苯甲脒、0.5 mM 二硫苏糖醇、1 mM 钒酸钠）和 DMSO/抑制剂中，并在室温下避光预孵育。随后加入 10 mM ATP，继续孵育 30 分钟。为终止激酶反应，加入 20% SDS 溶液，于 50°C 孵育 10 分钟，然后用封闭缓冲液（1% BSA 的 TBST 溶液）进一步稀释。最后，将各样品 100 μl 加入到预先包被抗 ERK 抗体的 96 孔微孔板中。将激酶反应样品在预先包被抗ERK抗体的96孔微孔板中，用BSA封闭，室温孵育60分钟。为检测磷酸化ERK，将样品与抗磷酸化ERK（p44/p42）抗体于4℃孵育过夜，随后加入用TBST缓冲液稀释的辣根过氧化物酶标记的抗小鼠IgG特异性抗体，室温孵育60分钟。之后，洗涤微孔板，并用ABTS底物溶液孵育30分钟。反应用 20% SDS 溶液终止，然后用酶标仪在 405 nm 处测量光密度值。

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A549、MDCK 细胞和人外周血单核细胞 (PBMC) 的激酶活性测定：[1]
A549 和 MDCK II 细胞培养于含 10% FBS（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）、100 U/mL 青霉素、100 µl/mL 链霉素和 1% L-谷氨酰胺的 IMDM 培养基中。然后，将 4×10⁵ 个 A549 或 MDCK II 细胞接种于 24 孔板中过夜，然后在不含 FBS 的 IMDM 培养基中饥饿培养 24 小时。饥饿处理后，用 20 ng/ml 肿瘤坏死因子-(TNF) 刺激细胞 30 分钟，然后用不同浓度的 CI-1040 或 Zapnometinib (PD0184264; ATR-002) 溶于 DMSO 中处理 1 小时。为了测定 CI-1040 和 Zapnometinib (PD0184264; ATR-002) 在 MDCK II 细胞中的 IC50 值，我们使用了 12 个浓度梯度（两倍稀释）的测试溶液（CI-1040：6.25 μM 至 3 nM；Zapnometinib (PD0184264; ATR-002)：25 μM 至 12 nM）。为了测定 CI-1040 和 Zapnometinib (PD0184264; ATR-002) 在 A549 细胞中的 IC50 值，我们制备了 12 个浓度梯度（两倍稀释）的测试溶液（CI-1040：3.07 μM 至 1.5 nM；Zapnometinib (PD0184264; ATR-002)：25 μM 至 12 nM）。 ATR-002)：30.72 µM 至 15 nM）。孵育结束后立即用冰冷的 PBS 洗涤细胞两次以终止处理。将细胞置于冰上，用冰冷的改良 RIPA 缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.4；1% NP-40；0.25% 脱氧胆酸钠；150 mM NaCl）裂解细胞，该缓冲液中添加了 Complete 蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂混合物。裂解液短暂超声处理后，于 4°C 下以 18,000 × g 离心 5 分钟。人外周血单核细胞 (PBMC) 通过 Ficoll 密度梯度离心法从新鲜血液中分离，然后在含有 10% 自体血清、100 U/mL 青霉素的 RPMI 1640 培养基中培养。 100 µg/mL 链霉素和 1% L-谷氨酰胺。然后将 5×10⁶ 个培养的 PBMC 接种于 24 孔板中，并用 100 ng/mL 佛波醇 12-肉豆蔻酸酯 13-乙酸酯 (PMA) 和 1 µg/mL 离子霉素 (I) 刺激 4 小时。为了确定 CI-1040 和 Zapnometinib (PD0184264; ATR-002) 对人 PBMC 的 IC50 值，制备了 12 个浓度梯度为两倍稀释的测试溶液（CI-1040：200 nM 至 0.097 nM；Zapnometinib (PD0184264; ATR-002)：780 nM 至 0.38 nM）。处理停止实验后，按照A549/MDCK细胞的实验步骤继续进行。所有样品均用于蛋白质印迹分析。
体外酶活性测定采用重组MEK酶来测量MEK抑制情况。IC50值通过评估不同浓度扎普诺替尼对MEK活性的抑制作用来确定。选择性通过与其他激酶的比较来验证。

