A-740003

P2X7 receptor – IC50 = 18 nM (rat P2X7, calcium influx assay); IC50 = 40 nM (human P2X7, calcium influx assay); IC50 = 92 nM (pore formation in differentiated human THP-1 cells); IC50 = 156 nM (agonist-evoked IL-1β release in differentiated human THP-1 cells); pIC50 = 7.36 (human P2X7, calcium influx), 7.74 (rat P2X7, calcium influx), 6.14-7.03 (mouse P2X7 BALB/c and C57BL/6, Yo-Pro uptake), 6.17-6.57 (mouse P2X7, calcium influx); shows weak or no activity (IC50 > 10 μM) at other P2 receptors and an array of other neurotransmitter and peptide receptors, ion channels, reuptake sites, and enzymes [2][3][4]
Selective over other P2X receptors (P2X1, P2X2, P2X2/3, P2X4), P2Y1, P2Y2 (IC50 > 10 μM) [3][4]
P2X7 receptor (human P2X7 pIC50 = 7.36 for Ca2+ influx; rat P2X7 pIC50 = 7.74 for Ca2+ influx; mouse P2X7 BALB/c pIC50 = 6.57, C57BL/6 pIC50 = 6.17 for Ca2+ influx) [3]
P2X7 receptor (human P2X7 pIC50 = 7.03 for Yo-Pro uptake; rat P2X7 pIC50 = 7.00 for Yo-Pro uptake; mouse P2X7 BALB/c pIC50 = 6.14, C57BL/6 pIC50 = 5.76 for Yo-Pro uptake) [3]
P2X7 receptor (blocks BzATP-induced sustained phase of proton efflux in MC3T3-E1 osteoblast-like cells) [1]
P2X7 receptor (inhibits SE-induced TNF-α expression in dentate granule cells) [2]
P2X7 receptor (antagonizes thermal hyperalgesia and P2X7R expression in neck-incision pain model) [5]

体外实验：A-740003 能有效阻断 BzATP 诱导的稳定表达大鼠 P2X7 受体（IC50 = 18 nM）或人 P2X7 受体（IC50 = 40 nM）的 1321N1 细胞内钙离子浓度变化。相比之下，PPADS、亮蓝 G 和 KN-62 的效力显著较低。[4]
A-740003 能有效阻断分化的人 THP-1 细胞中激动剂诱导的 IL-1β 释放（IC50 = 156 nM）和孔道形成（Yo-Pro 摄取）（IC50 = 92 nM）。 [4]
A-740003 在其他 P2 受体（P2X1、P2X2、P2X2/3、P2X4、P2Y1、P2Y2）以及一系列其他神经递质和肽受体、离子通道、再摄取位点和酶上均表现出较弱或无活性（IC50 > 10 μM）。 [4] 在1321N1细胞中表达的重组小鼠P2X7受体（BALB/c和C57BL/6）中，A-740003阻断了BzATP刺激的钙离子内流，pIC50值分别为6.57 ± 0.04（BALB/c）和6.17 ± 0.05（C57BL/6），并阻断了Yo-Pro的摄取，pIC50值分别为6.14 ± 0.04（BALB/c）和5.76 ± 0.03（C57BL/6）。[3] A-740003阻断了大鼠P2X7受体上BzATP刺激的钙离子内流，pIC50值为7.74 ± 0.02；阻断了人P2X7受体上BzATP刺激的钙离子内流，pIC50值为7.36 ± 0.01。 [3] 预孵育 60 分钟后，A-740003 可阻断大鼠 P2X7 受体的钙离子内流，pIC50 值为 7.92 ± 0.04；阻断人 P2X7 受体的钙离子内流，pIC50 值为 7.28 ± 0.03；阻断 BALB/c 小鼠 P2X7 受体的钙离子内流，pIC50 值为 6.26 ± 0.04；阻断 C57BL/6 小鼠 P2X7 受体的钙离子内流，pIC50 值为 6.48 ± 0.03。[3] 当加入 A-438079 或 A-740003 (10 μM) 时，BzATP 感应反应的持续相中会出现明显的沸腾现象 [1]。输注 A-740003 后，齿状颗粒细胞中由 SE 介导的 TNF-α 表达减少。在SE传感器中，A-740003输注可增加神经元死亡[2]。与其他钳制拮抗剂相比，A-740003和A-438079在所有物种中均表现出更高的P2X7受体激活效力。与Muse P2X7受体相比，A-740003和A-438079在储存和人体内均表现出更高的活性[3]。在哺乳期人THP-1细胞中，A-740003可有效抑制激动剂诱导的IL-1β释放（IC50=156 nM）和孔道形成（IC50=92 nM）[4]。

