Zapnometinib (PD0184264; ATR-002)

MEK (IC50 = 5.7 nM)

在 A549、MDCK 细胞和人 PBMC 中，zapnometinib (0.1 nM-1 μM) 抑制 MEK，IC50 分别为 30.96 nM、357 nM 和 15 nM[1]。在人 PBMC 中，zapnometinib（100 μM；4 小时）可抑制离子霉素 (PMA/I) 引起的 ERK1/2 磷酸化 [1]。 zapnometinib (1-100 μM) 可降低 H3N2 和 IV H1N1pdm09 病毒滴度 [1]。

Zapnometinib（8.4–75 mg/kg/天；每天口服 3 次）可降低致命 H1N1pdm09 感染后的肺部病毒滴度并提高小鼠的存活率 [1]。 Zapnometinib (150 mg/kg) 静脉内或口服给予小鼠的 AUC 值分别为 860.02 和 1953.68 μg?h/mL [1]。

无细胞激酶活性测定：[1]
用单克隆抗ERK（细胞外信号调节激酶）抗体在TBST（50 mM Tris-HCl，0.9%NaCl，0.05%吐温20）中以1:1000（100μl/孔）的稀释液涂覆96孔微量滴定板过夜。用100μl/孔TBST洗涤（3×5分钟）后，在室温下用100μl/min的1%BSA PBS溶液封闭孔60分钟。在加入激酶反应样品（见下文）之前，再次洗涤板。为了确定抑制剂的IC50值，制备了最终的测试浓度（DMSO中的1μM、500 nM、100 nM、50 nM、10 nM、5 nM、1 nM、0.5 nM和0.1 nM）。活性GST c-Raf1-DD在杆状病毒感染的SF9细胞中表达，而GST-MEK1和His-ERK2在大肠杆菌中表达。通过与谷胱甘肽琼脂糖珠结合纯化GST标记的蛋白质，并在镍螯合柱上纯化His标记的ERK2。将三种纯化的重组激酶以3:2:3的比例在激酶缓冲液（10 mM MgCl2，25 mMβ-甘油磷酸，25 mM HEPES；pH 7.5，5 mM苯甲脒，0.5 mM二硫苏糖醇，1 mM钒酸钠）和DMSO/抑制剂中混合，并在室温下在黑暗中预孵育，然后加入10 mM ATP并进一步孵育30分钟。为了停止激酶反应，在50°C下加入20%SDS溶液10分钟，并用阻断缓冲液（TBST中1%BSA）进一步稀释。接下来，将100μl的每个样品加入到抗ERK涂层的96孔微量滴定板中。将激酶反应样品在室温下在用BSA封闭的抗ERK包被的96孔微量滴定板中孵育60分钟。为了检测磷酸化ERK，将样品在4°C下用抗磷酸ERK（p44/p42）抗体孵育过夜，然后用稀释在TBST缓冲液中的辣根过氧化物酶抗小鼠IgG特异性抗体在室温下孵育60 min。然后，洗涤平板并用ABTS底物溶液孵育30 min。用20%SDS溶液终止反应，然后用ELISA阅读器测量405nm处的光密度。

