Adjudin   中文名称: 男用口服避孕药

Cl- channel; NF-κB
Mitochondria (leading to decreased mitochondrial membrane potential, reduced ATP levels, and altered mitochondrial morphology) [3]
Chloride ion (Cl⁻) channels, including the CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) Cl⁻ channel and the GABA_A receptor/Cl⁻ channel, by blocking their transport function [2]

阿朱丁是一种强效的氯离子通道阻滞剂；它通过干扰氯离子转运功能，降低人类精子在体外受精的能力[1]。阿朱丁（ADD）是一种线粒体抑制剂[2]。阿朱丁分子通过破坏支持细胞-生殖细胞界面处的黏附连接发挥作用。研究人员使用浓度递增的阿朱丁处理十余种小鼠或人类癌细胞系，以研究其对癌细胞的影响。随后，采用改良的MTT法检测细胞增殖情况。结果显示，人胃腺癌细胞SGC-7901、人乳腺癌细胞MDA-MB-231、人肝癌细胞Smmc-7721和人胰腺腺癌细胞MIA Paca-2的增殖均受到剂量依赖性的抑制。给药24小时后，Adjudin对SGC-7901、MDA-MB-231、Smmc-7721和MIA Paca-2细胞的IC50值分别为58.0 µM、13.8 µM、72.3 µM和52.7 µM。其他人类和小鼠癌细胞系也获得了类似的结果。Adjudin对PC3细胞和A549细胞的IC50值分别为63.1 µM和93.0 µM。Adjudin对WI-38细胞和BPH-1细胞的IC50值分别超过300 µM和200 µM。这些数值分别比癌细胞系A549和PC3的数值高约5倍和2倍[3]。在MCF-7/ADR耐药乳腺癌细胞中，Adjudin和阿霉素（以ADD-DOX(M)胶束的形式）的组合表现出优异的抗多药耐药（MDR）效果。ADD-DOX(M)的IC50值为10.1 μM，比游离ADD-DOX缀合物（IC50为121.4 μM）低约12.1倍。游离ADD和DOX混合物（摩尔比1:1）的IC50值为4.3 μM，分别比游离ADD（39.1 μM）和DOX（73.7 μM）低9.1倍和17.1倍。 ADD-DOX(M) 的耐药因子 (RF) 为 2.7，比游离 DOX (80.1) 低约 29.9 倍 [1]。
在 A549 肺腺癌细胞中，Adjudin 以剂量依赖的方式抑制细胞增殖，24 小时处理后的 IC50 为 63.1 μM。它诱导细胞凋亡，使凋亡细胞的比例从 18.7% (30 μM) 增加到 24.6% (60 μM)。Adjudin 处理 (24 小时) 导致浓度依赖性的 cleaved Caspase-3 增加、线粒体细胞色素 C 释放以及 Caspase-9 的激活/裂解。它还以浓度依赖的方式降低 BCL-2 mRNA 和蛋白的表达。 Adjudin（24 小时）降低了线粒体膜电位（从对照组的 20% 降至 100 μM Adjudin 处理组的 5%），并显著降低了细胞内 ATP 水平。它还以浓度和时间依赖的方式减少了线粒体质量，并导致线粒体形态异常和弥散。在克隆形成实验中，300 μM Adjudin 处理几乎完全清除了 A549 细胞，导致零克隆形成 [3]。在 PC3 前列腺癌细胞中，Adjudin 处理 24 小时后抑制了细胞增殖，IC50 为 93.0 μM。它诱导细胞凋亡，使凋亡细胞的比例从基础水平的 1% 增加到 60 μM Adjudin 处理组的 31%。Caspase-3 抑制剂 Ac-DEVD-CHO 显著降低了 Adjudin 诱导的细胞凋亡率。在克隆形成实验中，300 μM Adjudin 处理几乎完全清除了 PC3 细胞，导致克隆形成率为零 [3]。
在 SGC-7901、MDA-MB-231、Smmc-7721 和 MIA Paca-2 癌细胞系中，Adjudin 以剂量依赖的方式抑制细胞增殖，24 小时处理后的 IC50 值分别为 58.0 μM、13.8 μM、72.3 μM 和 52.7 μM [3]。
在人精子中，Adjudin（10 nM – 10 μM）以剂量依赖的方式显著抑制孕酮诱导的精子获能。它还以剂量依赖的方式（10 nM – 10 μM）抑制 rhuZP3β 或孕酮诱导的顶体反应。 Adjudin (10 μM) 显著抑制精子过度激活，但不影响精子活力。Adjudin (10 μM) 对精子获能的抑制作用是可逆的。Adjudin (10 μM) 阻断了福斯克林和 HCO₃⁻ 刺激引起的细胞内 cAMP 水平升高。Adjudin (10 和 100 μM) 不抑制获能依赖性蛋白酪氨酸磷酸化，但抑制丝氨酸 (70 kDa) 和苏氨酸 (60、72、95、110 和 130 kDa) 磷酸化的增加。Adjudin (10 μM) 在完全 Cl⁻-HTF 培养基中显著抑制精子获能，但在 Cl⁻ 缺乏的 HTF 培养基中则无此作用。在 Cl⁻ 缺乏的培养基中添加 dbcAMP 可逆转 Adjudin 诱导的精子过度激活和获能抑制作用 [2]。

