AH6809

EP/DP receptor
EP1 (Ki = 1217 ± 98 nM) [1]
EP2 (Ki = 1150 ± 36 nM) [1]
EP3‑III (Ki = 1597 ± 140 nM) [1]
DP (Ki = 1415 ± 104 nM) [1]
TP (Ki = 4325 ± 232 nM) [1]

AH 6809 (1 μM；30 分钟) 可抑制巨噬细胞中由锯齿蝰蛇毒液 (TsV) 刺激并由 PGE₂ 放大的 cAMP 和 IL-1β 的产生[4]。AH 6809 (30-300 μM) 可抑制全血中 PGD₂ 的抗血小板聚集活性，表观 pA₂ 值为 5.35[5]。文献报道，AH6809 是一种弱效 EP1 受体拮抗剂，pA₂ 值为 6.4-7.0。它不具有选择性，对 EP2、EP3 和 DP 受体均表现出相似的亲和力。它对 EP2 受体也具有较弱的阻断活性。[1]

AH 6809（5 mg/kg；腹腔注射）可降低TsV诱导的小鼠死亡率、PGE2和IL-1β的产生以及肺部中性粒细胞浸润[4]。

1. 在中国仓鼠卵巢细胞中稳定表达了八种小鼠前列腺素受体类型和亚型，包括前列腺素D（DP）受体、前列腺素F（FP）受体、前列腺素I（IP）受体、血栓素A（TP）受体以及前列腺素E受体的EP1、EP2、EP3和EP4亚型。通过测定放射性配体与相应受体结合的置换曲线的Ki值，检测了32种前列腺素及其类似物的配体结合特性。 2. DP、IP 和 TP 受体表现出较高的配体结合特异性，仅以高亲和力结合其自身假定的配体，例如 DP 受体结合 PGD2、BW245C 和 BW868C，IP 受体结合西卡前列素、伊洛前列素和异卡巴环素，TP 受体结合 S-145、I-BOP 和 GR 32191。3. FP 受体结合 PGF2α 和氟前列醇，Ki 值为 3-4 nM。此外，PGD2、17-苯基-PGE2、STA2、I-BOP、PGE2 和 M&B-28767 也与该受体结合，Ki 值小于 100 nM。4. EP1 受体除结合 PGE2 和 PGE1 外，还结合 17-苯基-PGE2、舒前列酮和伊洛前列素，Ki 值为 14-36 nM。 16,16-二甲基-PGE2 和两种推定的 EP1 受体拮抗剂 AH6809 和 SC-19220 与该受体均未显示出显著的结合。推定的 EP3 受体激动剂 M&B-28767 和推定的 EP2/EP3 受体激动剂米索前列醇也与该受体结合，Ki 值为 120 nM。5. EP2 和 EP4 受体表现出相似的结合特性。除了 PGE2 和 PGE1 外，它们还能结合 16,16-二甲基-PGE2 和 11-脱氧-PGE1。布他前列素、AH-13205 和 AH-6809 可以区分这两种受体，它们能与 EP2 受体结合，但不能与 EP4 受体结合；1-羟基-PGE1 也能区分这两种受体，它能与 EP4 受体结合，但不能与 EP2 受体结合。 6. EP3受体表现出最广泛的结合谱，除了PGE2和PGE1外，还能结合舒前列酮、M&B-28767、GR63799X、11-脱氧-PGE1、16,16-二甲基-PGE2和17-苯基-PGE2，其Ki值为0.6-3.7 nM。此外，三种IP配体（伊洛前列素、卡巴环素和异卡巴环素）以及一种TP配体（STA2）也能与该受体结合，其Ki值分别与这些化合物对IP和TP受体的Ki值相当。 7. 8-Epi-PGF2 α 在 10 μM 浓度下仅与 IP、TP、FP、EP2 和 EP3 受体表现出较弱的结合[2]。

