Enolase (IC50 = 0.576 uM)

AP-III-a4 (ENOblock)（0-10 μM；24 小时）以剂量依赖性方式降低 HCT116 细胞的活力[1]。烯醇化酶立即与 AP-III-a4 结合，从而抑制其活性[1]。 III-a4（0-10 μM；24 或 48 小时）导致癌细胞凋亡并抑制其迁移和侵袭[1]。在肝细胞和肾细胞中，AP-III-a4（10 μM；24 小时）可以刺激葡萄糖摄取并减少磷酸烯醇丙酮酸羧激酶 (PEPCK) 的产生[1]。

在斑马鱼中，AP-III-a4 (ENOblock)（10 μM；96 小时）可抑制糖异生调节剂 PEPCK 并防止癌细胞转移[1]。

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斑马鱼（Danio rerio）癌细胞异种移植模型作为一种有效的、方便的体内测试候选癌症药物的工具，越来越受到研究的重视。此外，斑马鱼是预测哺乳动物毒理学效应的相关脊椎动物平台。我们观察到10 μM ENOblock处理发育中的斑马鱼幼虫是无毒的（图4，图A-C）。利用最近发表的经过抗癌药物测试验证的斑马鱼肿瘤异种移植模型，我们观察到ENOblock治疗减少了癌细胞的传播，表明抑制了癌细胞的迁移和侵袭过程（图4，D，E组）。[1]

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ENOblock下调PEPCK表达，诱导体内葡萄糖摄取[1]
为了研究ENOblock对体内葡萄糖稳态的影响，我们选择了斑马鱼，因为这种动物模型提供了一种方便、快速的实验形式，只需要少量的测试化合物。此外，研究表明斑马鱼和哺乳动物具有相似的葡萄糖调节反应。经ENOblock或罗格列酮处理的成年斑马鱼肝脏PEPCK表达下调（图6，面板a，b），证实了我们基于细胞的发现。荧光葡萄糖探针2-NBDG已被用于评估斑马鱼幼虫的葡萄糖摄取，这种探针是透明的，可以看到2-NBDG的荧光（例如，参考文献26）。我们观察到enblock处理诱导斑马鱼幼鱼的葡萄糖摄取（图6，图c-e）。作为比较，我们还测试了大黄素（6-甲基-1,3,8-三羟基蒽醌，一种生物活性植物成分，已知可促进细胞葡萄糖摄取）的作用。使用荧光板读取器测量裂解的幼虫中的2-NBDG荧光信号（图6，面板d）。该方法的结果证实了ENOblock处理诱导体内葡萄糖摄取。对2-NBDG处理的幼虫进行荧光显微镜分析显示，大黄素处理增加了葡萄糖摄取（图6，面板e）。通过测量72 hpf下斑马鱼幼虫眼睛中的2-NBDG荧光强度来量化2-NBDG摄取，因为该组织已被证明在发育阶段表达相对大量的葡萄糖转运体异构体。图像分析证实，ENOblock或大黄素处理可促进斑马鱼的葡萄糖摄取。

Enblock结合烯醇化酶并抑制其活性[1]
采用亲和层析法鉴定AP-III-a4的细胞靶点。本研究中使用的三嗪库的目标识别策略相对简单，因为这些分子含有一个内置的连接体片段。这使得偶联到亲和矩阵的风险降低，损害生物活性。从AP-III-a4亲和基质中洗脱的蛋白质的银染色如图2 a所示。质谱分析显示，两个质量约为45 kD的蛋白质带是烯醇化酶（一种糖酵解酶）的亚基，一个质量约为40 kD的蛋白质带是肌动蛋白(图2 b；AP-III-a4的整个质谱分析如补充图2和补充表1所示。然而，AP-III-a4不影响肌动蛋白聚合（补充图3），表明肌动蛋白不是活性靶标。因此，我们将AP-III-a4分子更名为“enblock”。通过Western blot分析从ENOblock亲和基质中洗脱的蛋白，证实了癌细胞裂解物中ENOblock与烯醇化酶的结合。与游离ENOblock的竞争分析抑制了烯醇化酶与ENOblock亲和矩阵的结合（图2，图c）。此外，ENOblock可以与纯化的人烯醇化酶结合，这表明ENOblock与烯醇化酶之间存在直接相互作用（图2，图d）。随后的分析表明，ENOblock可以剂量依赖性地抑制烯醇化酶的活性(图2，图e；作为额外的对照，我们还测试了标记三氮嘧啶库中的另一种非命中化合物AP-I-f10（3)，该化合物显示不会降低烯醇化酶活性（图2，面板f））。进一步的生化分析表明，ENOblock对烯醇化酶抑制的一半最大抑制浓度（IC50）为0.576 μM（补充图4）。通过sirna介导的烯醇化酶表达的敲除，证实了烯醇化酶在缺氧条件下提高癌细胞存活的作用（补充图5）。癌细胞用台盼蓝染色（补充图6）。缺氧条件下，enoblock处理的细胞显示台盼蓝摄取增加，这证实了诱导细胞死亡。

细胞活力测定[1]
细胞类型： HCT116
测试浓度： 1.25、2.5、5 和 10 μM
孵育时间： 24 小时
实验结果： 与常氧条件相比，缺氧条件下诱导更高水平的 HCT116 结肠癌细胞死亡。