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通过微生理测定法测得，A-740003（10 μM）可显著阻断MC3T3-E1成骨细胞样细胞中BzATP诱导的质子外流的持续阶段。持续期以BzATP应用后12-30分钟内质子外流相对于基础水平的平均增加量来量化。A-740003在BzATP刺激前6分钟和刺激期间应用。[1]
A-740003能够强效且选择性地阻断哺乳动物（人、大鼠、BALB/c小鼠、C57BL/6小鼠）的P2X7受体介导的钙离子内流。与小鼠P2X7相比，A-740003对大鼠和人P2X7受体的效力更高。A-740003还能以浓度依赖的方式阻断P2X7受体介导的Yo-Pro摄取，在大鼠和人受体上的效力相似或略高。浓度高达100 μmol·L⁻¹时，A-740003对人P2X1、P2X2、P2X2/3、P2X4、P2Y1或P2Y2受体均无显著抑制活性。 [3]
在癫痫持续状态后，大鼠脑室内注射A-740003 (10 μM) 可阻止CA3神经元中TNFp75R免疫反应性的增加，并阻止NF-κB p65-Ser276和p65-Ser311磷酸化的增加。[2]
在颈部切口疼痛大鼠中，腹腔注射A-740003 (142 mg/kg) 可拮抗电针诱导的热缩足潜伏期延长，并在切口后24小时降低颈髓中P2X7R蛋白的表达。[5]

体内实验：在脊神经结扎（SNL）大鼠模型中，全身给药A-740003可产生剂量依赖性的镇痛作用（ED50 = 19 mg/kg，腹腔注射）。[4]
A-740003可减轻另外两种神经病理性疼痛模型中的触觉异常性疼痛：坐骨神经慢性压迫损伤（CCI）和长春新碱诱导的神经病变。[4]
A-740003可有效降低足底注射角叉菜胶（ED50 = 38 mg/kg，腹腔注射）或弗氏完全佐剂（CFA）（ED50 = 54 mg/kg，腹腔注射）后观察到的热痛觉过敏。[4]
A-740003不能减轻正常大鼠的急性热痛觉，且在镇痛剂量下不影响运动功能。 [4] 在大鼠颈部切口疼痛模型中，腹腔注射A-740003（142 mg/kg）在切口后4小时即可产生镇痛作用。切口后24小时，单独使用A-740003无效，但可拮抗电针镇痛作用。A-740003还可阻断电针诱导的P2X7R蛋白表达在4小时时的上调，以及电针诱导的P2X7R蛋白表达在24小时时的下调。[5] 酶活性测定：钙离子内流FLIPR测定：将稳定表达P2X7受体的1321N1细胞接种于聚赖氨酸包被的96孔板中，并用Fluo-4染料进行染色。染色后，用DPBS洗涤去除细胞外Fluo-4。化合物溶液用DPBS配制。激动剂（BzATP）诱导的Ca²⁺动态变化记录3分钟。拮抗剂活性测定中，将化合物加入细胞培养板，并在加入激动剂前收集3分钟的荧光数据。使用GraphPad Prism分析浓度-反应数据，计算pIC50值。[3][4]
Yo-Pro摄取实验（孔道形成）：将表达P2X7受体的1321N1细胞接种于聚赖氨酸包被的黑色96孔板中。用不含Mg²⁺或Ca²⁺离子的PBS缓冲液冲洗细胞两次。在加入激动剂前立即加入Yo-Pro碘化物染料（终浓度2 μM），并测量染料摄取1小时。拮抗剂与Yo-Pro染料同时加入。对于拮抗剂活性，最大强度百分比以 BzATP 峰值激活进行标准化，并绘制成图，以化合物浓度为横坐标，计算 IC50 值。[3][4]
IL-1β 释放测定：使用分化的人类 THP-1 细胞。在 A-740003 存在下测量激动剂诱导的 IL-1β 释放。[4]