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进行放射性配体结合试验，以确定 AH6809 在 HEK 293(EBNA) 细胞中稳定表达的八种人前列腺素受体的抑制常数 (Ki)。将表达各受体的细胞膜制备物在 0.2 mL 的最终体积中孵育，其中 EP 亚型、FP 和 TP 的孵育液为 10 mM MES/KOH (pH 6.0)，DP 和 IP 的孵育液为 10 mM HEPES/KOH (pH 7.4)，并加入 1 mM EDTA、10 mM MgCl2（EP 亚型）或 10 mM MnCl2（DP、FP、IP、TP），以及相应的放射性配体：EP 亚型使用 [3H]PGE2 (0.5‐1.0 nM)，DP 使用 [3H]PGD2 (0.7 nM)，FP 使用 [3H]PGF2α (0.95 nM)，IP 使用 [3H]iloprost (5 nM)，TP 使用 [3H]SQ‑29548 (1.8 nM)。 EP3 检测体系中还含有 100 μM GTPγS。反应通过加入膜蛋白启动（例如，EP1 约 30 μg，EP2 约 20 μg，EP3 约 2 μg，EP4 约 10 μg，FP 约 60 μg，DP 约 30 μg，IP 约 10 μg，TP 约 10 μg）。AH6809溶于二甲基亚砜（最终浓度为 1% v/v）。非特异性结合用 1 μM 相应的非放射性前列腺素测定。孵育在 30 °C（EP 亚型、DP、FP、TP）或室温（IP）下进行，孵育时间为 60 分钟（EP 亚型、FP、IP）或 30 分钟（DP、TP）。孵育结束后，将样品快速过滤至预先用不含EDTA的测定缓冲液润湿的96孔Unifilter GF/C滤膜上（4℃）。滤膜用3-4 mL相同缓冲液洗涤，于55℃干燥90分钟，并通过闪烁计数法测定残余放射性。特异性结合占总结合的85-95%。Ki值由竞争曲线计算得出。[1]

体外药理学处理
将J774.1巨噬细胞以每孔2 × 10⁵个细胞的密度接种于200 μl含抗生素的无血清RPMI培养基中。然后将细胞置于37 °C、5% CO₂条件下培养2小时。之后，移除上清液，并用以下特异性抑制剂/拮抗剂处理细胞30分钟：吲哚美辛（10 μM）；AH6809（1 μM）；AH23848（1 μM）；U-75302（0.1和1 μM）；以及NFκB激活抑制剂（20 nM）。在刺激前2小时，向细胞培养基中加入H89二盐酸盐水合物（25 μM）。将乙醇储备液中的 AH6809 和 U-75302 用细胞培养基稀释，并向培养基中添加相同浓度（最高 0.1%）的乙醇作为对照。将 DMSO 储备液中的 AH23848 和 NFκB 抑制剂用细胞培养基稀释，并向培养基中添加相同浓度（最高 0.1%）的 DMSO 作为对照。所有化合物均用 200 μl 无血清 DMEM 稀释，并以相同浓度的溶剂稀释液作为对照。处理后，在相同的实验条件下用TsV（50 μg ml−1）刺激细胞，并在37 °C、5% CO2的湿润环境中培养24小时后，收集上清液用于IL-1β定量分析。[4]

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1. 研究了AH6809（6-异丙氧基-9-氧代呫吨-2-羧酸）对全血中各种药物对人血小板的抗聚集和聚集作用的影响。2. 前列腺素D2 (PGD2)、BW245C、9α,11β-PGF2、PGI2和5'-N-乙基羧酰胺腺苷 (NECA) 均能抑制全血中ADP诱导的血小板聚集。 AH6809 可拮抗 PGD2、BW245C 和 9α,11β-PGF2 的抗血小板聚集活性，但对 PGI2 或 NECA 的抗血小板聚集活性无此作用。AH6809 也可拮抗 NECA 的抗血小板聚集活性。3. AH6809 对 PGD2 抗血小板聚集活性的拮抗作用呈浓度依赖性，可通过增加 PGD2 的浓度来克服。数据分析得出 AH6809 的表观 pA2 值为 5.35。4. 在浓度约为拮抗 PGD2 作用所需浓度的 10 倍时，AH6809 也可拮抗全血中 U-46619 的血小板聚集作用（pA2 = 4.45）。然而，浓度高达 300 μM 的 AH6809 对 ADP 或血小板活化因子 (Paf) 诱导的血小板聚集均无影响（pA2 小于 3.5）。5. 在重悬血小板制剂中，AH6809 对 PGD2 和 U-46619 的抑制效力增强，表明该药物与血浆蛋白广泛结合。然而，在重悬血小板中，AH6809 相对于全血的特异性有所降低，因为 ADP 和 Paf 诱导的血小板聚集也受到轻微拮抗。6. 总之，AH6809 似乎是一种作用于人血小板的弱效但特异性的 DP 受体阻断剂，有望成为研究内源性 PGD2 在血小板聚集中的作用以及对抑制血小板聚集的前列腺素类药物的作用机制进行分类的有用药物工具[5]。

