AM251

CB1 receptor ( IC50 = 8 nM )

体外活性：AM251 减少突触体中藜芦定依赖性（可抑制河鲀毒素）释放 L-谷氨酸和 GABA，IC50 分别为 8.5 μM 和 9.2 μM。 AM251 增加（2.3 倍）放射性配体的 Kd，而不改变 Bmax。 AM251 通过变构加速 [3H]-箭毒毒素 A 20-α-苯甲酸盐：钠通道复合物的解离来抑制平衡结合。 AM251 减少未刺激和乙酰化 LDL 刺激的 Raw 264.7 巨噬细胞、CB2+/+ 和 CB2 −/− 腹膜巨噬细胞中胆固醇酯的合成。激酶测定：将巨噬细胞接种（2 × 106/孔）于 12 孔培养板中。在从 2 mg/mL 乙醇储备溶液中添加 7-酮胆固醇之前 1 小时，从 DMSO 中制备的 4 mM 储备溶液中添加 AM-251。调整对照以接收等体积的 DMSO 和乙醇。 16小时后，测定caspase-3活性。所有处理均一式三份进行，数据表示为平均 RFLU/mg 蛋白质±SD。细胞测定：AM251 (5 μmol/l) 处理可诱导 A375 人黑色素瘤细胞凋亡、G2/M 细胞周期停滞和 cAMP 增加。此外，AM-251 抑制 7-酮胆固醇诱导的 Raw 264.7 巨噬细胞凋亡。

AM251 导致大鼠每日食物摄入量持续减少。 AM251 会产生与恶心相关的食物回避和行为，但不会损害大鼠的进食效率。 AM251 会破坏抑制性回避任务的记忆巩固。与对照组相比，AM251 导致测试降压潜伏期显着减少，但在旷场习惯化任务中没有检测到差异，包括交叉次数，即没有运动效应。 AM251 (4.0 mg/kg) 可减少在新环境中播放条件音提示期间的冻结。

在 12 孔培养板中，巨噬细胞以 2×10⁸/孔的密度接种。添加来自 2 mg/mL 乙醇储备溶液的七酮胆固醇 (7KC)，然后添加由 DMSO 制成的 4 mM 储备溶液中的 AM-251 或 SR144528。为了给对照提供相同量的乙醇和 DMSO，进行了调整。 16小时后测量caspase-3的活性。数据显示为每次处理的平均 RFLU/mg 蛋白质±SD，一式三份进行[3]。

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大麻素1型受体（CB1）属于GPCR家族，迄今为止，它一直被用于发现治疗神经性疼痛、恶心、呕吐和食物摄入障碍的药物。在这里，我们介绍了第一种荧光测定法的开发，该测定法能够测量CB1正构配体的动力学结合常数。该测定基于T1117的使用，T1117是AM251的荧光类似物。我们证明T1117以纳摩尔亲和力结合内源性和重组CB1受体。此外，T1117与CB1的结合对变构配体ORG27569敏感，因此适用于发现新的变构药物。本文提出的测定方法构成了昂贵且影响环境的放射性置换技术的可持续有效替代方案，并为简单、快速、廉价的CB1高通量药物筛选铺平了道路，用于鉴定新的立构和变构调节剂。[1]

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T1117/AM251与CB1结合的FACS测量[1]
用编码大鼠CB1-GFP的cDNA瞬时转染HEK293。转染后48小时，通过在温培养基中温和再悬浮来收获细胞。而悬浮细胞用1μM T1117处理30分钟。如有指示，用5μM的AM251处理细胞15分钟。经过处理后，细胞在配备氩气灯的Bekton Dickinson FACS sorted FACScan中以线性数据模式进行分选。

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T1117/AM251与CB1结合的吸光度测量和T117分配到膜中[1]
将大鼠脑膜（60μg）与指定量的T117一起孵育15分钟，最终体积为100μl。当指示时，添加5μMAM251。在4°C的台式离心机中，以14.000 r.p.m.的速度沉淀膜。将颗粒重新悬浮在PBS中，在530nm处测量吸光度，并绘制与T1117浓度的关系图。

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3检测[3]
巨噬细胞接种在12孔培养板中（2×106/孔）。在从2mg/ml乙醇储备溶液中加入7KC之前1小时，从DMSO中制备的4mM储备溶液中添加AM-251或SR144528。调整对照以接收等体积的DMSO和乙醇。16小时后，如前所述测定半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3活性[10]。所有处理均一式三份，数据以平均RFLU/mg蛋白±SD表示。[3]

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载脂蛋白百分比测定[3]
巨噬细胞，接种在96孔板中（50000/孔），并在添加7KC前1小时补充AM-251、SR144528或单独的载体，如上所述用于半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3测定。16小时后，根据制造商的指示，使用APOPercentage（Biocolor）比色方案定量凋亡。[3]

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在 A375 人黑色素瘤细胞中，用 AM251 (5 μmol/l) 处理会导致细胞凋亡、G2/M 细胞周期停滞和 cAMP 增加。此外，AM-251 还可阻止 Raw 264.7 巨噬细胞发生由 7-酮胆固醇引起的细胞凋亡。

[1]. Beyond radio-displacement techniques for identification of CB1 ligands: the first application of afluorescence-quenching assay. Sci Rep. 2014 Jan 20;4:3757.

