ALC-0159   中文名称: ALC-0159

Ionizable cationic lipid; RNA delivery
ALC-0159 does not act by binding to specific biological targets; its function is based on physicochemical mechanisms. As a PEG-lipid, it forms a PEG “brush” layer on the LNP surface through steric hindrance. This layer serves two primary purposes: during preparation and storage, it prevents LNP particle aggregation via steric repulsion; in vivo, it reduces adsorption of serum proteins (i.e., reduces opsonization) to evade recognition and clearance by the mononuclear phagocytic system. Proper PEG chain length and density are critical for achieving these “stealth” properties and prolonging circulation half-life. ALC-0159 is typically used at a low molar ratio (approximately 1.5%) in formulations to balance circulation time with target cell uptake efficiency.
ALC-0159 does not have a traditional biological target as a therapeutic agent; instead, it functions as a structural and functional component of lipid nanoparticle (LNP) formulations. As a PEGylated lipid, it forms a hydrophilic layer on the surface of LNPs that sterically stabilizes the nanosystem. This PEG layer contributes to storage stability and reduces non-specific binding to proteins, thereby prolonging the circulation time of the nanoparticles in vivo.

脂质纳米粒子的制备
本节描述了基于FDA批准的COVID-19 mRNA疫苗BNT162b2的脂质纳米粒子（LNP）的配制方法。该脂质混合物由ALC-0315、DSPC、胆固醇和ALC-0159组成，摩尔比分别为46.3 : 9.4 : 42.7 : 1.6。RNA与总脂质的重量比为0.05（wt/wt）。
A. 脂质相的制备
1. 将每种脂质溶解于乙醇中，配制成浓度为10 mg/mL的储备液。这些储备液可储存于20 °C以备后用。
注1：可电离脂质通常为粘稠液体，为确保准确性，应按重量而非移液量进行称量。
注2：胆固醇溶液必须保持温暖（>37 °C）以保持液态。使用前避免冷却。
2. 制备1 mL脂质混合物（含10 mg总脂质），将以下体积的10 mg/mL储备液混合：
- 560 µL ALC-0315
- 261 µL胆固醇
- 117 µL DSPC
- 62 µL ALC-0159
充分混合直至溶液澄清。
注3：脂质的选择和比例可以调整，这将影响LNP的特性，例如尺寸、多分散性、功效和所需的mRNA量。
B. mRNA的制备
1. 在100 mM乙酸钠缓冲液（pH 5）中制备浓度为166.7 µg/mL的mRNA溶液。
注4：脂质与mRNA的质量比会影响包封效率。用户可以调整该比例以开发不同的配方。
C. 混合方法
三种常用的快速混合两相的方法包括：移液器混合、涡旋混合和微流控混合。前两种方法可能会产生异质性更大、包封效率更低、变异性更高的脂质纳米颗粒（LNP），而微流控混合则具有更好的控制性、可重复性和均匀性。
1. 移液器混合法
1.1. 快速将3 mL mRNA溶液加入1 mL脂质混合物中（典型的乙醇与水缓冲液体积比为1:3）。立即用移液器上下剧烈吹吸混合液20-30秒。
1.2. 将混合物在室温下静置最多15分钟。
1.3.混合后，将LNP悬浮液在PBS缓冲液（pH 7.4）中透析2小时，然后通过0.2 µm滤膜过滤除菌，并储存于4 °C。
2. 涡旋混合法
1.1. 以中等速度涡旋3 mL mRNA溶液。涡旋的同时，快速加入1 mL脂质混合物（乙醇与缓冲液的比例为1:3）。继续涡旋20-30秒。
1.2. 将所得分散液在室温下孵育至多15分钟。
1.3. 在PBS缓冲液（pH 7.4）中透析2小时，通过0.2 µm滤膜过滤除菌，并储存于4 °C。
3. 微流控混合法
1.1.使用微流控装置，将 3 mL mRNA 溶液与 1 mL 脂质混合物以 12 mL/min 的总流速混合（乙醇与缓冲液的体积比为 1:3）。
注 5：可以调整流速比和总流速等操作参数，以微调 LNP 的性质。
1.2.混合后，用 PBS（pH 7.4）透析 2 小时，用 0.2 µm 滤膜过滤，并储存于 4 °C。

