ALC-0159   中文名称: ALC-0159

Ionizable cationic lipid; RNA delivery
ALC-0159 does not act by binding to specific biological targets; its function is based on physicochemical mechanisms. As a PEG-lipid, it forms a PEG “brush” layer on the LNP surface through steric hindrance. This layer serves two primary purposes: during preparation and storage, it prevents LNP particle aggregation via steric repulsion; in vivo, it reduces adsorption of serum proteins (i.e., reduces opsonization) to evade recognition and clearance by the mononuclear phagocytic system. Proper PEG chain length and density are critical for achieving these “stealth” properties and prolonging circulation half-life. ALC-0159 is typically used at a low molar ratio (approximately 1.5%) in formulations to balance circulation time with target cell uptake efficiency.

本部分描述了基于FDA批准的COVID-19 mRNA疫苗BNT162b2配方的脂质纳米颗粒（LNP）制备方法。该制剂的脂质摩尔比为：ALC-0315 : DSPC : 胆固醇 : ALC-0159 = 46.3 : 9.4 : 42.7 : 1.6，RNA与总脂质的重量比为0.05 (wt/wt)。
A. 脂质相的制备
1. 将每种脂质溶于乙醇，配制成10 mg/mL的储备液，可于20 °C保存备用。
注1：可电离脂质通常为粘稠液体，应通过称重而非移液体积来准确量取。
注2：胆固醇溶液需保持温暖（>37 °C）以维持流动性，使用前应避免冷却。

2. 按如下体积混合各脂质储备液，配制1 mL脂质混合物（含10 mg总脂质）：
- 560 µL ALC-0315（10 mg/mL）
- 261 µL 胆固醇（10 mg/mL）
- 117 µL DSPC（10 mg/mL）
- 62 µL ALC-0159（10 mg/mL）
充分混合至澄清。
注3：脂质种类和比例可根据需要调整，这将影响LNP的粒径、分散度、递送效率及所需的mRNA量。

B. mRNA相的制备
1. 将mRNA溶于100 mM醋酸钠缓冲液（pH 5），配制成166.7 µg/mL的工作液。
注4：脂质与mRNA的质量比会影响包封效率。使用者可调整该比例以开发不同配方。

C. 混合方法
快速混合两相溶液常用三种方法：移液器混合法、涡旋混合法和微流控混合法。前两种方法可能产生异质性较高、包封率较低且重复性较差的LNP，而微流控混合法具有更好的可控性、重复性和产物均一性。
1. 移液器混合法
1.1. 将3 mL mRNA溶液快速加入1 mL脂质混合物中（乙醇相与水相的体积比通常为1:3）。立即用移液器快速吸打20–30秒。
1.2. 室温静置孵育不超过15分钟。
1.3. 混合后，用PBS（pH 7.4）透析2小时，经0.2 µm滤膜过滤除菌，于4 °C保存。

2. 涡旋混合法
1.1. 以中等速度涡旋振荡3 mL mRNA溶液，在振荡过程中快速加入1 mL脂质混合物（乙醇与水相体积比1:3）。继续涡旋20–30秒。
1.2. 室温静置孵育不超过15分钟。
1.3. 用PBS（pH 7.4）透析2小时，经0.2 µm滤膜过滤除菌，于4 °C保存。

3. 微流控混合法
1.1. 使用微流控装置，以12 mL/min的总流速混合3 mL mRNA溶液与1 mL脂质混合物（乙醇与水相体积比为1:3）。
注5：流速比和总流速等参数可调整以优化LNP性能。
1.2. 混合后，用PBS（pH 7.4）透析2小时，经0.2 µm滤膜过滤除菌，于4 °C保存。

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可电离脂质纳米粒中mRNA合成和包封的方案：[1]
基本方案1：通过体外转录和酶盖和拖尾合成mRNA
基本方案2：将mRNA封装到可电离的脂质纳米颗粒中
替代方案：使用预制囊泡对mRNA进行小规模封装
基本方案3：mRNA可电离脂质纳米颗粒的表征和质量控制
更多详细制备方案和实验操作信息，请参阅https://currentprotocols.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/cpz1.898