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在串联神经结扎模型中，全身给药的 A-740003 显示出剂量依赖性的抗损伤作用（ED50=19 mg/kg，腹腔注射）。此外，A-740003 可减轻坐骨神经慢性缺血和其他两种类型的神经性疼痛。此外，在角叉菜胶或弗氏佐剂足底模型中，A-740003 成功且完全消除了热痛觉过敏（ED50=38-54 mg/kg，腹腔注射）。 A-740003 在镇痛剂量下不影响运动能力，且不能降低正常状态下的急性热痛觉感受器活性[4]。

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在大鼠颈部切口疼痛模型中，于4小时热痛测试前0.5小时腹腔注射A-740003（142 mg/kg），在切口后4小时表现出镇痛作用，但在切口后24小时无效。切口后24小时，A-740003拮抗了电针（EA）诱导的镇痛作用。A-740003还拮抗了切口后4小时电针诱导的颈髓P2X7R蛋白表达增加和切口后24小时电针诱导的P2X7R蛋白表达降低。 [5] 在接受毛果芸香碱诱导的癫痫持续状态的大鼠中，脑室内输注 A-740003（10 μM，溶于 0.001% DMSO/生理盐水，0.5 μl/小时，持续 2 周）可增加 CA3 区癫痫持续状态引起的神经元损伤（Fluoro-Jade B 阳性神经元数量）（至 129,345 ± 7,138），而生理盐水输注组为 69,469 ± 4,367。A-740003 输注还可抑制 CA3 神经元中 p65-Ser276 和 p65-Ser311 NF-κB 磷酸化的增加，并抑制癫痫持续状态后 CA3 神经元中 TNFp75R 免疫反应性的增加。 A-740003 不影响癫痫发作阈值（癫痫发作潜伏期：743 秒 vs 生理盐水组 768 秒）。[2]

酶活性测定：钙离子内流 FLIPR 测定：将稳定表达 P2X7 受体的 1321N1 细胞接种于聚赖氨酸包被的 96 孔板中，并用 Fluo-4 染料进行染色。染色后，用 DPBS 洗涤去除细胞外 Fluo-4。化合物溶液用 DPBS 配制。记录激动剂 (BzATP) 诱导的 Ca²⁺ 动态变化 3 分钟。对于拮抗剂活性测定，在加入激动剂前，将化合物加入细胞板中并收集 3 分钟的荧光数据。使用 GraphPad Prism 分析浓度-反应数据以计算 pIC50 值。[3][4]
Yo-Pro 摄取测定（孔道形成）：将表达 P2X7 受体的 1321N1 细胞接种于聚赖氨酸包被的黑色壁 96 孔板中。细胞用不含Mg²⁺或Ca²⁺离子的PBS缓冲液洗涤两次。在加入激动剂前立即加入Yo-Pro碘化物染料（终浓度2 μM），并测量染料摄取1小时。拮抗剂与Yo-Pro染料同时加入。对于拮抗剂活性，将最大强度百分比标准化为BzATP峰值激活值，并绘制其与化合物浓度的关系图，以计算IC50值。[3][4]
IL-1β释放测定：使用分化的人类THP-1细胞。在A-740003存在下测量激动剂诱导的IL-1β释放。[4]

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细胞实验：稳定表达重组P2X7受体的1321N1人星形胶质瘤细胞（小鼠BALB/c、小鼠C57BL/6、大鼠、人）培养于含1% L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、1%抗生素/抗真菌剂、10%胎牛血清和300 μg/mL遗传霉素的DMEM培养基中。钙离子内流实验中，细胞接种于聚赖氨酸包被的黑色96孔板中。Yo-Pro摄取实验中，细胞接种于聚赖氨酸包被的黑色96孔板中。[3][4]
分化的THP-1人细胞用于IL-1β释放和孔形成实验。 [4]