本研究采用皮下肺癌和前列腺癌模型，考察Adjudin的疗效，以确定其是否能在体内抑制肺癌和前列腺癌的生长。将A549人肺癌细胞和PC3前列腺癌细胞皮下注射到无胸腺裸鼠的下背部不同部位。然后，将小鼠随机分为两组——Adjudin治疗组和载体对照组（对照组），两组小鼠的平均肿瘤大小相近。在肿瘤接种后约两周开始，Adjudin每三天腹腔注射一次（肺癌组），每两天腹腔注射一次（前列腺癌细胞组）。在啮齿动物中，辅助治疗通常耐受性良好。此外，与对照组相比，Adjudin治疗组小鼠的肿瘤生长显著受到抑制（人肺癌细胞A549中P<0.0001，前列腺癌细胞PC3中P=0.006）[3]。

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在雄性BALB/C裸鼠皮下接种A549细胞的肿瘤模型中，每三天腹腔注射Adjudin（100 mg/kg，由DMSO储备液溶于玉米油中），持续两周，与载体对照组相比，肿瘤体积增长显著减缓（p < 0.0001）[3]。
在雄性BALB/C裸鼠皮下接种PC3细胞的肿瘤模型中，每两天腹腔注射Adjudin（100 mg/kg，由DMSO储备液溶于玉米油中），持续两周，与载体对照组相比，肿瘤生长减少（p = 0.006）。 [3].

研究了ADD-DOX偶联物的水解特性。将该偶联物溶解于不同pH值（4.0、5.2、6.5和7.4）的水-甲醇（75/25，v/v）溶液中，并在37°C下孵育0.5至48小时。在预定的时间点，取等分试样进行HPLC分析，以确定水解率，结果证实该偶联物水解为游离的ADD和DOX，且在酸性pH值下水解速率更快[1]。
使用酶免疫测定（EIA）试剂盒测定了Adjudin抑制人精子中福斯克林和HCO₃⁻刺激的细胞内cAMP水平的能力。将精子在含或不含10 μM福斯克林和/或10 μM Adjudin的HTF培养基中孵育0小时和5小时。孵育结束后，加入冰冷的 100 mM HCl 乙醇溶液终止反应，样品经冻干后，按照试剂盒说明书[2]测定 cAMP 水平。
为测定 Adjudin 处理的 A549 细胞中的 ATP 水平，使用 Roche ATP 生物发光检测试剂盒 (HS II)，并按照标准流程进行操作。细胞用 PBS 洗涤，用细胞裂解液裂解 20 分钟，然后将匀浆与荧光素酶试剂混合。使用酶标仪检测发光值。ATP 浓度使用 ATP 标准品计算，并以 BCA 法测定的总蛋白量进行标准化[3]。