[2]. Pharmacological characterization of GPR55, a putative cannabinoid receptor. Pharmacol Ther. 2010 Jun;126(3):301-13

[3]. AM-251 and SR144528 are acyl CoA:cholesterol acyltransferase inhibitors. Biochem Biophys Res Commun. 2009 Apr 3;381(2):181-6.

[4]. A pro-nociceptive phenotype unmasked in mice lacking fatty-acid amide hydrolase. Mol Pain. 2016 May 13;12. pii: 1744806916649192.

[5]. Study the Effect of Endocannabinoid System on Rat Behavior in Elevated Plus-Maze. Basic Clin Neurosci. 2015 Jul;6(3):147-53.

[6]. Role of cannabinoid receptor type 1 in tibial and pudendal neuromodulation of bladder overactivity in cats. Am J Physiol Renal Physiol. 2017 Mar 1;312(3):F482-F488.

[7]. Endocannabinoid activation of CB1 receptors contributes to long-lasting reversal of neuropathic pain by repetitive spinal cord stimulation. Eur J Pain. 2017 May;21(5):804-814.

AM-251 is a carbohydrazide obtained by formal condensation of the carboxy group of 1-(2,4-dichlorophenyl)-5-(4-iodophenyl)-4-methyl-1H-pyrazole-3-carboxylic acid with the amino group of 1-aminopiperidine. An antagonist at the CB1 cannabinoid receptor. It has a role as a CB1 receptor antagonist, an apoptosis inducer, an antidepressant and an antineoplastic agent. It is a member of pyrazoles, a dichlorobenzene, an organoiodine compound, an amidopiperidine and a carbohydrazide.

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Cannabinoid type 1 Receptor (CB1) belongs to the GPCR family and it has been targeted, so far, for the discovery of drugs aimed at the treatment of neuropathic pain, nausea, vomit, and food intake disorders. Here, we present the development of the first fluorescent assay enabling the measurement of kinetic binding constants for CB1 orthosteric ligands. The assay is based on the use of T1117, a fluorescent analogue of AM251. We prove that T1117 binds endogenous and recombinant CB1 receptors with nanomolar affinity. Moreover, T1117 binding to CB1 is sensitive to the allosteric ligand ORG27569 and thus it is applicable to the discovery of new allosteric drugs. The herein presented assay constitutes a sustainable valid alternative to the expensive and environmental impacting radiodisplacement techniques and paves the way for an easy, fast and cheap high-throughput drug screening toward CB1 for identification of new orthosteric and allosteric modulators. [1]

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Oxysterol-induced macrophage apoptosis may have a role in atherosclerosis. Macrophages lacking the type 2 cannabinoid receptor (CB2) are partially resistant to apoptosis induced by 7-ketocholesterol (7KC). AM-251 and SR144528 are selective antagonists of CB1 and CB2 receptors, respectively. We observed that both compounds reduce 7KC-induced apoptosis in Raw 264.7 macrophages. As oxysterol-induced macrophage apoptosis requires acyl-coenzymeA:cholesterol acyltransferase (ACAT) activity, we tested their affects on ACAT activity. AM-251 and SR144528 both reduced cholesteryl ester synthesis in unstimulated and acetylated LDL-stimulated Raw 264.7 macrophages, CB2(+/+) and CB2(-/-) peritoneal macrophages, as well as in vitro, in mouse liver microsomes. Consistent with inhibition of ACAT, the development of foam cell characteristics in macrophages by treatment with acetylated LDL was reduced by both compounds. This work is the first evidence that AM-251 and SR144528 are inhibitors of ACAT and as a result, might have anti-atherosclerotic activities independent of their affect on cannabinoid signaling. [3]

C22H21CL2IN4O

555.24

554.013

C, 47.59; H, 3.81; Cl, 12.77; I, 22.86; N, 10.09; O, 2.88

183232-66-8

2125

White to off-white solid powder

1.7±0.1 g/cm3

195-196℃

1.703

6.45

50.16

1

3

4

30

586

0

IC1C([H])=C([H])C(=C([H])C=1[H])C1=C(C([H])([H])[H])C(C(N([H])N2C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C2([H])[H])=O)=NN1C1C([H])=C([H])C(=C([H])C=1Cl)Cl

BUZAJRPLUGXRAB-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C22H21Cl2IN4O/c1-14-20(22(30)27-28-11-3-2-4-12-28)26-29(19-10-7-16(23)13-18(19)24)21(14)15-5-8-17(25)9-6-15/h5-10,13H,2-4,11-12H2,1H3,(H,27,30)

1-(2,4-dichlorophenyl)-5-(4-iodophenyl)-4-methyl-N-piperidin-1-ylpyrazole-3-carboxamide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.50 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.50 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 3 中的溶解度: 1% DMSO +30% polyethylene glycol+1% Tween 80 : 8 mg/mL

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。