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蛋白质印迹分析[1]
细胞类型： HCT116
测试浓度： 1.25、2.5、5 和 10 μM
孵育时间： AKT 24 小时，Bcl-Xl 48 小时
实验结果： 与细胞裂解液中的烯醇化酶结合，并与纯化的烯醇化酶结合。减少了 AKT 和 Bcl-Xl 的表达，它们是细胞凋亡的负调节因子。细胞侵袭测定[1]
细胞类型： HCT116
测试浓度： 0.156、0.312、0.625、1.25 和 2.5 μM
孵育持续时间： 24 小时
实验结果： 在 0.625 μM 的处理浓度下可显着抑制癌细胞侵袭。

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细胞迁移测定 [1]
细胞类型： HCT116
测试浓度： 0.625、1.25 和 2.5 μM
孵育时间：24 小时
实验结果：抑制细胞迁移，呈剂量依赖性。

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RT-PCR[1]
细胞类型： Huh7 和 HEK
测试浓度： 10 μM
孵育持续时间：24小时
实验结果：诱导葡萄糖摄取并抑制PEPCK表达。

Animal/Disease Models: The zebrafish cancer cell HCT116 xenograft model[1]
Doses: 10 μM
Route of Administration: 96 h
Experimental Results: decreased cancer cell dissemination. Inhibited PEPCK expression and induced glucose uptake. Inhibited adipogenesis and foam cell formation.

[1]. A Unique Small Molecule Inhibitor of Enolase Clarifies Its Role in Fundamental Biological Processes.ACS Chem. Biol., 2013, 8 (6), pp 1271–1282.

Enolase is a component of the glycolysis pathway and a "moonlighting" protein, with important roles in diverse cellular processes that are not related to its function in glycolysis. However, small molecule tools to probe enolase function have been restricted to crystallography or enzymology. In this study, we report the discovery of the small molecule "ENOblock", which is the first, nonsubstrate analogue that directly binds to enolase and inhibits its activity. ENOblock was isolated by small molecule screening in a cancer cell assay to detect cytotoxic agents that function in hypoxic conditions, which has previously been shown to induce drug resistance. Further analysis revealed that ENOblock can inhibit cancer cell metastasis in vivo. Moreover, an unexpected role for enolase in glucose homeostasis was revealed by in vivo analysis. Thus, ENOblock is the first reported enolase inhibitor that is suitable for biological assays. This new chemical tool may also be suitable for further study as a cancer and diabetes drug candidate.[1]

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In summary, our study reports the small molecule ENOblock, which is the first nonsubstrate analogue inhibitor that directly binds to enolase and can be used to probe the various nonglycolytic functions of this enzyme. We have utilized ENOblock to assess the effect of enolase inhibition on cancer progression and show for the first time that enolase inhibition can reduce cancer cell metastasis in vivo. We also show for the first time that enolase inhibition can suppress the gluconeogenesis regulator PEPCK and is a new target for developing antidiabetic drugs. We believe that the discovery of ENOblock is a testament to the power of forward chemical genetics to provide new chemical probes, drug targets, and candidate therapeutics for previously uncharacterized cellular mechanisms regulating human disease. In light of the potential role of enolase in the pathogenesis of bacterial infections (such as Yersinia pestis, Borrelia spp., and Streptococcus pneumonia) and trypanosomatid parasites (reviewed in ref 52), in addition to the need to discover new glycolysis inhibitors for cancer therapy, we believe that ENOblock has the potential to make significant contributions to our understanding of these disorders.[1]

C31H44CLFN8O3

594.72

594.344

C, 62.61; H, 7.29; F, 3.19; N, 18.84; O, 8.07

1177827-73-4

AP-III-a4 hydrochloride;2070014-95-6

24012277

Off-white to light yellow solid powder

1.3±0.1 g/cm3

1.621

2.15

148

5

11

18

43

749

0

FC1=CC=C(CNC2=NC(NCC3CCCCC3)=NC(NC4=CC=C(CC(NCCOCCOCCN)=O)C=C4)=N2)C=C1

MOVYITHKOHMLHC-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C31H43FN8O3/c32-26-10-6-25(7-11-26)22-36-30-38-29(35-21-24-4-2-1-3-5-24)39-31(40-30)37-27-12-8-23(9-13-27)20-28(41)34-15-17-43-19-18-42-16-14-33/h6-13,24H,1-5,14-22,33H2,(H,34,41)(H3,35,36,37,38,39,40)

N-[2-[2-(2-Aminoethoxy)ethoxy]ethyl]-2-[4-[[4-(cyclohexylmethylamino)-6-[(4-fluorophenyl)methylamino]-1,3,5-triazin-2-yl]amino]phenyl]acetamide

AP-III-a4; AP-III-a4; 1177827-73-4; ENOblock; CHEMBL3335790; N-[2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl]-2-[4-[[4-(cyclohexylmethylamino)-6-[(4-fluorophenyl)methylamino]-1,3,5-triazin-2-yl]amino]phenyl]acetamide; N-{2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl}-2-[4-({4-[(cyclohexylmethyl)amino]-6-{[(4-fluorophenyl)methyl]amino}-1,3,5-triazin-2-yl}amino)phenyl]acetamide; MFCD28009373; ENO block(AP-III-a4); ENOblock

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 本产品在运输和储存过程中需避光。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.20 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: 2.5 mg/mL (4.20 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.20 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。