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mRNA 合成及在可电离脂质纳米颗粒中的包封方案：[2]
基本方案 1：体外转录和酶促加帽加尾合成 mRNA
基本方案 2：将 mRNA 包封到可电离脂质纳米颗粒中
替代方案：使用预制囊泡进行小规模 mRNA 包封
基本方案 3：mRNA 可电离脂质纳米颗粒的表征和质量控制。
更多详情，请参阅 https://currentprotocols.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/cpz1.898

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通过空间位阻机制， ALC-0159 的聚乙二醇 (PEG) 部分有助于纳米颗粒的稳定性 [1]。
辉瑞-BioNTech COVID-19 疫苗中的脂质纳米颗粒 (LNP) 含有低浓度 (<2 mol%) 的 ALC-0159，其聚乙二醇 (PEG) 部分通过空间位阻机制有助于纳米颗粒的稳定。在 Moderna COVID-19 疫苗中，ALC-0159 被另一种聚乙二醇化脂质 (1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基PEG2000) 所取代。基于先前报道的部分静脉输注聚乙二醇化纳米药物的患者出现过敏反应，有学者推测聚乙二醇化脂质ALC-0159可能在诱发过敏反应中发挥作用。[1]体外实验表明，ALC-0159的活性主要体现在其作为脂质纳米颗粒（LNP）组分对核酸递送效率的贡献上。含有ALC-0159的可电离脂质纳米颗粒能够高效包裹mRNA，保护其免受核糖核酸酶（RNase）降解，并将mRNA递送至细胞质进行蛋白质表达。研究表明，LNP中ALC-0159的摩尔比必须精确控制：比例过低会导致稳定性不足和聚集，而比例过高则会导致聚乙二醇层过密，抑制细胞摄取和内体逃逸，从而降低转染效率。辉瑞-BioNTech疫苗LNP制剂中ALC-0159的含量约为1.5%，经验证为最佳比例。其体外功能通过评估LNP粒径、包封率和细胞内报告基因（例如荧光素酶）的表达来间接评价。
由于ALC-0159是一种制剂辅料而非药理活性化合物，因此未在基于细胞的检测中对其直接生物活性进行评估。其主要功能是促进形成稳定的LNP，从而保护并递送mRNA载荷。评估含有ALC-0159的LNP制剂的研究主要关注粒径、zeta电位、包封率和细胞系中mRNA表达水平等参数。

ALC-0159 的体内活性体现在其在脂质纳米颗粒 (LNP) 中的功能。在动物模型中，含有 ALC-0159 的 LNP-mRNA 疫苗可诱导强效的抗原特异性免疫反应。聚乙二醇化脂质赋予 LNP 在体内“隐蔽”特性，可减少肝脏和脾脏巨噬细胞的快速清除，并使更多纳米颗粒到达靶组织（例如注射部位的引流淋巴结或肌肉组织）。在辉瑞-BioNTech COVID-19 疫苗中，含有 ALC-0159 的 LNP 成功地将编码 SARS-CoV-2 刺突蛋白的 mRNA 递送至抗原呈递细胞，诱导中和抗体和 T 细胞免疫。在非人灵长类动物和人体中进行的临床研究已证实该制剂具有良好的免疫原性和保护效力。
在体内，含有 ALC-0159 的 LNP 已作为辉瑞-BioNTech COVID-19 疫苗的一部分进行了广泛的评估。该化合物通过提供聚乙二醇（PEG）保护层，减少网状内皮系统的调理作用和清除，从而改善脂质纳米颗粒制剂的整体药代动力学和生物分布特性。这延长了纳米颗粒的循环时间，并增强了其在淋巴结等靶部位的积累。