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人血通过静脉穿刺采集，并用柠檬酸三钠抗凝。取0.5 ml全血分装于塑料管中，用5% CO₂混合气体冲洗，加盖后置于38 ± 0.5°C的摇床水浴中孵育30分钟。加入阿司匹林（终浓度2 mM）以抑制内源性前列腺素的生成。在加入血小板聚集剂前，将AH6809预孵育10分钟。通过计数单个血小板计数的下降值来量化血小板聚集。分别用ADP、U-46619或Paf诱导血小板聚集。ADP和Paf诱导血小板聚集的峰值出现在1分钟，而U-46619诱导血小板聚集的峰值出现在5分钟。血小板计数的最大下降值以对照组的百分比表示。EC50值定义为血小板计数下降50%时的药物浓度。 [5]
将含有磷酸肌酸和肌酸磷酸激酶的柠檬酸盐抗凝全血离心制备人血小板悬液。在含有前列环素的情况下离心富血小板血浆。将血小板沉淀重悬于含有CP、CPK和肝素的Krebs-Henseleit溶液中，使最终血小板计数达到300-400 × 10^6 ml^-1。取0.25 ml等分试样置于含有阿司匹林（20 μM）的试管中，用5% CO2/空气混合气体冲洗，并储存于约10°C。在启动血小板聚集前加入人纤维蛋白原（100 μg ml^-1）。在加入聚集剂前，将AH6809预孵育10分钟。[5]

未经处理的IL-1r−/−、Casp1/11−/−和C57Bl/6（野生型）小鼠按上述方法接种亚致死剂量或致死剂量的TsV（或PBS）。Alox5−/−小鼠和129sv小鼠预先注射或不注射IL-1受体拮抗剂（IL-1Ra），剂量为10 mg kg−1，腹腔注射，分别在亚致死剂量或致死剂量TsV注射前1小时和注射后1小时再次注射。IL-1Ra由英国国家生物制品检定所的Stephen Poole博士惠赠。在一项特定的实验中，小鼠接受或不接受以下药物治疗：MK886（5-LO 抑制剂，5 mg kg−1 腹腔注射，溶于 200 μl 1% 乙醇水溶液）、吲哚美辛（COX1/2 抑制剂，2 mg kg−1 腹腔注射，溶于 200 μl Tris[羟甲基]氨基甲烷-HCl；TRIS-HCl，pH 8.2）、SC-560（选择性 COX1 抑制剂，3 mg kg−1 腹腔注射，溶于 200 μl PBS）、塞来昔布（COX2 抑制剂，5 mg kg−1 腹腔注射，溶于 200 μl 水）或 EP2 拮抗剂（AH6809，5 mg kg−1 腹腔注射，溶于 200 μl PBS）67。药物（MK886 或吲哚美辛）或溶剂分别在注射致死剂量 TsV 前 4 小时和 0.5 小时，以及注射后 4 小时和 8 小时给药四次。其他药物（SC-560、塞来昔布和 EP2 拮抗剂）或溶剂在腹腔注射致死剂量 TsV（180 μg kg⁻¹）前 1 天和 1 小时给药。在其他实验中，Alox5⁻/⁻ 小鼠接受或不接受 LTB4 处理（每只小鼠 50 ng，鼻内给药，溶于 20 μl PBS）。LTB4 或溶剂（PBS + 0.05% 乙醇）在注射致死剂量 TsV（180 μg kg⁻¹）前 2 小时和 0.5 小时给药。小鼠死亡后立即取出肺脏，或在注射 TsV 或溶剂后 8-12 小时处死存活小鼠。在一些实验中，两组小鼠分别接种PBS或亚致死剂量（120 μg kg−1）的TsV，其中一组在4小时后收集支气管肺泡灌洗液（BALF），用于计数总细胞数和中性粒细胞，如前所述⁴⁷。另一组小鼠未进行BALF收集，取出肺脏并称重，取2 mg肺组织在2 ml不完全RPMI培养基中匀浆。离心（400 g，10 min）后，将上清液转移至新的离心管中，分成两份1 ml的样品，并储存于−80 °C直至使用。一份样品用于IL-1β和蛋白质定量分析，另一份用于PGE2和LTB4测定。为分析MPO活性，切取一个肺小叶，立即液氮速冻，并储存于−80 °C直至使用。在治疗方案中，分别注射致死剂量（180 μg kg−1）和超剂量（360 μg kg−1）的TsV，并在注射后15或30分钟以及4小时和8小时后分别给予吲哚美辛（2 mg kg−1，腹腔注射）或载体。存活的小鼠在中毒后12小时处死。[4]

