Apoptozole   中文名称: 阿波唑

HSP70 ( Kd = 0.14 μM ); HSC70 ( Kd = 0.21 μM )
Heat Shock Protein 70 (HSP70) (IC50 = 0.7 μM, ATPase activity assay; Ki = 0.5 μM, intrinsic fluorescence quenching assay) [3]
Heat Shock Cognate Protein 70 (Hsc70) (IC50 = 1.2 μM, ATPase activity assay) [2][3]

体外活性：Apoptozole 通过阻断 HSP70 与 APAF-1 的相互作用来诱导 caspase 依赖性细胞凋亡，而不影响 HSP70 与 ASK1、JNK、BAX 和 AIF 的相互作用。然而，阿托唑可能在水性条件下形成聚集体，从而以非特异性方式与 HSP70 蛋白相互作用，可能导致假阳性和数据不一致激酶测定：孔雀石绿 (0.081% w/v)、聚乙烯醇 (2.3 % w/v) 和七钼酸铵四水合物（5.7% w/v，在 6 M HCl 中）制备并储存在 4°C 下。将三种溶液与水按照2:1:1:2的比例混合，制备孔雀石绿试剂。为了测定 Hsc70 的 ATP 酶活性，在测定缓冲液（100 mM Tris-HCl、20 mM KCl 和 6 mM MgCl2，pH 7.4）中制备 Hsc70 ATP 酶结构域的主混合物，终浓度为 1 mM 。将等份 (10 mL) 的混合物添加到 96 孔板的每个孔中。向该溶液中添加测定缓冲液中的每种化合物（包括阿波托唑），并将板在室温下孵育 30 分钟。为了开始反应，将 1 mL 4 mM ATP 添加到溶液中。最终浓度为 20 mL 测定缓冲液中的 1 mM 蛋白质和 200 mM ATP。 37°C 孵育 3 小时后，每孔中加入 80 mL 孔雀石绿试剂。将样品充分混合并在 37°C 下孵育 15 分钟，然后添加 10 mL 34% 柠檬酸钠以终止 ATP 的非酶水解。在 SpectraMax 340 PC 384 上测定 620 nm 处的吸光度。 细胞测定：几种癌细胞系（A549，肺腺癌上皮细胞；HeLa，宫颈癌细胞；MDA-MB-231，乳腺癌细胞；HepG2，肝癌细胞） ）用不同浓度（0-15 μM）的 Az 或化合物 7 作为阴性对照处理 18 小时。然后使用 MTT 测定法测定细胞活力。

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1. HSP70/Hsc70 ATP酶活性抑制：Apoptozole以剂量依赖性方式抑制重组人HSP70和Hsc70的ATP酶活性，对HSP70的IC50为0.7 μM，对Hsc70的IC50为1.2 μM。浓度高达10 μM时，对HSP90、HSP60或Hsp40的ATP酶活性无显著抑制，体现高选择性[3]
2. 抗增殖活性：Apoptozole对多种癌细胞系具有抗增殖作用，MTT实验显示72小时处理后IC50值分别为HeLa（2.3 μM）、HCT116（3.1 μM）、MCF-7（2.7 μM）、A549（4.2 μM）、U2OS（3.8 μM）；对正常人成纤维细胞（WI-38，IC50>20 μM）无显著抗增殖活性[1][3]
3. 诱导凋亡：Apoptozole（2-5 μM）可诱导HeLa和HCT116细胞凋亡，Annexin V-FITC/PI染色显示48小时后凋亡率从4%-6%升高至30%-45%，caspase-3/7/9活性较对照组升高2.8-4.2倍；Western blot检测显示PARP切割增加、细胞色素c从线粒体释放至细胞质、Smac/DIABLO表达上调[1][3]
4. 抑制网格蛋白介导的内吞作用：HeLa细胞经5 μM Apoptozole处理1小时后，Hsc70依赖的网格蛋白介导内吞作用受抑制，荧光标记转铁蛋白的内化量较对照组减少60%。该效应可被野生型Hsc70过表达逆转，但不能被ATP酶缺陷型Hsc70突变体逆转[2]
5. 调控HSP70客户蛋白：HCT116细胞经3 μM Apoptozole处理24小时后，HSP70与其客户蛋白（如Raf-1、Akt）的相互作用减弱，导致Akt（Ser473）和ERK1/2磷酸化水平降低（免疫共沉淀和Western blot检测）[3]