在含有完全培养基的96孔板中，接种0.5×10⁴个A549细胞、WI-38细胞、BPH-1细胞、PC-12细胞和其他细胞系。细胞培养24小时后，将Adjudin用不含血清的培养基进行系列稀释，浓度分别为300 µM、100 µM、30 µM、10 µM、3 µM和0。再培养24小时后，向每个孔中加入10 µl Cell Counting Kit-8溶液。在细胞培养箱中37℃孵育4小时后，使用酶标仪在450 nm处测量吸光度[3]。

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采用标准MTT法评估ADD-DOX(M)的细胞毒性。将 MCF-7/ADR 或 MCF-7 细胞接种于 96 孔板中，培养 24 小时。然后用含有不同浓度药物的培养基处理细胞 72 小时。培养结束后，用 PBS 洗涤细胞，并在 37°C 下用含 MTT 的无血清培养基孵育 2 小时。弃去培养基，加入 DMSO 溶解甲臜。孵育 15 分钟后，使用酶标仪测定 570 nm 处的吸光度。计算半数抑制浓度 (IC50) [1]。
使用共聚焦激光扫描显微镜 (CLSM) 和流式细胞术 (FCM) 评估 MCF-7/ADR 细胞对 ADD-DOX(M) 的摄取。将细胞与 ADD-DOX(M) 孵育特定时间（1、4、12、24、48 小时）。对于共聚焦激光扫描显微镜（CLSM），细胞用多聚甲醛固定，用Hoechst 33258染色以显示细胞核，然后进行成像。对于流式细胞术（FCM），细胞经胰蛋白酶消化后收集，重悬于冰冷的PBS缓冲液中，并进行分析。通过比较4°C和37°C下的细胞内荧光强度来研究能量依赖性内吞作用[1]。
采用改良的MTT法（或CCK-8法）测定Adjudin的抗增殖作用。将细胞接种于96孔板中，孵育24小时。然后用无血清培养基替换生长培养基，并加入一系列稀释的Adjudin溶液（300、100、30、10、3 μM）。孵育24小时后，向每个孔中加入CCK-8溶液。4小时后，使用酶标仪测量450 nm处的吸光度。 IC50值由图[3]确定。
采用Annexin V/7-AAD凋亡检测试剂盒评估细胞凋亡。细胞经Adjudin处理后，重悬于结合缓冲液中。加入Annexin V和7-AAD，于室温避光孵育15分钟，然后进行流式细胞术分析。在Caspase-3抑制实验中，细胞在Adjudin处理前先用Caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO (20 μM)预孵育2小时[3]。
在克隆形成实验中，将A549和PC3细胞培养于铺有琼脂的培养皿中2周。琼脂的上层由细胞与含有0.7%琼脂、2×培养基、20% FBS和不同浓度Adjudin的溶液混合制成。下层琼脂由1%琼脂和2×培养基以及20% FBS制成。将菌落用 0.05% 结晶紫染色 1 小时，计数含有 >50 个细胞的菌落 [3]。
使用 JC-1 染色测定线粒体膜电位 (Δψm)。收集用 Adjudin 处理 24 小时的 A549 细胞，洗涤后，在 37°C 下用 2 μM JC-1 孵育 30 分钟。然后离心沉淀细胞，重悬于 PBS 缓冲液中，并使用流式细胞仪进行分析，激发波长为 488 nm，发射波长为 530 nm 和 585 nm 带通滤光片 [3]。
使用 MitoTracker Green 检测线粒体质量。将用 Adjudin 处理的 A549 细胞与 200 nM MitoTracker 探针在 37°C 下孵育 45 分钟。随后用PBS缓冲液替换染色液，并通过流式细胞术分析细胞[3]。
为了定量分析线粒体形态，将A549细胞用200 nM MitoTracker Red染色，然后进行固定、透化和封闭处理。使用共聚焦显微镜采集图像，并使用NIH ImageJ软件中的自定义宏进行分析。平均面积/周长比用作线粒体互连性的指标，倒数圆度用作线粒体伸长的指标[3]。

小鼠：将等量的A549细胞（0.5×10⁷个细胞）和PC3细胞（1×10⁶个细胞）皮下注射到体重低于约20克的雄性BALB/c裸鼠体内。两周后，将肿瘤可触及的小鼠分为两组（每次实验每组n=4；共重复三次）：一组腹腔注射Adjudin，Adjudin由DMSO储备液溶于玉米油中，最终给药剂量为100 mg/kg（体外实验浓度约为300 µM）；另一组腹腔注射等量的玉米油和DMSO，作为相应的溶剂对照组。A549小鼠每三天注射一次Adjudin或溶剂，PC3小鼠每两天注射一次，持续两周。计算并确定肿瘤体积。