Western Blot 分析[1]
细胞类型： 人外周血单核细胞 (PBMC)
测试浓度： 100 μM
孵育时间： 4 小时
实验结果： 抑制离子霉素 (PMA/I) 增加的 pERK1/2。

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子代病毒抑制试验[1]
将上述 IAV 毒株以相应的 MOI 接种到 A549 细胞中，接种液为磷酸盐缓冲液 (PBS)，并添加 0.2% (w/v) 牛血清白蛋白、1 mM MgCl2、0.5 mM CaCl2、100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素，在 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育 45 分钟。去除接种物后，用PBS冲洗细胞，并加入1 mL IV感染培养基（Dulbecco改良Eagle培养基；DMEM，添加0.2% BSA、1 mM MgCl2、0.5 mM CaCl2、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素和2 μg/mL TPCK处理的胰蛋白酶，以及不同浓度的CI-1040或ATR-002（100 μM、50 μM、10 μM、5 μM、1 μM、0.5 μM和0.1 μM，最终DMSO浓度为1%，在37 °C、5% CO2条件下培养24小时）。

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细胞活力检测（WST法）[1]
将A549细胞、MDCK细胞和人外周血单核细胞（PBMC）接种于将细胞接种于96孔平底组织培养板中，并按照2.2节所述方法培养过夜。之后，用不同浓度的ATR-002（100 μM、50 μM、10 μM、5 μM、1 μM、0.5 μM和0.1 μM）处理细胞，ATR-002溶于100 μl含5% FBS的IMDM培养基中，DMSO终浓度为1% (v/v)。细胞在37 °C、5% CO2条件下培养24小时。之后，向培养基中加入10 μl WST-1试剂，孵育4小时。随后，使用酶标仪在405 nm波长处定量检测生成的甲臜染料。
基于细胞的检测使用A549细胞、MDCK细胞和人外周血单核细胞(PBMC)来检测MEK抑制。Western blot分析用于评估MEK的磷酸化水平。 ERK1/2。通过测量用扎普诺替尼（1-100 μM）处理的感染细胞培养物中的病毒滴度来评估抗病毒活性。

动物/疾病模型：雌性C57BL/6小鼠（8周龄；21-24克）感染H1N1pdm09[1]
剂量：8.4、25、75毫克/公斤/天（2.8、8.4、25毫克/公斤）
给药途径：口服，每日三次
实验结果：75毫克/公斤/天或25毫克/公斤/天的剂量均显著降低了病毒滴度。

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用于药代动力学分析的化合物制备[1]
静脉给药时，将30.65毫克CI-1040溶解于0.075毫升DMSO中，并用0.225毫升Cremophor EL和2.7毫升PBS进一步稀释。接下来，将34.88 mg ATR-002溶解于0.075 mL DMSO中，并用0.225 mL Cremophor EL和2.7 mL PBS进一步稀释。对于口服给药，将202.5 mg CI-1040溶解于0.5 mL DMSO、1.5 mL Cremophor EL和8.0 mL PBS中。因此，将 81.0 mg 的 Zapnometinib (PD0184264; ATR-002) 溶解于 0.2 mL DMSO、0.6 mL Cremophor EL 和 3.2 mL PBS 中。

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制备化合物以研究小鼠肺部病毒滴度的降低[1]
对于 25 mg Zapnometinib (PD0184264; ATR-002)/kg 体重的口服给药，将 10 mg ATR-002 溶解于 50 μl DMSO 中，并用 0.15 mL Cremophor EL 和 0.8 mL PBS 进一步稀释。对于 8.4 mg/kg 和 2.8 mg/kg 的应用剂量，将 3.36 mg 或 1.12 mg ATR-002 溶解于 50 μl DMSO 中，并用 0.15 mL Cremophor EL 和 0.8 mL PBS 进一步稀释。此外，将 202.5 mg CI-1040 溶解于 0.5 mL DMSO、0.15 mL Cremophor EL 和 0.8 mL PBS 中。
在感染 H1N1pdm09 的雌性 C57BL/6 小鼠（8 周龄；21-24 g）中评估体内疗效。Zapnometinib 每日口服三次，剂量分别为 8.4、25 和 75 mg/kg/天。测量肺部病毒滴度和存活率。