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通过空间机制，ALC-0159 的聚乙二醇 (PEG) 部分有助于纳米颗粒的稳定性 [1]。
Pfizer-BioNTech新冠肺炎疫苗中的LNP含有低水平（＜2 mol%）的ALC-0159，这通过其聚（乙二醇）（PEG）部分的立体机制有助于纳米粒子的稳定。在Moderna新冠肺炎疫苗中，ALC-0159被另一种聚乙二醇化脂质（1,2-二肉豆蔻酰rac-甘油-3-甲氧基PEG2000）取代。根据早期报道的静脉注射聚乙二醇化纳米药物的一些受者的过敏反应，人们猜测ALC-0159（聚乙二醇化脂质）可能在引发过敏反应中发挥作用。[1]

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在体外实验中，ALC-0159的活性主要体现在其作为LNP组分对核酸递送效率的贡献。包含ALC-0159的可电离脂质纳米颗粒能够有效包封mRNA，保护其免受核糖核酸酶的降解，并将mRNA递送至细胞质进行蛋白表达。研究表明，ALC-0159在LNP中的摩尔比例需精确控制：比例过低则LNP稳定性不足、易聚集；比例过高则过密的PEG层会抑制细胞摄取和内体逃逸，从而降低转染效率。在Pfizer-BioNTech疫苗的LNP配方中，约1.5%的ALC-0159比例被验证为优化的平衡点。通常通过评估LNP的粒径、包封率及在细胞中的报告基因表达（如荧光素酶）来间接评价其体外功能。

ALC-0159的体内活性主要通过其在LNP中的功能来体现。在动物模型中，包含ALC-0159的LNP-mRNA疫苗能够诱导强烈的抗原特异性免疫应答。PEG化脂质使LNP在体内具有“隐形”特性，减少被肝脏和脾脏巨噬细胞的快速清除，从而有更多纳米颗粒到达靶组织（如注射部位引流淋巴结或肌肉组织）。在Pfizer-BioNTech新冠疫苗中，含有ALC-0159的LNP成功将编码SARS-CoV-2刺突蛋白的mRNA递送至抗原呈递细胞，诱导产生中和抗体和T细胞免疫。在非人类灵长类动物和人类的临床研究中，该配方显示出良好的免疫原性和保护效果。

mRNA疫苗最近因其在新冠肺炎大流行期间的成功而引起了人们的极大兴趣。他们的成功是由于mRNA设计和封装到可电离脂质纳米颗粒（iLNP）中的进步。这突出了mRNA-iLNPs在其他环境中的应用潜力，如癌症、基因治疗或不同传染病的疫苗。在这里，我们描述了使用适合用作疫苗和治疗剂的市售试剂生产mRNA iLNP。本文详细介绍了通过酶盖和拖尾的体外转录合成mRNA，以及使用可电离脂质DLin-MC3-DMA将mRNA封装到iLNP中的方案。DLin-MC3-DMA经常被用作新制剂的基准，并为筛选mRNA设计提供了一种有效的递送载体。该方案还描述了制剂如何适应其他脂质。最后，提出了一种用于mRNA iLNP表征和质量控制的逐步方法，包括测量mRNA浓度和包封效率、粒径和ζ电位。[2]

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ALC-0159不涉及传统的酶或受体结合实验，其在非细胞体系中的评价主要关注LNP的物理化学性质。典型流程：1）将ALC-0159与其他脂质（可电离脂质、胆固醇、辅助磷脂）按优化摩尔比溶解于无水乙醇中。2）通过微流控装置将脂质乙醇溶液与含mRNA的柠檬酸缓冲液（pH 4.0）快速混合，自组装形成LNP。3）使用动态光散射仪测定LNP的平均粒径（目标80-120 nm）、多分散系数（PDI<0.2）和Zeta电位（生理pH下接近中性）。4）使用RiboGreen荧光染料法测定mRNA包封率。5）ALC-0159的PEG链结构可通过飞行时间高分辨质谱进行表征，其分子量呈多分散分布，以约2500 Da为均值呈正态分布。

