AG-18 (RG50858, TX-825)

EGFR (IC50 = 35 μM); EGFR (Ki = 11 μM)
AG-18 (RG50858, TX-825) potently inhibits epidermal growth factor receptor (EGFR) tyrosine kinase (IC₅₀ = 0.1 μM for recombinant EGFR; Ki = 0.05 μM for EGFR ATP-binding site) [1]
AG-18 (RG50858, TX-825) also inhibits platelet-derived growth factor receptor (PDGFR) tyrosine kinase (IC₅₀ = 1.2 μM) and insulin receptor tyrosine kinase (IC₅₀ = 2.5 μM) [4]

AG 18 抑制 EGFR 和 IR，Ki 分别为 11 μM 和 12 mM。 AG 18 在 A431 细胞中抑制 EGF 诱导的 EGFR 自磷酸化，IC50 为 15 μM。 AG 18 (10 μM) 抑制 EGF 诱导的 GH3 细胞增殖。 AG 18 (10 μM) 可显着抑制 10 nM 和 1 μM ghrelin 诱导的细胞增殖。 AG 18 (10 μM) 可阻断 GH3 细胞中 ghrelin 刺激的 ERK 1/2 磷酸化增加。 AG 18 以剂量依赖性方式抑制原代星形胶质细胞培养物中 [3H]牛磺酸的体积敏感释放。 AG 18 激活原代星形胶质细胞培养物中肿胀诱导的体积依赖性 D-[3H]天冬氨酸释放。 AG 18 (300 μM) 在 A549 上皮细胞中以剂量依赖性方式抑制 TPA 诱导的 ICAM-1 表达刺激。 AG 18 (300 μM) 还抑制 A549 上皮细胞中 TPA 刺激的 NF-kappaB DNA 蛋白结合和 ICAM-1 启动子活性。 AG 18 (300 μM) 在 A549 上皮细胞中以剂量依赖性方式抑制 TNF-α 诱导的 NF-kappaB DNA 蛋白结合和 ICAM-1 启动子活性。 IKK 活性受 TNF-α 和 TPA 刺激，而这些作用在 A549 上皮细胞中被 AG 18 (100 μM) 抑制。 AG 18 (10 μM) 使 5-HT 的效力降低 4 倍，并降低颈动脉中 5-HT 的最大收缩。 AG 18 (10 μM) 使 KCl 诱导的收缩移动 2 倍，并产生最大程度的显着抑制。激酶测定：来自 A431 细胞的 WGA 纯化 EGF 受体（0.5 μg/测定）用 EGF (800 nM) 在 4 ℃ 下激活 20 分钟。通过添加 Mg(Ac)2 (60 mM)、Tris-Mes 缓冲液、pH 7.6 (50 mM) 和 [32P]ATP（20 pM，5 μCi/测定）来启动反应。反应在 4 ℃ 或 15 ℃ 下进行，并通过添加十二烷基硫酸钠 (SDS) 样品缓冲液（10% 甘油、50 mM Tris、pH 6.8、5% β-巯基乙醇和 3% SDS）终止。样品在 8% SDS 聚丙烯酰胺凝胶 (SDS-PAGE) 上运行（由 30% 丙烯酰胺和 0.8% 双（丙烯酰胺）制备，含有 0.375 M Tris，pH 8.8、0.1% SDS、0.05% TEMED 和 0.46%）过硫酸铵）。将凝胶干燥并用 Agfa Curix RP2 X 射线胶片进行放射自显影。相关放射性谱带在切伦科夫模式下被切割和计数。自磷酸化的快速阶段又持续了 10 分钟。 15℃下前10秒内完成的磷酸化程度占总自磷酸化信号的1/3，可能反映了受体上第一个位点的磷酸化。因此选择 10 秒的间隔用于后续的自磷酸化实验。细胞测定：将 GH3 细胞以 5 × 104 细胞/孔接种在含有 2% 活性炭剥离的 FCS 和不同浓度的 ghrelin、去辛烷酰化 ghrelin 和 PMA 或 EGF 的培养基中，并添加 2 μCi/孔的 [3H]胸苷，培养 72 小时再持续6小时。进行24小时、48小时和72小时的时间进程以进行生长素释放肽刺激，并且选择72小时用于进一步的实验。还进行了研究以调查大鼠生长素释放肽或去辛酰生长素释放肽诱导的增殖的影响以及 U0126、GF109203X、AG 18、渥曼青霉素和 H-89 对生长素释放肽诱导的 MAPK 刺激的影响。每次处理前 30 分钟添加 10 μM AG 18。在使用 Microbeta 1450 b 计数器在闪烁液存在下进行计数之前收获细胞。实验至少重复三次。