由于在新冠肺炎疫情期间的成功应用，mRNA疫苗近期引起了广泛关注。其成功归功于mRNA设计及其封装到可电离脂质纳米颗粒（iLNP）中的技术进步。这凸显了mRNA-iLNP在其他领域（例如癌症、基因治疗或针对不同传染病的疫苗）的应用潜力。本文介绍了一种利用市售试剂制备适用于疫苗和治疗药物的mRNA-iLNP的方法。文中详细阐述了通过体外转录结合酶促加帽和加尾合成mRNA，以及使用可电离脂质DLin-MC3-DMA将mRNA封装到iLNP中的实验方案。DLin-MC3-DMA常被用作新制剂的基准，并为筛选mRNA设计提供了一种高效的递送载体。该方案还描述了如何将该制剂应用于其他脂质。最后，本文提出了一种用于表征和质量控制mRNA-iLNP的逐步方法，包括测量mRNA浓度和包封率、粒径和zeta电位。[2]

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ALC-0159不参与传统的酶或受体结合实验；其在无细胞体系中的评估侧重于LNP的理化性质表征。典型的实验方案如下：1）将ALC-0159与其他脂质（可电离脂质、胆固醇、辅助磷脂）以优化的摩尔比溶解于无水乙醇中。2）使用微流控装置将脂质-乙醇溶液与含有mRNA的柠檬酸盐缓冲液（pH 4.0）快速混合，以自组装形成LNP。3）使用动态光散射法测量平均粒径（目标80-120 nm）、多分散指数（PDI < 0.2）和zeta电位（在生理pH值下接近中性）。 4) 使用RiboGreen荧光染料法测定mRNA包封率。5) ALC-0159的PEG链结构可通过飞行时间高分辨率质谱法进行表征，结果显示其分子量分布呈多分散性，平均分子量约为2500 Da。
由于ALC-0159是一种制剂辅料，因此其体外试验并非着重于酶或受体结合。表征试验通常包括对脂质纳米颗粒制剂进行物理和化学分析。这些分析包括动态光散射(DLS)测定粒径和多分散性、zeta电位测定表面电荷，以及使用荧光标记的mRNA或基于高效液相色谱(HPLC)的方法测定包封率。

体外细胞实验主要用于评估含ALC-0159的脂质纳米颗粒（LNP）的递送效率和细胞毒性。实验方案如下：1）采用标准微流控方法制备含ALC-0159的LNP-mRNA。2）将靶细胞（例如HEK293T细胞、DC2.4树突状细胞或HeLa细胞）接种于培养板中（每孔约1×10⁵个细胞），并过夜培养以使其适应贴壁或悬浮状态。3）向培养基中加入不同浓度的LNP-mRNA，并在37℃、5% CO₂条件下孵育24-48小时。4）评估递送效率：如果递送的是编码GFP或荧光素酶的mRNA，则通过流式细胞术或荧光显微镜评估荧光强度，或通过荧光素酶活性测定进行定量。5）使用CCK-8或MTT法评估细胞活力，以评价LNP的细胞毒性。 6) 通过流式细胞术（使用荧光标记的mRNA）测定细胞摄取效率。
ALC-0159的细胞检测是LNP制剂开发和评估的一部分。将HEK293T或其他哺乳动物细胞系用含有ALC-0159和编码报告蛋白（例如，荧光素酶或GFP）的mRNA的LNP制剂进行处理。通过发光或荧光检测定量报告基因表达来测量转染效率。使用标准细胞活力检测评估细胞毒性。