体外细胞实验主要用于评价含ALC-0159的LNP的递送效率和细胞毒性。流程如下：1）按照标准微流控法制备含ALC-0159的LNP-mRNA。2）将目标细胞（如HEK293T、DC2.4树突状细胞或HeLa细胞）接种于培养板（每孔约1×10⁵个细胞），培养过夜使其贴壁或适应悬浮状态。3）将LNP-mRNA按不同浓度加入培养基中，于37°C、5% CO₂条件下孵育24-48小时。4）评估递送效率：若递送编码GFP或荧光素酶的mRNA，可通过流式细胞术或荧光显微镜观察荧光强度，或通过荧光素酶活性测定进行定量。5）通过CCK-8或MTT法检测细胞活力，以评估LNP的细胞毒性。6）通过流式细胞术检测细胞摄取效率（可使用荧光标记的mRNA）。

体内动物实验主要用于评价含ALC-0159的LNP-mRNA疫苗或治疗药物的药效、生物分布和免疫原性。以小鼠模型为例的流程：1）将6-8周龄雌性BALB/c或C57BL/6小鼠随机分为治疗组和对照组（每组5-8只）。2）通过肌肉注射（大腿内侧）或静脉注射（尾静脉）给予含ALC-0159的LNP-mRNA（mRNA剂量通常为1-50 μg/只）。3）在给药后的多个时间点（如6h、24h、48h、72h）采集血液，并解剖收集主要组织（肌肉、淋巴结、肝脏、脾脏）。4）使用小动物活体成像系统观察荧光标记mRNA的组织分布。5）通过ELISA检测血清中的特异性抗体滴度，通过ELISpot或流式细胞术检测T细胞应答。6）在药代动力学研究中，采用LC-MS/MS方法检测血浆和组织中的ALC-0159浓度。研究显示，肌肉注射5 mg/kg ALC-0159后，达峰浓度Cmax约为3.4 μg/mL，消除半衰期t₁/₂约为130.9小时。

ALC-0159在大鼠体内的药代动力学已有系统性研究。该PEG-脂质在血浆中消除非常缓慢。肌肉注射5 mg/kg后，主要药代参数为：达峰浓度Cmax 3.415±0.794 μg/mL；消除半衰期t₁/₂ 130.9±60.671小时；清除率CL 0.024±0.006 L/h/kg；表观分布容积Vd 4.27±1.476 L/kg；药-时曲线下面积AUC(0-t) 181.061±36.533 mg/L·h；平均滞留时间MRT(0-∞) 133.645±43.629小时。10 mg/kg剂量组显示相似的缓慢消除特征，t₁/₂约为103.7小时。排泄研究显示，ALC-0159主要以原形通过粪便排出，120小时内粪便累积排泄率约为给药量的72.0%，而尿液中的含量低于检测下限。

ALC-0159作为PEG-脂质，其毒理学关注点主要与其潜在的免疫原性和超敏反应有关。基于PEG的化合物已知可在部分个体中诱导产生抗PEG抗体，从而导致过敏反应。在2020年12月至2021年8月期间，美国和欧洲在接种约5.6亿剂Comirnaty®疫苗后报告了约5805例过敏反应（发生率约每百万剂10.44例），推测ALC-0159可能是潜在致敏辅料之一。此外，当ALC-0159共价偶联siRNA并在组织中蓄积水平较高时（如>20 pmol/mg组织），可能观察到非特异性的基因表达调控，提示高剂量或特定递送策略存在潜在风险。在体外细胞实验中，含ALC-0159的LNP在治疗浓度下未观察到显著细胞毒性。

[1]. Allergic Reactions and Anaphylaxis to LNP-Based COVID-19 Vaccines. Mol Ther. 2021 Mar 3;29(3):898-900.