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为进行钙离子内流测定，将稳定表达人、大鼠、BALB/c小鼠或C57BL/6小鼠P2X7受体的1321N1细胞接种于聚赖氨酸包被的黑色96孔板上。用Fluo-4染料（5 μg·mL⁻¹，溶于DPBS）孵育细胞至少1小时。洗涤后，加入拮抗剂（A-740003），并在加入激动剂（BzATP：人5 μmol·L⁻¹，大鼠10 μmol·L⁻¹，小鼠150 μmol·L⁻¹）前收集3分钟的荧光数据。加入激动剂后，继续记录2分钟的荧光。分析浓度-效应数据以确定pIC50值。在Yo-Pro摄取实验中，将表达P2X7受体的1321N1细胞接种于聚赖氨酸包被的黑色96孔板上。用不含Mg²⁺或Ca²⁺的PBS缓冲液洗涤细胞两次。在加入激动剂（BzATP：人2.5 μmol·L⁻¹，大鼠15 μmol·L⁻¹，小鼠90 μmol·L⁻¹）之前，立即加入Yo-Pro碘化物染料（溶于不含Mg²⁺/Ca²⁺的PBS缓冲液中，浓度为2 μmol·L⁻¹）。拮抗剂（包括A-740003）与Yo-Pro染料同时加入。测量染料摄取1小时。将最大强度的百分比标准化为BzATP峰值反应，并绘制其与化合物浓度的关系图，以计算IC50值。 [3]
对于质子外流测定，将MC3T3-E1成骨细胞样细胞培养在多孔聚碳酸酯膜上，并用标准培养基灌流。通过微生理仪监测质子外流。首先用A-740003 (10 μM) 或对照处理细胞6分钟，然后在拮抗剂持续存在的情况下，与BzATP (300 μM) 或溶剂共同灌流9分钟。定量分析持续期（去除BzATP后12-30分钟）。A-740003显著阻断了BzATP诱导的持续增加。[1]

动物实验方案：脊神经结扎（SNL）模型：大鼠接受L5/L6脊神经结扎术。腹腔注射A-740003，并测定其镇痛作用。ED50 = 19 mg/kg ip [4]
慢性压迫损伤（CCI）模型：大鼠接受坐骨神经CCI。A-740003可减轻触觉异常性疼痛。[4]
长春新碱诱导神经病变模型：大鼠接受长春新碱治疗以诱导神经病变。A-740003可减轻触觉异常性疼痛。[4]
角叉菜胶诱导炎症模型：足底注射角叉菜胶。A-740003可减轻热痛觉过敏（ED50 = 38 mg/kg ip）。 [4]
完全弗氏佐剂 (CFA) 模型：足底注射 CFA。A-740003 可减轻热痛觉过敏（ED50 = 54 mg/kg，腹腔注射）。[4]
大鼠颈部切口疼痛模型：在异氟烷麻醉下，沿颈部正中线做 1.5 cm 的纵向切口，随后进行 30 分钟的反复钝性分离刺激。将 A-740003 溶于 2% DMSO 中，于颈部切口手术后 3.5 小时（4 小时热痛测试前 0.5 小时）腹腔注射，剂量为 142 mg/kg。 [5]
大鼠电针治疗：在轻度异氟烷麻醉下，对双侧LI18或LI4-PC6穴位进行电针刺激（1 mA，2 Hz/100 Hz交替），持续30分钟。[5]

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大鼠颈部切口疼痛模型：成年雄性Sprague-Dawley大鼠（200-250 g）在异氟烷（0.5-1%异氟烷/氧气）麻醉下，沿颈部正中线做1.5 cm纵向切口，随后沿甲状腺周围双侧胸骨舌骨肌进行反复钝性分离刺激，持续30分钟。将A-740003溶于2% DMSO中，于颈部切口手术后3.5小时（4小时热痛测试前0.5小时）腹腔注射，剂量为142 mg/kg。对照组动物注射等体积的DMSO。采用甩尾刺激仪测量热痛阈值，热强度设置为 25 单位，截止时间为 30 秒。[5]
大鼠癫痫持续状态模型：将 9-11 周龄的雄性 Sprague-Dawley 大鼠麻醉后固定于立体定位仪上。在大鼠背部皮下植入渗透泵（1002），并将其连接至插入右侧脑室（后方 1 mm；侧方 1.5 mm；深度 -3.5 mm）的脑灌注装置。大鼠接受脑室内 A-740003（10 μM，溶于 0.001% DMSO/生理盐水，0.5 μl/hr）灌注，持续 2 周。输注开始三天后，在腹腔注射甲基东莨菪碱（5 mg/kg）20分钟后，腹腔注射毛果芸香碱（380 mg/kg）以诱导癫痫持续状态。癫痫持续状态发作2小时后，腹腔注射地西泮（10 mg/kg）。在不同时间点（癫痫持续状态后2天、3天和1周）处死动物，用于免疫组织化学和Fluoro-Jade B染色。采用电生理方法测量癫痫发作阈值。[2]

A-740003 在镇痛剂量下未改变大鼠的运动能力。[4]

[1]. P2X?-mediated calcium influx triggers a sustained, PI3K-dependent increase in metabolic acid production by osteoblast-like cells. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2012 Mar 1;302(5):E561-75.