扎普诺替尼具有口服生物利用度。在小鼠中，静脉注射或口服扎普诺替尼（150 mg/kg）后，其AUC值分别为860.02和1953.68 μg·h/mL。它是CI-1040的活性代谢物。

扎普诺替尼的临床前毒性数据有限。作为一种MEK抑制剂，它可能具有同类药物常见的毒性，包括胃肠道、皮肤和眼部不良反应。应遵循标准的实验室安全预防措施。详细的毒理学特征可参考相关文献。

[1]. Antiviral efficacy against influenza virus and pharmacokinetic analysis of a novel MEK-inhibitor, ATR-002, in cell culture and in the mouse model. Antiviral Res. 2020 Jun;178:104806.

[2]. Improved in vitro Efficacy of Baloxavir Marboxil Against Influenza A Virus Infection by Combination Treatment With the MEK Inhibitor ATR-002. Front Microbiol. 2021 Feb 12;12:611958.

[3]. Metabolic conversion of CI-1040 turns a cellular MEK-inhibitor into an antibacterial compound. Sci Rep. 2018 Jun 14;8(1):9114.

扎普诺替尼是一种小分子丝裂原活化蛋白激酶激酶（MAP2K；MAPK/ERK激酶；MEK）抑制剂，具有较高的口服生物利用度，并具有潜在的抗病毒和抗炎活性。口服后，扎普诺替尼选择性地结合并抑制MEK活性。这可能阻止病毒基因组蛋白复合物从细胞核输出到细胞质，从而抑制新病毒颗粒的形成和多种RNA病毒的复制，包括流感病毒、汉坦病毒、呼吸道合胞病毒（RSV）和严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）。此外，抑制MEK活性还可以降低基因表达，并抑制促炎细胞因子和趋化因子的产生，包括肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、白细胞介素 (IL)-1β、IL-8、CXC基序趋化因子10（干扰素-γ诱导蛋白10；IP-10）、CC基序趋化因子2（单核细胞趋化因子-1；MCP-1）和CC基序趋化因子3（巨噬细胞炎症蛋白1-α；MIP-1α），从而减轻炎症。MEK是双特异性苏氨酸/酪氨酸激酶家族的成员，在RAS/RAF/MEK/ERK信号通路的激活中起着至关重要的作用。许多RNA病毒依赖此途径在人体细胞内复制。
Zapnometinib是CI-1040的生物活性代谢物，是一种强效的MEK抑制剂，具有抗流感病毒活性。它已显示出降低H1N1pdm09感染小鼠模型肺部病毒滴度和提高存活率的疗效。目前，该化合物正被研究用于治疗病毒感染和炎症性疾病。

C13H7CLF2INO2

409.55

408.918

C, 38.13; H, 1.72; Cl, 8.66; F, 9.28; I, 30.99; N, 3.42; O, 7.81

303175-44-2

10112191

Off-white to gray solid powder

4.737

49.33

2

5

3

20

363

0

XCNBGWKQXRQKSA-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C13H7ClF2INO2/c14-8-5-6(17)1-4-10(8)18-12-7(13(19)20)2-3-9(15)11(12)16/h1-5,18H,(H,19,20)

2-(2-chloro-4-iodoanilino)-3,4-difluorobenzoic acid

zapnometinib; 2-(2-chloro-4-iodophenylamino)-3,4-difluorobenzoic acid; ATR-002; Zapnometinib [INN]; PD-0184264; Benzoic acid, 2-[(2-chloro-4-iodophenyl)amino]-3,4-difluoro-; 4RZD8LK83V;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 本产品在运输和储存过程中需避光。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : 62.5 mg/mL (152.61 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (5.08 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (5.08 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。