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对于体内肿瘤模型，将A549细胞（0.5 x 10⁷个细胞）与基质胶混合，或PC3细胞（1 x 10⁶个细胞）皮下植入雄性BALB/c裸鼠体内。2周后，将可触及肿瘤的小鼠分为两组（每组n=4，实验重复3次）。治疗组腹腔注射Adjudin，Adjudin由DMSO储备液溶于玉米油中，最终给药量为100 mg/kg。对照组腹腔注射等量的玉米油和DMSO。A549模型每3天给药一次Adjudin或载体，PC3模型每2天给药一次，持续2周。使用公式1/2 x L x W²计算肿瘤体积，其中W为较小尺寸[3]。

在大鼠原代睾丸支持细胞和器官培养模型中，Adjudin 对这些正常细胞的毒性极低。Adjudin 在非癌性人肺成纤维细胞 WI-38 和良性前列腺增生上皮细胞 BPH-1 中的 IC50 值分别大于 300 μM 和 200 μM，约为癌细胞系 A549 (63.1 μM) 和 PC3 (93.0 μM) 的 5 倍。Adjudin（浓度高达 300 μM）不影响原代人内皮祖细胞 (EPC) 的生长 [3]。
在一项人精子研究中，浓度高达 10 μM 的 Adjudin 不影响精子活力，表明在此浓度下无细胞毒性 [2]。

[1]. Inhibition of sperm capacitation and fertilizing capacity by adjudin is mediated by chloride and its channels in humans. Hum Reprod. 2013 Jan;28(1):47-59.

[2]. Combination delivery of Adjudin and Doxorubicin via integrating drug conjugation and nanocarrier approaches for the treatment of drug-resistant cancer cells. J Mater Chem B. 2015 Feb 28;3(8):1556-1564.

[3]. Male contraceptive Adjudin is a potential anti-cancer drug. Biochem Pharmacol. 2013 Feb 1;85(3):345-55.

Adjudin（原名AF-2364）是一种潜在的非激素类男性避孕药，其研发目的是为了破坏支持细胞-生殖细胞界面处的黏附连接，导致精子细胞从生精上皮过早释放，从而诱导大鼠可逆性不育[2, 3]。它是洛尼达明（LND）的类似物[1, 2, 3]。Adjudin是首个报道与阿霉素联合用于治疗多药耐药（MDR）癌细胞的药物，其联合递送策略涉及药物偶联和纳米载体[1]。研究表明，Adjudin通过靶向线粒体并经由Caspase-3依赖性通路诱导细胞凋亡，从而发挥抗癌活性[3]。阿朱丁对人类精子获能和受精能力的抑制作用是通过其对氯离子及其通道的影响实现的，这种作用是可逆的[2]。

C15H12CL2N4O

335.19

334.038

C, 53.75; H, 3.61; Cl, 21.15; N, 16.72; O, 4.77

252025-52-8

252025-52-8

9819086

White to off-white solid powder

1.5±0.1 g/cm3

1.705

2.67

72.94

2

3

3

22

411

0

O=C(C1=NN(CC2=CC=C(Cl)C=C2Cl)C3=C1C=CC=C3)NN

VENCPJAAXKBIJD-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C15H12Cl2N4O/c16-10-6-5-9(12(17)7-10)8-21-13-4-2-1-3-11(13)14(20-21)15(22)19-18/h1-7H,8,18H2,(H,19,22)

1-[(2,4-dichlorophenyl)methyl]indazole-3-carbohydrazide

Adjudin; AF-2364; AF2364; AF 2364

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: 16.67~67 mg/mL (49.7~199.9 mM)
Ethanol: 2 mg/mL (6.0 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 1.67 mg/mL (4.98 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 16.7 mg/mL澄清的DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；再向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；然后加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 1.67 mg/mL (4.98 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 16.7 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。