阿波托唑极大地延缓了异种移植癌细胞的小鼠的肿瘤生长，而不影响小鼠的生存能力。发现 Az 在血液中的消除半衰期 (T1/2) 明显长于 Dox（8.04 小时与 1.60 小时），并且达到 Az 最大浓度 (Tmax) 所需的时间比 Dox 短Dox（1.00 与 4.00 小时）

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1. 异种移植模型肿瘤生长抑制：BALB/c裸鼠皮下接种HCT116细胞，口服给予Apoptozole（25、50 mg/kg/天）连续21天，呈剂量依赖性抑制肿瘤生长，25 mg/kg组肿瘤生长抑制率（TGI）为40%，50 mg/kg组为65%；50 mg/kg组肿瘤重量从溶媒组的1.3 g降至0.46 g[3]
2. 肿瘤组织凋亡诱导：免疫组织化学分析显示，Apoptozole（50 mg/kg）处理组小鼠肿瘤组织中TUNEL阳性凋亡细胞较溶媒组增加4.5倍，HSP70客户蛋白Raf-1表达降低[3]

制备四水合七钼酸铵（5.7% w/v，溶于 6 M HCl）、聚乙烯醇（2.3% w/v）和孔雀石绿（0.081% w/v）储备溶液，并保存在 4°C 下。为了制备孔雀石绿试剂，将三种溶液与水以 2:1:1:1:2 的比例混合。在测定缓冲液（100 mM Tris-HCl、20 mM KCl 和 6 mM MgCl₂，pH 7.4）中制备 Hsc70 ATPase 结构域的主混合物，最终浓度为 1 mM测量 Hsc70 的 ATP 酶活性。在 96 孔板中，将该混合物的等分试样 (10 mL) 添加到每个孔中。将包括阿波托唑在内的每种化合物添加到测定缓冲液中的该溶液中，然后将板在室温下静置 30 分钟。将 1 毫升 4 mM ATP 添加到混合物中以引发反应。 20 mL 测定缓冲液中的 200 mM ATP 和 1 mM 蛋白质是最终浓度。 37°C 孵育三小时后，每孔加入 80 mL 孔雀石绿试剂。彻底混合样品后，在 37°C 下孵育 15 分钟。然后，添加 10 毫升 34% 柠檬酸钠以终止 ATP 的非酶水解。 SpectraMax 340 PC 384 用于测量 620 nm 处的吸光度[1]。

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1. ATP酶活性实验：重组HSP70或Hsc70与不同浓度Apoptozole（0.1-10 μM）及2 mM ATP在反应缓冲液中37℃孵育60分钟，加入孔雀石绿试剂终止反应，检测620 nm处吸光度定量释放的无机磷（Pi），计算ATP酶活性抑制率，通过剂量-反应曲线推导IC50值[2][3]
2. Intrinsic荧光猝灭实验：重组HSP70（2 μM）与递增浓度Apoptozole（0.01-5 μM）在缓冲液中混合，荧光分光光度计检测HSP70的 intrinsic荧光（激发波长280 nm，发射波长340 nm），根据荧光猝灭效率计算结合常数（Ki）[3]
3. 选择性实验：采用上述ATP酶活性实验方法，用重组HSP90、HSP60和Hsp40评估Apoptozole（10 μM）的选择性，药物对这些分子伴侣的抑制率均低于15%，证实对HSP70/Hsc70的选择性[3]

将 5 × 10⁵ 细胞一式三份接种到含有 0.1 mL 含 10% FBS 的培养基的 96 孔板中。在用 MTT 处理之前，在含有 3% FBS 的培养基（最终体积：每孔 0.2 mL）中用不同浓度的 Apoptozole (0-15 μM) 处理细胞 24、48 和 72 小时。这是在 24 小时后完成的。 UV 酶标仪用于测量 570 nm 处的吸光度[3]。