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A549、MDCK细胞和人外周血单个核细胞中的激酶活性测定：[1]
A549和MDCK II细胞在含有10%FBS、100U/mL青霉素、100µl/mL链霉素和1%l-谷氨酰胺的IMDM中培养。接下来，将4×105 A549或MDCK II细胞接种在24孔板中过夜，然后在含有0%FBS的IMDM中饥饿24小时。饥饿后，用20 ng/ml肿瘤坏死因子（TNF）刺激细胞30分钟，然后用溶解在DMSO中的不同浓度的CI-1040或Zapnometinib（PD0184264；ATR-002) 5μM至3 nM；Zapnometinib（PD0184264；ATR-002）：25μM至12 nM。为了确定CI-1040和Zapnometinib（PD0184264；ATR-002）对A549细胞的IC50值，在两倍稀释步骤中制备了12个测试浓度（CI-1040:3.07μM至1.5 nM；Zapnometinib（PD0184274；ATR-2002）:30.72μM至15 nM）。孵育时间结束后，用冰冷的PBS洗涤细胞两次，立即停止治疗。细胞在冰冷的改良RIPA缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.4；1%NP-40；0.25%脱氧胆酸钠；150 mM NaCl）中在冰上裂解，补充有完全蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂混合物。裂解物被短暂超声处理，并在4°C下以18000×g离心5分钟。通过Ficoll密度梯度分离法从新鲜血液中分离出人外周血单核细胞（PBMCs），然后在含有10%自体血清、100 U/mL青霉素、100µg/mL链霉素和1%L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中培养。然后，将5x106的培养的PBMC接种在24孔板中，用100 ng/mL的佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯（PMA）和1µg/mL的离子霉素（I）刺激4小时。为了确定CI-1040和Zapnometinib/扎诺替尼（PD0184264；ATR-002）对人PBMC的IC50值，制备了12个两倍稀释步骤的测试浓度（CI-1040:200 nM至0.097 nM；Zapnometinib（PD0184244；ATR-2002）:780 nM至0.38 nM）。停止治疗，按照A549/MDCK细胞的描述继续手术。所有样本均留作蛋白质印迹分析。

蛋白质印迹分析[1]
细胞类型： 人 PBMC
测试浓度： 100 μM
孵育时间： 4 h
实验结果：抑制离子霉素(PMA/I)增加的pERK1/2。

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后代病毒抑制试验[1]
在37°C和5%CO2下，用上述IAV菌株在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中制备的相应MOI接种A549细胞，该PBS补充了0.2%（w/v）牛血清白蛋白、1 mM MgCl2、0.5 mM CaCl2、100 U/mL青霉素、100μg/mL链霉素，持续45分钟。移除接种物，用PBS冲洗细胞，并补充1 mL IV感染培养基（Dulbecco's Modified Eagle Medium；DMEM补充了0.2%BSA、1 mM MgCl2、0.5 mM CaCl2、100 U/mL青霉素、100μg/mL链霉素和2μg/mL TPCK处理的胰蛋白酶，含有不同浓度的CI-1040或ATR-002（100μM、50μM、10μM、5μM、1μM、0.5μM和0.1μM，DMSO终浓度为1%，在37°C、5%CO2中24小时）。

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细胞活力测定（WST测定）[1]
将A549细胞、MDCK细胞和人PBMC接种在96孔平底组织板中并如第2.2节所述生长过夜。此后，用不同浓度的ATR-002（100μM、50μM、10μM、5μM、1μM、0.5μM和0.1μM）处理细胞，ATR-002溶解在100μl IMDM中，IMDM补充了5%FBS，DMSO终浓度为1%（v/v）。将细胞在37°C和5%CO2中培养24小时。此后，将10μl WST-1试剂加入培养基中并孵育4小时。之后，在405 nm的ELISA平板读数器上定量形成的甲赞染料。

Animal/Disease Models: Female C57BL/6 mice (8 weeks; 21-24 g) were infected with H1N1pdm09[1]
Doses: 8.4, 25, 75 mg/ kg/day (2.8, 8.4, 25 mg/kg)
Route of Administration: Po three times a day
Experimental Results: Dramatically diminished the virus titer at the dose of either 75 mg/kg/day or 25 mg/kg/day.

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Preparation of compounds for pharmacokinetic analysis[1]
For i.v. administration, 30.65 mg CI-1040 was dissolved in 0.075 mL DMSO and further diluted with 0.225 mL Cremophor EL and 2.7 mL PBS. Next, 34.88 mg ATR-002 was dissolved in 0.075 mL DMSO and further diluted with 0.225 mL Cremophor EL and 2.7 mL PBS. For oral administration 202.5 mg CI-1040 was dissolved in 0.5 mL DMSO, 1.5 mL Cremophor EL, and 8.0 mL PBS. Accordingly, 81.0 mg Zapnometinib (PD0184264; ATR-002)  was dissolved in 0.2 mL DMSO, 0.6 mL Cremophor EL, and 3.2 mL PBS.

