ASLAN003

ASLAN003 targets human dihydroorotate dehydrogenase (DHODH) with a half maximal inhibitory concentration (IC50) of 35 nM. [1]

在48小时内，法鲁多司他（0.01-100 μM）可抑制白血病细胞的生长。在法鲁多司他浓度下，细胞存活率可维持在50%以上[1]。法鲁多司他（0.5、1 μM）处理48小时后，裂解型caspase 8的水平显著升高[1]。法鲁多司他（2、4 μM；处理96小时）可降低骨髓增生异常综合征样本和原发性急性髓系白血病原始细胞的存活率并诱导其分化[1]。研究表明，在MOLM-14和KG-1细胞中，法鲁多司他（1、2 μM；OPP处理前1小时预处理，处理1小时）可减缓蛋白质合成并减少O-丙炔基嘌呤霉素（OPP）掺入蛋白质翻译位点。 Farudodstat 可下调 RPL6 和 EIF4B 蛋白的表达 [1]。

---

ASLAN003 可抑制 THP-1、MOLM-14 和 KG-1 细胞的增殖，IC50 值分别为 152 nM、582 nM 和 382 nM。在 1 µM 及更高浓度下，细胞活力维持在约 50%，表明其作用机制不同于细胞毒性药物。[1]
ASLAN003 可诱导分化：在 100 nM 浓度下，经 DMSO 校正后，CD11b+ 细胞分别增加 86.7% (THP-1)、63.9% (MOLM-14) 和 86.5% (KG-1) (P<0.001)；CD14+ 细胞也显著增加 (P<0.01)。观察到髓系细胞成熟的特征性形态学变化（核质比降低、染色质浓缩、核分叶增多）。NBT还原试验显示，经100 nM ASLAN003处理96小时后，THP-1细胞、MOLM-14细胞和KG-1细胞的阳性率分别为95.2%、62.4%和93.6%（P<0.001）；在50 nM ASLAN003处理下，超过50%的THP-1细胞NBT还原率升高（P<0.001）。时间依赖性实验：经100 nM ASLAN003处理24或48小时后，几乎100%的THP-1细胞表达CD11b。 [1]
与布雷喹那的比较：在 100 nM 浓度下，布雷喹那处理的 MOLM-14 细胞中 CD11b+ 细胞比例为 33.1%，而 ASLAN003 处理后的细胞中 CD11b+ 细胞比例为 63.9% (P<0.05)，表明 ASLAN003 的效力几乎是布雷喹那的两倍。[1]
尿苷挽救：添加 50 µM 尿苷可完全挽救 ASLAN003 介导的 MOLM-14 和 THP-1 细胞分化，并挽救细胞活力 (P<0.05)，表明其具有靶向特异性。 [1]
原发性急性髓系白血病 (AML) 和骨髓增生异常综合征 (MDS) 样本：ASLAN003 可诱导原发性 AML 原始细胞分化和细胞死亡（例如，UPN1：在 2 µM 和 4 µM 浓度下，CD11b+ 细胞分别增加 22% 和 30%；UPN6：在 2 µM 和 4 µM 浓度下，CD13/CD33 双阳性细胞分别增加 18% 和 23%；UPN5 (del7)：在 1 µM 浓度下，CD11b+ 细胞增加 62%）。在 AML 样本中，43% 的样本对 ASLAN003 敏感，43% 的样本中度敏感，14% 的样本耐药；在 MDS 样本中，50% 的样本对 ASLAN003 敏感，50% 的样本中度敏感。ASLAN003 对健康供体的单核细胞几乎没有影响。 [1]
对经ASLAN003处理的KG-1和MOLM-14细胞进行转录组分析（RNA-seq）发现，有320个基因表达上调，225个基因表达下调。上调基因主要与髓系分化（8.4%）、细胞表面抗原（4.7%）和细胞凋亡（2.5%）相关。下调基因主要富集于核糖体家族（19.6%）和代谢相关（8.4%）。基因集富集分析显示，“髓系分化上调”、“造血干细胞下调”、“HoxA9和Meis1靶基因下调”等特征显著富集，而“嘧啶核糖核苷三磷酸代谢过程”则受到抑制。 [1]
细胞凋亡：ASLAN003触发了外源性凋亡途径（增加裂解型caspase 8）和内源性凋亡途径（在THP-1、MOLM-14和KG-1细胞中以剂量依赖的方式导致线粒体膜电位丧失；增加细胞色素c泄漏；裂解型caspase-3和-7）。[1]
蛋白质合成抑制：ASLAN003抑制了蛋白质合成，表现为MOLM-14和KG-1细胞中O-丙炔基嘌呤霉素（OPP）掺入减少。Western blot证实了EIF4B和RPL6蛋白的下调。[1]
AP-1激活：ASLAN003增加了c-FOS蛋白水平。 AP-1抑制剂T-5224（20 µM）完全抑制了ASLAN003介导的KG-1细胞分化，并使MOLM-14细胞分化减弱了一半（P<0.001），表明AP-1激活部分促进了分化。[1]

