Aficamten (CK-3773274; CK-274)   中文名称: 阿菲凯泰

Myosin (IC50 = 1.4 μM)

心肌肌节的高收缩性可能是遗传性肥厚型心肌病潜在的病理性肥大和纤维化所必需的。Aficamten（CK-274）是在吲哚啉化合物1的优化条件下发现的一种新型心肌肌球蛋白抑制剂。优化的重要进展是发现了一种Indane类似物（12），其具有较少的限制性结构-活性关系，可以快速改善类药物性质[1]Aficamten是一种口服、选择性、变构性心脏肌球蛋白抑制剂，旨在直接针对肥厚型心肌病相关的过度收缩机制。该药物可逆性地结合于β-心脏肌球蛋白马达结构域上一个独特的变构口袋，将肌球蛋白稳定在一种被称为“超松弛态”或弱肌动蛋白结合状态的特殊构象中。通过将肌球蛋白头部锁定在此状态，aficamten可减缓ATP水解循环中磷酸盐的释放速率，从而阻止肌球蛋白转变为产生张力、强结合肌动蛋白状态所需的构象变化。这一作用有效减少了参与收缩循环的活性肌动蛋白-肌球蛋白横桥数量，进而降低心肌肌节中肌球蛋白产生的收缩力，并减轻左心室流出道梗阻。

Aficamten 是一种下一代本土肌球蛋白制剂，可提供适合每日一次给药的近期人体半衰期，在数周内达到稳定状态，并显示出较大的国内加工窗口和明确的 PK/PD 联系 [1]。口服治疗后（小鼠 1 mg/kg、小鼠 2 mg/kg、大鼠 3 mg/kg、大鼠 8 mg/kg、狗 1 mg/kg 和猴 1 mg/kg），Aficasten 显示出中枢屏障生物利用度（模型 98） %、大鼠 55%、大鼠 58%、大鼠 79%、狗 45%、猴 41%）[1]。 Aficasten 揭示了最终消除半衰期（猴子为 4.5 小时，猴子为 3.0 小时，狗为 33.8 小时，以及 8.1 小时[1]。

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Aficamten可剂量依赖性地降低左心室收缩力，从而显著改善左心室流出道梗阻及心力衰竭症状。药代动力学数据显示，该药物在人体内的半衰期约为3.4天，可在两周内达到稳态血药浓度。临床试验显示，治疗启动两周内即可观察到LVOT梯度降低，且此效应可持续至第24周。第24周时，aficamten组患者静息状态和Valsalva动作下的LVOT梯度较基线平均分别下降35 mmHg和48 mmHg，而安慰剂组则分别上升4 mmHg和2 mmHg。除血流动力学改善外，aficamten还能促进有益的心脏重构。心脏磁共振亚组研究显示，治疗24周后患者的左心室质量指数、最大室壁厚度及左心房容积指数均显著降低，同时N末端B型利钠肽前体和高敏心肌肌钙蛋白I水平也大幅下降。与其作用机制一致，aficamten会降低左心室射血分数：第24周时，aficamten组的LVEF较基线平均下降7%，安慰剂组下降2%。该药物的效应具有可逆性：停药四周后，LVEF和Valsalva动作下的LVOT梯度均恢复至基线水平。

心肌原纤维测定。[1]
为了在天然肌节的背景下评估化合物对全长心肌肌球蛋白ATP酶活性的影响，可以进行皮肤肌原纤维测定。牛心肌纤维可以通过在洗涤剂如triton X-100的存在下使牛心脏左心室组织匀浆而获得。这种处理去除了膜和大多数可溶性细胞质蛋白，但使心肌肌动蛋白器完好无损。肌原纤维制剂保持以Ca2+调节的方式水解ATP的能力。在存在和不存在化合物的情况下，这种肌原纤维制剂的ATP酶活性可以在Ca2+浓度下测定，Ca2+浓度激活到最大速率的限定分数（即25%、75%）。使用丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶偶联酶系统评估小分子制剂抑制稳态ATP酶活性的能力，该系统通过将还原形式的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧化为氧化形式的烟胺腺嘌呤二核苷酸，将肌球蛋白产生的二磷酸腺苷（ADP）再生为三磷酸腺苷（ATP），从而在340nm处产生吸光度变化。在补充有60mM KCl和ATP的PM12缓冲液（12mM Pipes，2mM MgCl2，1mM DTT，pH 6.8）中进行肌原纤维ATP酶测定，所述缓冲液的KM约为特定肌原纤维系统的KM的3-10倍（0.5mM ATP用于快速骨骼，0.05mM ATP用于慢速骨骼和心脏）。使用0.6mM EGTA和足够的CaCl2控制钙浓度，以获得所需的游离钙浓度（使用网络资源计算http://www.stanford.edu/~cpatton/webmaxc/webmaxcS.htm）。叠氮化钠（0.25mM）被包括在心肌原纤维测定中（如有指示）以抑制非肌球蛋白ATP酶活性。在存在饱和浓度的非选择性肌球蛋白II抑制剂blebbistatin的情况下，通过减去ATP酶活性，从心脏和慢骨骼肌纤维测定（如指示）中减去非肌球蛋白ATP酶活性。肌原纤维的存在量约为0.25 mg/mL（快速骨骼）或1 mg/mL（慢速骨骼、心脏）。使用0.6mM EGTA和足够的CaCl2控制钙浓度，以获得所需的游离钙浓度（使用网络资源计算http://www.stanford.edu/~cpatton/webmaxc/webmaxcS.htm）。使用Envision或SpectraMax平板读取器在约25°C下进行吸光度测量（340 nm）。