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Preparation of compounds to investigate virus titer reduction in the lungs of mice[1]
For oral application of 25 mg Zapnometinib (PD0184264; ATR-002) /kg bodyweight, 10 mg of ATR-002 was dissolved in 50 μl DMSO and further diluted with 0.15 mL Cremophor EL and 0.8 mL PBS. For application of 8.4 mg/kg and 2.8 mg/kg, 3.36 mg or 1.12 mg ATR-002 was dissolved in 50 μl DMSO and further diluted with 0.15 mL Cremophor EL and 0.8 mL PBS. Additionally, 202.5 mg CI-1040 was dissolved in 0.5 mL DMSO, 0.15 mL Cremophor EL, and 0.8 mL PBS.

[1]. Antiviral efficacy against influenza virus and pharmacokinetic analysis of a novel MEK-inhibitor, ATR-002, in cell culture and in the mouse model. Antiviral Res. 2020 Jun;178:104806.

[2]. Improved in vitro Efficacy of Baloxavir Marboxil Against Influenza A Virus Infection by Combination Treatment With the MEK Inhibitor ATR-002. Front Microbiol. 2021 Feb 12;12:611958.

[3]. Metabolic conversion of CI-1040 turns a cellular MEK-inhibitor into an antibacterial compound. Sci Rep. 2018 Jun 14;8(1):9114.

Zapnometinib is an orally bioavailable, small molecule inhibitor of mitogen-activated protein kinase kinase (MAP2K; MAPK/ERK kinase; MEK), with potential anti-viral and anti-inflammatory activities. Upon oral administration, zapnometinib selectively binds to and inhibits the activity of MEK. This may prevent the export of the viral genome protein complexes from the nucleus to the cytoplasm, thereby inhibiting the formation of new viral particles and the replication of various RNA viruses, including influenza virus, hantavirus, respiratory syncytial virus (RSV) and severe acute respiratory syndrome coronavirus-2 (SARS-CoV-2). In addition, the inhibition of the activity of MEK may also decrease gene expression and inhibit the production of proinflammatory cytokines and chemokines, including tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha), interleukin (IL)-1-beta, IL-8, C-X-C motif chemokine 10 (interferon gamma-induced protein 10; IP-10), C-C motif chemokine 2 (monocyte chemoattractant protein-1; MCP-1) and C-C motif chemokine 3 (macrophage inflammatory protein 1-alpha; MIP-1a), thereby reducing inflammation. MEK, a dual-specificity threonine/tyrosine kinase family, plays a key role in the activation of the RAS/RAF/MEK/ERK signaling pathway. Many RNA viruses rely on this pathway inside human cells to replicate.

C13H7CLF2INO2

409.55

408.918

C, 38.13; H, 1.72; Cl, 8.66; F, 9.28; I, 30.99; N, 3.42; O, 7.81

303175-44-2

10112191

Off-white to gray solid powder

4.737

49.33

2

5

3

20

363

0

XCNBGWKQXRQKSA-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C13H7ClF2INO2/c14-8-5-6(17)1-4-10(8)18-12-7(13(19)20)2-3-9(15)11(12)16/h1-5,18H,(H,19,20)

2-(2-chloro-4-iodoanilino)-3,4-difluorobenzoic acid

zapnometinib; 2-(2-chloro-4-iodophenylamino)-3,4-difluorobenzoic acid; ATR-002; Zapnometinib [INN]; PD-0184264; Benzoic acid, 2-[(2-chloro-4-iodophenyl)amino]-3,4-difluoro-; 4RZD8LK83V;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 本产品在运输和储存过程中需避光。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : 62.5 mg/mL (152.61 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (5.08 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (5.08 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。