体内动物实验主要用于评估含有ALC-0159的LNP-mRNA疫苗或治疗药物的疗效、生物分布和免疫原性。小鼠模型实验方案：1）将6-8周龄的雌性BALB/c或C57BL/6小鼠随机分为治疗组和对照组（每组5-8只小鼠）。2）通过肌肉注射（后肢）或静脉注射（尾静脉）的方式，给小鼠注射含有ALC-0159的LNP-mRNA（mRNA剂量通常为1-50 μg/只）。3）在给药后多个时间点（例如6小时、24小时、48小时、72小时）采集血液样本并解剖主要组织（肌肉、淋巴结、肝脏、脾脏）。4）使用体内成像系统观察荧光标记的mRNA在组织中的分布。 5) 通过 ELISA 法测定血清中特异性抗体滴度，并通过 ELISpot 或流式细胞术检测 T 细胞反应。6) 药代动力学研究中，采用 LC-MS/MS 法定量测定血浆和组织中 ALC-0159 的浓度。研究表明，肌内注射 5 mg/kg ALC-0159 后，峰浓度 Cmax 约为 3.4 μg/mL，消除半衰期 t₁/₂ 约为 130.9 小时。
ALC-0159 的体内动物研究是 mRNA-LNP 疫苗临床前评估的一部分。小鼠、大鼠或非人灵长类动物通过肌内或静脉注射给予含有 ALC-0159 的 LNP。通过测量各种组织中 mRNA 或蛋白质的表达来评估生物分布。通过测量抗体滴度和 T 细胞反应来评估免疫原性。同时评估毒性和耐受性。

本研究系统地考察了ALC-0159在大鼠体内的药代动力学。该聚乙二醇化脂质体在血浆中的消除速度极慢。肌注5 mg/kg后，主要药代动力学参数如下：峰浓度Cmax为3.415±0.794 μg/mL；消除半衰期t₁/₂为130.9±60.671小时；清除率CL为0.024±0.006 L/h/kg；表观分布容积Vd为4.27±1.476 L/kg；曲线下面积AUC(0-t)为181.061±36.533 mg/L·h；平均滞留时间MRT(0-∞)为133.645±43.629小时。10 mg/kg剂量组也表现出类似的缓慢消除特征，t₁/₂约为103.7小时。排泄研究表明，ALC-0159 主要以原形经粪便排出，120 小时内粪便累积排泄率约为给药剂量的 72.0%，而尿液浓度低于定量下限。
ALC-0159 是一种聚乙二醇化脂质，分子量约为 2 kDa。其药代动力学特性取决于其与脂质纳米颗粒 (LNP) 的结合，这会影响制剂的整体生物分布和清除。聚乙二醇部分提供了一个亲水表面，可减少蛋白质吸附和单核吞噬细胞系统的摄取，从而延长循环时间。该化合物作为 LNP 脂质成分的一部分进行代谢和清除。

作为一种聚乙二醇（PEG）脂质，ALC-0159 的毒理学问题主要集中在其潜在的免疫原性和超敏反应上。已知聚乙二醇化合物会在某些个体中诱导产生抗聚乙二醇抗体，从而可能导致过敏反应。2020 年 12 月至 2021 年 8 月期间，在美国和欧洲接种约 5.6 亿剂 Comirnaty® 疫苗后，记录了约 5805 例过敏性休克报告（约占每百万剂 10.44 例），ALC-0159 被认为是潜在的致敏赋形剂。此外，当 ALC-0159 与 siRNA 共价结合并在组织中高浓度积累（例如，>20 pmol/mg 组织）时，可能会观察到基因表达的非特异性调节，这表明在高剂量或采用特定递送策略时存在潜在风险。体外细胞试验表明，含有ALC-0159的脂质纳米颗粒（LNP）在治疗浓度下未显示出明显的细胞毒性。
ALC-0159的毒性数据来源于含有该赋形剂的mRNA-LNP疫苗的临床前和临床研究。已开展全面的毒理学研究以支持其在疫苗制剂中的应用。这些研究评估了注射部位的局部耐受性、全身毒性、免疫毒性以及生殖和发育毒性。该化合物在疫苗制剂中使用的浓度下通常具有良好的耐受性。

[1]. Allergic Reactions and Anaphylaxis to LNP-Based COVID-19 Vaccines. Mol Ther. 2021 Mar 3;29(3):898-900.