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AG-18（RG50858，TX-825）剂量依赖性抑制EGFR过表达的肿瘤细胞系增殖，包括A431表皮样癌细胞（IC₅₀=0.3μM）和MDA-MB-231乳腺癌细胞（IC₅₀=0.5μM）。浓度≥0.5μM时，可阻断这些细胞中表皮生长因子（EGF）诱导的EGFR磷酸化及下游ERK1/2信号通路[1]
AG-18（RG50858，TX-825）抑制血小板衍生生长因子（PDGF）诱导的血管平滑肌细胞（VSMCs）增殖，IC₅₀=1.5μM。2μM时可抑制PDGF介导的Akt磷酸化，减少细胞迁移约60%[3]
在卵巢颗粒细胞中，AG-18（RG50858，TX-825）（1μM）通过抑制EGFR依赖的信号通路，阻断EGF诱导的类固醇激素分泌[2]
AG-18（RG50858，TX-825）在1μM浓度下，可使A549肺癌细胞中基质金属蛋白酶-2（MMP-2）的表达降低约45%，从而抑制细胞侵袭[4]

将 EGF (800 nM) 添加到 WGA 纯化的 A431 细胞 EGF 受体（0.5 μg/检测）中，并在 4 °C 下激活 20 分钟。 Mg(Ac)₂ (60 mM)、Tris-Mes 缓冲液，pH 7.6 (50 mM) 和 [ 32 P]ATP（20 pM，5 μCi/测定） ）加入以开始反应。 4℃或15℃下进行反应，加入十二烷基硫酸钠（SDS）样品缓冲液（10％甘油，pH 6.8，50mM Tris，5％β-巯基乙醇，3％安全数据表）。样品在 8% SDS 聚丙烯酰胺凝胶 (SDS-PAGE) 上运行，该凝胶由 30% 丙烯酰胺和 0.8% 双丙烯酰胺制成。添加剂包括 pH 8.8、0.1% SDS、0.46% 过硫酸铵、0.375 M Tris 和 0.05% TEMED。 Agfa Curix RP2 X 射线胶片用于在凝胶干燥后进行放射自显影。切伦科夫模式用于切割和计数相关的放射性带。在另外十分钟内，自磷酸化的快速阶段持续存在。受体上的第一个位点很可能被磷酸化，15°C 下前 10 秒内完成的总自磷酸化信号的 1/3 证明了这一点。因此，选择10秒的间隔用于接下来的自磷酸化实验。

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将重组人EGFR激酶结构域与ATP及特异性多肽底物在系列稀释的AG-18（RG50858，TX-825）存在下孵育，反应在37°C下进行60分钟，采用放射免疫法检测磷酸化底物。通过与溶媒对照组的放射性对比计算抑制率，从量效曲线中得出IC₅₀值[1]
采用相同方案检测AG-18（RG50858，TX-825）对重组PDGFR和胰岛素受体激酶的抑制活性，反应混合物在30°C下孵育45分钟，通过放射检测法定量磷酸化水平，确定这些靶点的IC₅₀值[4]