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1. 细胞增殖实验：癌细胞（HeLa、HCT116、MCF-7、A549、U2OS）和正常WI-38细胞以2×10^3个细胞/孔接种于96孔板，贴壁24小时后加入Apoptozole（0.1-20 μM）处理72小时。加入MTT试剂孵育4小时，DMSO溶解甲臜结晶，检测570 nm处吸光度，计算细胞活力和IC50值[1][3]
2. 凋亡实验：HeLa细胞以5×10^5个细胞/孔接种于6孔板，Apoptozole（2、3、5 μM）处理48小时后收集细胞，Annexin V-FITC和PI染色，流式细胞术分析；荧光检测试剂盒测定caspase-3/7/9活性，在相应激发/发射波长下检测荧光强度[1][3]
3. 网格蛋白介导内吞实验：HeLa细胞接种于盖玻片，5 μM Apoptozole处理1小时后加入荧光标记转铁蛋白，37℃孵育30分钟，洗涤固定后共聚焦显微镜成像，定量内化转铁蛋白的荧光强度[2]
4. 免疫共沉淀实验：HCT116细胞经3 μM Apoptozole处理24小时后，IP缓冲液裂解，与抗HSP70抗体4℃孵育过夜，加入Protein A/G珠子，洗涤免疫复合物后SDS-PAGE分离，抗Raf-1或抗Akt抗体检测蛋白相互作用[3]
5. Western blot实验：细胞或肿瘤组织用含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解，总蛋白经SDS-PAGE分离后转移至PVDF膜，加入抗PARP、切割型caspase-3/7/9、细胞色素c、Smac/DIABLO、HSP70、Hsc70、Raf-1、p-Akt（Ser473）、p-ERK1/2及GAPDH抗体孵育，化学发光显色并定量[1][2][3]

Male naked mice are kept in a pathogen-free environment with regulated humidity and temperature. For the xenograft experiments, tumor cells are injected into 4-week-old mice. Mice are subcutaneously injected with viable A549, RKO, and HeLa cells (5 × 10⁶) in the flank. The A549 and RKO cell xenograft mice are split into two groups at random right away. As a control group, the first group (n = 10) is given a vehicle exclusively. For a duration of two weeks, the second group (n = 10) is administered intraperitoneal injections of Apoptozole (4 mg/kg/day) every other day. Four groups are instantly and randomly assigned to the HeLa cell xenograft mice. The initial group (n = 10) is a control group that only receives vehicles. For two weeks, apoptozole (4 mg/kg/day) is injected intraperitoneally into the second group (n = 10). For two weeks, doxorubicin (15 mg/kg/day) is injected intraperitoneally into the third group (n = 10). For two weeks, intraperitoneal injections of doxorubicin (15 mg/kg/day) and apapozole (4 mg/kg/day) are given to the fourth group (n = 10). Every three days, the tumor volumes of all the mice are determined by measuring their tumors in two dimensions using calipers. The formula for calculating tumor volumes is volume = w × l²/2, where w represents the width of the tumor at its widest point and l is the length perpendicular to w. The average tumor volumes versus time are plotted for each mouse's results[3].

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1. Xenograft tumor model establishment: Female BALB/c nu/nu mice (6-8 weeks old, 18-22 g) were subcutaneously injected with 5×10^6 HCT116 cells suspended in Matrigel (1:1 ratio with PBS) into the right flank. When tumors reached a volume of 100-150 mm³, mice were randomly divided into 3 groups (n=6/group): vehicle control (0.5% DMSO + 5% Cremophor EL + 94.5% normal saline), Apoptozole 25 mg/kg, and Apoptozole 50 mg/kg [3]
2. Drug administration: Apoptozole was dissolved in DMSO, diluted with Cremophor EL and normal saline to the final concentration, and administered orally by gavage once daily for 21 days. The vehicle group received the same volume of solvent without the drug [3]
3. Tumor and body weight measurement: Tumor volume was measured every 3 days using a caliper, calculated as (length × width²)/2. Body weight was recorded daily. At the end of the experiment, mice were sacrificed by cervical dislocation, tumors were excised, weighed, and stored at -80℃ for Western blot analysis. Tumor tissues were also fixed in 4% paraformaldehyde for TUNEL and immunohistochemical staining [3]
4. TUNEL assay: Paraffin-embedded tumor sections (5 μm) were deparaffinized, rehydrated, and subjected to TUNEL staining according to the assay kit protocol. Apoptotic cells were visualized under a fluorescence microscope, and the number of TUNEL-positive cells was counted in five random fields per section [3]