[2]. P2X7 receptor activation ameliorates CA3 neuronal damage via a tumor necrosis factor-α-mediated pathway in the rat hippocampus following status epilepticus. J Neuroinflammation. 2011 Jun 2;8:62.

[3]. Mammalian P2X7 receptor pharmacology: comparison of recombinant mouse, rat and human P2X7 receptors.Br J Pharmacol. 2009 Aug;157(7):1203-14.

[4]. A-740003 [N-(1-{[(cyanoimino)(5-quinolinylamino) methyl]amino}-2,2-dimethylpropyl)-2-(3,4-dimethoxyphenyl)acetamide] a novel and selective P2X7 receptor antagonist, dose-dependently reduces neuropathic pain in the rat. J Pharmacol Exp Ther. 2006 Dec;319(3):1376-85.

[5]. Effect of electroacupuncture on the cervicospinal P2X7 receptor/fractalkine/CX3CR1 signaling pathway in a rat neck-incision pain model. Purinergic Signal. 2017 Jun;13(2):215-225.

A-740003 (N-(1-{[(氰基亚氨基)(5-喹啉基氨基)甲基]氨基}-2,2-二甲基丙基)-2-(3,4-二甲氧基苯基)乙酰胺) 是一种新型的选择性 P2X7 受体竞争性拮抗剂。它对 P2X7 受体具有高度选择性，优于其他 P2 受体和一系列其他靶点。研究表明，在神经性疼痛和炎症性疼痛的动物模型中，体内选择性阻断 P2X7 受体可产生显著的镇痛作用。[4] A-740003 还被用于研究 P2X7 受体在颈部切口疼痛模型中电针镇痛中的作用。[5] A-740003 是一种新型的选择性 P2X7 受体竞争性拮抗剂，对多种哺乳动物（人、大鼠、小鼠）的 P2X7 受体均具有高亲和力。与早期非选择性拮抗剂（如KN-62和BBG）相比，A-740003的物种差异较小。无论P2X7受体介导的生理终点（钙离子内流或孔道形成）如何，A-740003均能作为高亲和力和选择性的P2X7受体拮抗剂发挥作用。[3]
A-740003 (10 μM) 不影响MC3T3-E1成骨细胞样细胞的基础质子外流。[1]
脑室内注射A-740003不影响大鼠毛果芸香碱诱导的癫痫阈值。[2]
腹腔注射A-740003 (142 mg/kg) 不影响颈部切口疼痛模型大鼠的基础热痛阈值。[5]

C26H30N6O3

474.565

474.237

C, 65.80; H, 6.37; N, 17.71; O, 10.11

861393-28-4

861393-28-4;

23232014

White to off-white solid powder

1.2±0.1 g/cm3

1.597

2.77

120.66

3

6

10

35

773

0

CC(C)(C)C(NC(=O)CC1=CC(=C(C=C1)OC)OC)/N=C(/NC#N)\NC2=CC=CC3=C2C=CC=N3

PUHSRMSFDASMAE-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C26H30N6O3/c1-26(2,3)24(31-23(33)15-17-11-12-21(34-4)22(14-17)35-5)32-25(29-16-27)30-20-10-6-9-19-18(20)8-7-13-28-19/h6-14,24H,15H2,1-5H3,(H,31,33)(H2,29,30,32)

N-[1-[[(Cyanoamino)(5-quinolinylamino)methylene]amino]-2,2-dimethylpropyl]-3,4-dimethoxybenzeneacetamide

A-740003; A 740003; A-740,003; A740,003; N-(1-((E)-((cyanoamino)((quinolin-5-yl)amino)methylidene)amino)-2,2-dimethylpropyl)-2-(3,4-dimethoxyphenyl)acetamide; N-{1-[(E)-[(cyanoamino)[(quinolin-5-yl)amino]methylidene]amino]-2,2-dimethylpropyl}-2-(3,4-dimethoxyphenyl)acetamide;A740003.

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~50 mg/mL (~105.36 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.27 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 +5% Tween-80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80+，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。