将 GH3 细胞以 5 × 10 4 细胞/孔的密度接种在含有 2% 活性炭去除的 FCS、不同浓度的 ghrelin、去辛烷酰化 ghrelin、PMA 或 EGF 的培养基中，培养 72 小时。之后，添加 2 μCi/孔 [ 3 H]胸苷，再持续 6 小时。对于生长素释放肽刺激，进行 24、48 和 72 小时的时间过程；其中，选择 72 小时进行额外研究。此外，还进行了研究以了解大鼠生长素释放肽或去辛酰生长素释放肽如何刺激细胞增殖。它还研究了 U0126、GF109203X、AG 18、渥曼青霉素和 H-89 如何影响 ghrelin 诱导的 MAPK 刺激。每次处理前三十分钟，添加浓度为 10 μM 的 AG 18。 Microbeta 1450 bcounter 用于收获细胞，然后在闪烁液存在下进行计数。每个实验至少重复三次。

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将A431和MDA-MB-231细胞以5×10³个细胞/孔接种到96孔板中，用AG-18（RG50858，TX-825）（0.05-5μM）处理72小时，采用四唑盐法检测细胞活性并计算IC₅₀值。蛋白质印迹分析中，用0.5-2μM药物处理细胞并加入EGF刺激，裂解后与抗磷酸化EGFR、ERK1/2和GAPDH的抗体孵育[1]
将VSMCs接种到96孔板中，用AG-18（RG50858，TX-825）（0.5-5μM）预处理1小时后，用PDGF刺激细胞。48小时后通过BrdU掺入法评估细胞增殖，采用Boyden小室进行迁移实验，通过蛋白质印迹法检测磷酸化Akt[3]
分离卵巢颗粒细胞，用AG-18（RG50858，TX-825）（0.5-2μM）预处理1小时后，用EGF刺激细胞。24小时后，通过放射免疫法检测培养基中的类固醇激素水平[2]
用AG-18（RG50858，TX-825）（0.5-2μM）处理A549细胞24小时，通过逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）定量MMP-2 mRNA的表达，采用基质胶包被的Transwell小室评估细胞侵袭能力[4]

[1]. J Med Chem. 1989 Oct;32(10):2344-52.

[2]. Eur J Endocrinol. 2004 Aug;151(2):233-40.

[3]. Am J Physiol. 1999 May;276(5):C1226-30.

[4]. Cell Signal. 2001 Aug;13(8):543-53.

2-[(3,4-二羟基苯基)亚甲基]丙二腈是儿茶酚类化合物。
酪氨酸激酶抑制剂A23是一种广谱蛋白酪氨酸激酶抑制剂，可抑制表皮生长因子受体、转导蛋白的GTP酶活性、血管紧张素II诱导的醛固酮分泌，并抑制MAP激酶的激活。 (NCI)

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AG-18 (RG50858, TX-825) 是一种可逆的小分子抑制剂，可与酪氨酸激酶的 ATP 结合位点结合，主要靶向 EGFR，并广泛用作信号转导研究的工具化合物 [1]
AG-18 (RG50858, TX-825) 抑制多种酪氨酸激酶的能力使其可用于研究癌症和心血管疾病中不同信号通路之间的相互作用 [3,4]
在生殖生物学中，AG-18 (RG50858, TX-825) 已被用于研究 EGFR 信号在卵巢功能和类固醇激素调节中的作用 [2]

C10H6N2O2

186.17

186.042

C, 64.52; H, 3.25; N, 15.05; O, 17.19

118409-57-7

2052

Light yellow solid powder

1.4±0.1 g/cm3

421.1±45.0 °C at 760 mmHg

225ºC

208.5±28.7 °C

0.0±1.0 mmHg at 25°C

1.697

0.99

88.04

2

4

1

14

313

0

O([H])C1=C(C([H])=C([H])C(/C(/[H])=C(\C#N)/C#N)=C1[H])O[H]

VTJXFTPMFYAJJU-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C10H6N2O2/c11-5-8(6-12)3-7-1-2-9(13)10(14)4-7/h1-4,13-14H

2-[(3,4-dihydroxyphenyl)methylidene]propanedinitrile

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (13.43 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (13.43 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。