ALC-0315 是一种可电离的氨基脂质，负责 mRNA 的压缩，并通过假定的内体去稳定机制促进 mRNA 的递送和胞质释放。辉瑞-BioNTech COVID-19 疫苗中的脂质纳米颗粒 (LNP) 含有低浓度 (<2 mol%) 的 ALC-0159，其聚乙二醇 (PEG) 部分的空间位阻机制有助于纳米颗粒的稳定性。鉴于 ALC-0159 含量较低，辉瑞-BioNTech COVID-19 疫苗中的 LNP 可能仅表现出较弱的 PEG 空间位阻。[1]

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参见图 1，其中红色箭头指示安全终止点。
基本方案 1：体外转录和 mRNA 的酶促加帽和加尾
完成整个方案（包括加帽和加尾 mRNA 的制备和评估）需要 2 至 4 天。如果计划进行过夜沉淀，则需要 4 天。体外转录、加帽和加尾反应大约需要半天。所有反应准备工作大约可以在 1 小时内完成，之后是所需的孵育时间：体外转录 2 小时，加帽/加尾 1 小时。mRNA 沉淀需要 30 分钟的离心步骤，RNA 重悬大约需要 10 分钟。使用 Nanodrop、琼脂糖凝胶和自动凝胶电泳对 mRNA 进行质量评估需要 1 小时。
注意：当实验规模扩大时，需要更多时间，尤其是在需要将多个或大量的 mRNA 沉淀物重悬于无核酸酶水中时。
基本方案 2：将 mRNA 包封于 iLNP
脂质溶液的制备可在配制步骤之前进行。否则，整个包封方案必须在同一天完成。所有试剂在使用前均需在室温下放置 1 小时，DPBS 中的配制和稀释也需要 1 小时。离心浓缩步骤的时间取决于颗粒大小、样品总体积和所需的最终体积。通常需要 1 至 4 小时。浓缩的 iLNP 溶液可储存在冰箱中，直至使用 RiboGreen 检测确定所需的稀释度。替代方案：使用预制囊泡进行小规模 mRNA 包封。与基本方案 2 相同。基本方案 3：mRNA iLNP 的表征和质量控制。RiboGreen 检测需要 1 至 2 小时，包括试剂盒从冰箱取出后升温至室温的时间。在进行生物学评价之前，应在最终稀释的样品上进行动态光散射（DLS，包括粒径、多分散指数（PDI）和zeta电位）分析。样品制备需要几分钟，分析时间因仪器而异，但通常每个样品需要5到10分钟。TNS检测中使用的缓冲液必须在使用前达到室温。根据分装量的不同，这可能需要几个小时。缓冲液可以在检测前一晚冷藏，以减少预热时间。每个iLNP样品需要在96孔板中分装40份，因此每个iLNP样品需要10到15分钟的孔板制备时间和10分钟的读板时间。mRNA提取步骤需要30分钟。有关提取的mRNA的自动凝胶电泳分析，请参阅上文（基本方案1）。[3]ALC-0159是一种药用辅料，也是辉瑞-BioNTech COVID-19疫苗（Comirnaty）的关键成分。它并非活性药物成分，而是一种功能性脂质，可用于递送mRNA疗法。该化合物可从化学品供应商处获得，用于研发用途，尤其适用于制备用于核酸递送的脂质纳米颗粒。它尚未获批作为独立药物产品上市。

(C2H4O)NC31H63NO2

1849616-42-7

155977658

White to off-white solid

39.8Ų

1

4

31

38

415

0

O=C(C([H])([H])OC([H])([H])C([H])([H])OC([H])([H])[H])N(C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H].N([H])([H])[H]

BPWFJNQUTKVHIR-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C33H67NO3/c1-4-6-8-10-12-14-16-18-20-22-24-26-28-34(33(35)32-37-31-30-36-3)29-27-25-23-21-19-17-15-13-11-9-7-5-2/h4-32H2,1-3H3

2-[(polyethylene glycol)-2000]-N,N-ditetradecylacetamide

ALC0159; ALC 0159; ALC-0159; Azane;2-(2-methoxyethoxy)-N,N-di(tetradecyl)acetamide; mPEG-DTA; PEG-N,N-ditetradecylacetamide; ALC-0159

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~100 mg/mL
Ethanol :≥ 50 mg/mL

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (Infinity mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (Infinity mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (Infinity mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。