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C57BL/6小鼠（6-8周龄，雌雄均有，性别和年龄匹配）腹腔注射致死剂量的锯齿蝰蛇毒液（TsV），剂量为180 µg/kg，溶于200 µl PBS中。AH6809以5 mg/kg的剂量腹腔注射，溶于200 µl PBS中，分别在TsV注射前24小时和1小时给药。对照组小鼠仅注射载体（PBS）。毒液注入后，对小鼠的存活情况进行8-12小时的监测。小鼠死亡后立即取出肺脏，或在毒液注入后8-12小时处死存活小鼠，然后对肺实质中的蛋白质含量、PGE2释放、IL-1β生成、LTB4释放和MPO活性进行定量分析。[4]

与全血相比，在重悬血小板制剂中，AH6809对PGD2和U-46619的效力增强，表明该药物与血浆蛋白广泛结合。[5]

在重悬血小板中，AH6809的特异性相对于全血中的特异性有所降低，因为ADP和Paf诱导的血小板聚集也略有减弱。[5]

[1]. The utilization of recombinant prostanoid receptors to determine the affinities and selectivities of prostaglandins and related analogs. Biochim Biophys Acta. 2000 Jan 17;1483(2):285-93.

[2]. Ligand binding specificities of the eight types and subtypes of the mouse prostanoid receptors expressed in Chinese hamster ovary cells. Br J Pharmacol. 1997 Sep;122(2):217-24.

[3]. 6-Isopropoxy-9-oxoxanthene-2-carboxylic acid (AH 6809), a human EP2 receptor antagonist. Biochem Pharmacol. 1995 Nov 9;50(10):1731-3.

[4]. Opposing roles of LTB4 and PGE2 in regulating the inflammasome-dependent scorpion venom-induced mortality. Nat Commun. 2016 Feb 23;7:10760.

[5]. AH6809, a prostaglandin DP-receptor blocking drug on human platelets. Br J Pharmacol. 1988 Jul;94(3):745-54.

9-O-6-丙-2-氧基-2-呫吨酸属于呫吨酮类化合物。

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AH6809已被用作研究前列腺素受体药理学的实验工具。它是少数几种被报道对EP2受体具有弱阻断活性的化合物之一，尽管目前尚无选择性EP2受体拮抗剂。该化合物是呫吨酮衍生物。

C17H14O5

298.29006

298.084

C, 68.45; H, 4.73; O, 26.82

33458-93-4

119461

White to off-white solid powder

1.3±0.1 g/cm3

514.2±50.0 °C at 760 mmHg

192.9±23.6 °C

0.0±1.4 mmHg at 25°C

1.618

3.91

76.74

1

5

3

22

446

0

O=C1C2=C(C=CC(C(O)=O)=C2)OC3=CC(OC(C)C)=CC=C31

AQFFXPQJLZFABJ-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C17H14O5/c1-9(2)21-11-4-5-12-15(8-11)22-14-6-3-10(17(19)20)7-13(14)16(12)18/h3-9H,1-2H3,(H,19,20)

9-oxo-6-propan-2-yloxyxanthene-2-carboxylic acid

AH-6809; AH6809; AH 6809; 33458-93-4; AH 6809; 6-Isopropoxy-9-oxoxanthene-2-carboxylic acid; AH-6809; AH6809; 6-isopropoxy-9-oxo-9h-xanthene-2-carboxylic acid; 9-oxo-6-propan-2-yloxyxanthene-2-carboxylic acid; 6-(1-Methylethoxy)-9-oxo-9H-xanthene-2-carboxylic acid;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: ~25 mg/mL (~83.8 mM)
H2O: ~0.1 mg/mL (~0.3 mM)

配方 1 中的溶解度: 2.5 mg/mL (8.38 mM) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液；超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: 2.5 mg/mL (8.38 mM) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。