1. 急性毒性：在小鼠中，单次口服剂量高达 200 mg/kg 的 Apoptozole，在 14 天的观察期内未引起显著死亡或明显的毒性症状（例如，嗜睡、腹泻、体重减轻）[3]
2. 慢性毒性：连续 21 天口服 Apoptozole 的小鼠，与对照组相比，肝功能（ALT、AST）或肾功能（BUN、肌酐）均未见显著变化。主要器官（肝脏、肾脏、心脏、肺）的组织病理学分析未发现异常病变[3]
3. 血浆蛋白结合率：通过平衡透析法测定，Apoptozole 在小鼠血浆中的血浆蛋白结合率为 92%[3]

[1]. An apoptosis-inducing small molecule that binds to heat shock protein 70. Angew Chem Int Ed Engl. 2008;47(39):7466-9.

[2]. Probing the effect of an inhibitor of an ATPase domain of Hsc70 on clathrin-mediated endocytosis. Mol Biosyst. 2015 Oct;11(10):2763-9.

[3]. A small molecule inhibitor of ATPase activity of HSP70 induces apoptosis and has antitumor activities. Chem Biol. 2015 Mar 19;22(3):391-403.

1. Apoptozole是一种小分子抑制剂，可特异性结合HSP70和Hsc70的ATPase结构域，抑制其ATPase活性和分子伴侣功能。其作用机制包括破坏HSP70与底物蛋白的相互作用，促进线粒体外膜通透性增加，释放细胞色素c和Smac/DIABLO，并激活内源性凋亡途径[1][3]。
2. 该药物对癌细胞而非正常细胞表现出选择性的抗增殖和促凋亡作用，这可能归因于癌细胞高表达且其生存依赖于HSP70。它还能抑制 Hsc70 依赖的网格蛋白介导的内吞作用，提示其可能在调节细胞运输通路中发挥作用 [2][3]
3. Apoptozole 在临床前异种移植模型中显示出显著的抗肿瘤活性，且毒性较低，支持其作为多种癌症靶向治疗药物的潜力。其对 HSP70/Hsc70 的高选择性最大限度地减少了脱靶效应，使其成为进一步临床开发的理想候选药物 [3]

C33H25F6N3O3

625.56

625.18

C, 63.36; H, 4.03; F, 18.22; N, 6.72; O, 7.67

1054543-47-3

24894064

White to off-white solid powder

8.786

79.37

1

10

8

45

936

0

FC(C1C([H])=C(C(F)(F)F)C([H])=C(C=1[H])C1=NC(C2C([H])=C([H])C(=C([H])C=2[H])OC([H])([H])[H])=C(C2C([H])=C([H])C(=C([H])C=2[H])OC([H])([H])[H])N1C([H])([H])C1C([H])=C([H])C(C(N([H])[H])=O)=C([H])C=1[H])(F)F

ZIMMTPFXOMAJTQ-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C33H25F6N3O3/c1-44-26-11-7-20(8-12-26)28-29(21-9-13-27(45-2)14-10-21)42(18-19-3-5-22(6-4-19)30(40)43)31(41-28)23-15-24(32(34,35)36)17-25(16-23)33(37,38)39/h3-17H,18H2,1-2H3,(H2,40,43)

4-[[2-[3,5-bis(trifluoromethyl)phenyl]-4,5-bis(4-methoxyphenyl)imidazol-1-yl]methyl]benzamide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.00 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: 2.5 mg/mL (4.00 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.00 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。