冷冻保存平板人肝细胞测定。[1]
平板人肝细胞测定在Eurofins Pharma Discovery Services进行。在Eurofins Pharma Discovery Services进行了平板肝细胞测定，该测定用于通过测量人肝细胞培养物中CYP1A2、2B6和3A4的mRNA水平来确定CK-3773274对CYP亚型的潜在诱导。将肝细胞解冻，并在S54中以0.7 X 106个活细胞/mL的密度接种到胶原包被的96孔板中。肝细胞在37°C和5%CO2下培养。在接种后4小时，对肝细胞进行清洗，然后进行过夜恢复。接种24小时后，将肝细胞与受试化合物在培养基中孵育，培养基每天更换，总孵育72小时。接种后第5天，用RT-qPCR样品修复试剂洗涤和裂解肝细胞。在每种浓度下以0.1%的最终DMSO浓度将化合物分成三份进行测试。细胞裂解物用作信使核糖核酸模板，并使用寡聚物（dT）和随机引物的混合物通过RTPCR逆转录为cDNA。分别使用CYP1A2、CYP2B6和CYP3A4序列特异性引物，并将GAPDH作为参考基因，通过单重两步RT-qPCR测定每种亚型的相对表达（与载体对照相比的倍数差异）。通过将每批肝细胞的倍数诱导与预先确定的临界值进行比较来分析每种测试化合物的诱导潜力。

Pharmacokinetics. [1]
Pharmacokinetic parameters were determined in male and female SpragueDawley rats, n = 3, male beagle dogs, n = 3 (PO) and n =2 (IV), and male cynomolgus monkeys, n = 3, following single bolus intravenous and/or oral administration of compound. Blood samples were taken periodically beginning immediately before compound administration to 24 h after administration. The concentrations of compound in blood or plasma samples were analyzed by HPLC relative to a standard. Compounds were dosed orally either in solution or as suspensions to animals that were fasted for 12 h. Concentration of test article in skeletal muscle tissue was S56 determined by excision, weight determination and homogenization of tissue samples followed by compound extraction and HPLC quantitation relative to a standard in the same manner employed for blood and plasma determinations. Summary pharmacokinetic data were analyzed using WinNonlin®.

Absorption
Aficamten exposure increases dose proportionally following single doses of 1 mg to 75 mg and multiple once daily doses of 5 mg to 20 mg. Geometric mean accumulation ratios for aficamten were similar across dose levels and ranged from 4.6 to 4.8. Steady state is predicted to be reached following approximately 17 days of once daily dosing of aficamten in patients with oHCM. Tmax ranges from 1.5 to 2.0 hours. Aficamten is rapidly absorbed after oral administration. The bioavailability of aficamten after oral administration is unknown.

Route of Elimination Following a single 20 mg radiolabeled dose of aficamten, 32% (0.06% unchanged aficamten) was excreted in urine and 58% (5.1% unchanged aficamten) was excreted in feces.

Volume of Distribution
The volume of distribution is 313 L. The blood to plasma ratio of aficamten was 0.94.

Clearance
The total clearance is 2.6 L/hr and the renal clearance is <0.1% of total clearance.

Protein Binding
Aficamten is approximately 90% bound to plasma proteins.

Metabolism / Metabolites
Aficamten is extensively metabolized in humans, primarily through CYP2C9 with contributions by CYP3A, CYP2D6, and CYP2C19. Aficamten is primarily metabolized to two pharmacologically inactive metabolites, CK-3834282 and CK-3834283, that circulate at approximately 56% and 103% of parent in plasma, respectively. Inactive metabolites are further biotransformed via various reactions such as glucuronidation, sulfonation, microbiota-mediated reduction, and amide hydrolysis.

Biological Half-Life
Aficamten has a median terminal half-life (t½) of approximately 80 hours in patients with oHCM.

[1]. Discovery of Aficamten (CK-274), a Next-Generation Cardiac Myosin Inhibitor for the Treatment of Hypertrophic Cardiomyopathy. J Med Chem. 2021 Oct 14;64(19):14142-14152.

Drug Indication
Treatment of hypertrophic cardiomyopathy

C18H19N5O2

337.375763177872

337.153

C, 64.08; H, 5.68; N, 20.76; O, 9.48

2364554-48-1

139331495

White to light brown solid powder

2.1

85.8Ų

1

5

4

25

490

1

CCC1=NC(=NO1)C2=CC3=C(C=C2)[C@@H](CC3)NC(=O)C4=CN(N=C4)C

IOVAZWDIRCRMTM-OAHLLOKOSA-N

InChI=1S/C18H19N5O2/c1-3-16-21-17(22-25-16)12-4-6-14-11(8-12)5-7-15(14)20-18(24)13-9-19-23(2)10-13/h4,6,8-10,15H,3,5,7H2,1-2H3,(H,20,24)/t15-/m1/s1

N-[(1R)-5-(5-ethyl-1,2,4-oxadiazol-3-yl)-2,3-dihydro-1H-inden-1-yl]-1-methyl-1H-pyrazole-4-carboxamide

CK-3773274; CK274; Aficamten [INN]; [USAN]; CK-3773,274; B1I77MH6K1; CK3773,274; CK 274; CK 3773274; CK-274; Aficamten

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~125 mg/mL (~370.50 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (6.17 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (6.17 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (6.17 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。