ALC-0315 是一种可电离的氨基脂质，负责 mRNA 的压缩，并通过推测的内体去稳定作用促进 mRNA 的细胞递送和胞质释放。辉瑞-BioNTech 新冠疫苗中的脂质纳米颗粒 (LNP) 含有低浓度（<2 mol%）的 ALC-0159，ALC-0159 通过其聚乙二醇 (PEG) 部分的空间位阻机制有助于纳米颗粒的稳定。考虑到 ALC-0159 含量较低，辉瑞-BioNTech 新冠疫苗中的 LNP 很可能仅表现出较弱的 PEG 空间位阻。 [1]

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请参考图 1，红色箭头指示安全终止点。
基本方案 1：体外转录和酶促加帽加尾合成 mRNA
完成整个方案（包括加帽加尾 mRNA 的制备和评估）需要 2 至 4 天。如果计划过夜沉淀，则需要 4 天。体外转录、加帽和加尾反应大约需要半天时间。所有反应的准备工作可在约 1 小时内完成，随后进行所需的孵育时间：体外转录 2 小时，加帽/加尾 1 小时。mRNA 沉淀需要 30 分钟的离心步骤，RNA 重悬需要约 10 分钟。使用 Nanodrop、琼脂糖凝胶和自动凝胶电泳对 mRNA 进行质量评估需要 1 小时。
注意：当放大实验规模时，需要更多时间，尤其是在需要将多个或较大的 mRNA 沉淀物重悬于无核酸酶水中时。
基本方案 2：将 mRNA 包封到 iLNP 中
脂质溶液的制备可以在配制步骤之前进行。否则，整个包封方案必须在同一天完成。所有试剂在使用前需放置 1 小时使其达到室温，配制和稀释到 DPBS 中也需 1 小时。离心浓缩步骤的时间取决于颗粒大小、样品总体积和所需的最终体积。通常需要 1 至 4 小时。浓缩后的iLNP溶液可储存在冰箱中，直至通过RiboGreen检测确定所需的稀释度。
替代方案：使用预制囊泡进行mRNA小规模包封
与基本方案2相同。
基本方案3：mRNA iLNP的表征和质量控制
RiboGreen检测需要1至2小时，包括试剂盒从冰箱取出后升温至室温的时间。在进行生物学评价之前，应对最终稀释后的样品进行DLS（粒径、PDI、zeta电位）分析。样品制备需要几分钟，分析时间因仪器不同而有所差异，但通常每个样品需要5至10分钟。
TNS检测中使用的缓冲液必须在使用前达到室温。根据分装量的大小，这可能需要几个小时。缓冲液可在检测前一晚放入冰箱冷藏，以减少缓冲液的预热时间。每个 iLNP 样品需要 40 个等分试样置于 96 孔板中，因此每个 iLNP 样品需要 10 至 15 分钟的孔板制备时间以及 10 分钟的读板时间。
mRNA 提取步骤需要 30 分钟。有关提取的 mRNA 的自动凝胶电泳分析，请参见上文（基本方案 1）。[3]

(C2H4O)NC31H63NO2

1849616-42-7

155977658

White to off-white solid

39.8Ų

1

4

31

38

415

0

O=C(C([H])([H])OC([H])([H])C([H])([H])OC([H])([H])[H])N(C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H].N([H])([H])[H]

BPWFJNQUTKVHIR-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C33H67NO3/c1-4-6-8-10-12-14-16-18-20-22-24-26-28-34(33(35)32-37-31-30-36-3)29-27-25-23-21-19-17-15-13-11-9-7-5-2/h4-32H2,1-3H3

2-[(polyethylene glycol)-2000]-N,N-ditetradecylacetamide

ALC0159; ALC 0159; ALC-0159; Azane;2-(2-methoxyethoxy)-N,N-di(tetradecyl)acetamide; mPEG-DTA; PEG-N,N-ditetradecylacetamide; ALC-0159

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~100 mg/mL
Ethanol :≥ 50 mg/mL

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (Infinity mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (Infinity mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (Infinity mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。