当给予法鲁司他（50 mg/kg；灌胃；每日一次；第3至30天）时，播散性肿瘤的数量显著减少，生存期延长[1]。在MOLM-14和THP-1异种移植瘤模型（NGS小鼠，雌性，4-6周龄）中，ASLAN003（50 mg/kg，每日一次灌胃）与载体对照组相比，显著延长了生存期（MOLM-14模型中P=0.03，THP-1模型中P<0.001）。ASLAN003显著减少了MOLM-14模型中播散性肿瘤的数量和大小，并阻止了THP-1模型中白血病细胞向肝脏的浸润。治疗组和对照组在体重、血红蛋白浓度或血小板计数方面均未观察到显著差异。 [1] 在相同的模型中，ASLAN003 显著降低了骨髓、外周血、脾脏和肝脏中人 CD45+ 细胞的数量，并显著增加了治疗小鼠（两种模型）骨髓中 CD11b+ 和 CD14+ 细胞的数量。[1] 在 AML-14 患者来源的异种移植模型（惰性细胞系）中，ASLAN003（50 mg/kg，每日一次灌胃）与载体组相比，显著降低了白血病负荷（人 CD45+ 细胞）（P=0.04）。所有小鼠均存活，且无明显疾病症状；两组小鼠的体重增加情况相似。 [1] 在AML-23患者来源的异种移植模型（侵袭性细胞系）中，ASLAN003（50 mg/kg，每日一次灌胃给药）延长了中位生存期（治疗组小鼠在第37天存活率为50%，而对照组小鼠在一个月内全部死亡，中位生存期为20天；P=0.0002）。骨髓、外周血、脾脏和肝脏中人CD45+白血病细胞的比例显著降低，骨髓中人CD11b+和CD14+细胞的比例升高。各组间体重无统计学差异（P=0.73）。[1]

细胞增殖实验[1]
细胞类型： THP-1、MOLM-14 和 KG-1 细胞
测试浓度： 0.01、0.1、1、10、100 μM
孵育时间： 48 小时
实验结果： THP-1、MOLM-14 和 KG-1 细胞对白血病细胞增殖的抑制作用。MOLM-14 和 KG-1 的 IC50 值分别为 152 nM、582 nM 和 382 nM。

---

蛋白质印迹分析[1]
细胞类型：KG-1 和 MOLM-14 细胞
测试浓度：0.5、1 μM
孵育时间：48 小时
实验结果：裂解的 caspase 8 显著增加，细胞色素 c 从线粒体泄漏到胞质溶胶中，并诱导 caspase-3 和 -7 的裂解。

---

细胞活力检测：将细胞暴露于不同浓度的 ASLAN003 中 96 小时，并使用标准比色法或发光法评估细胞活力（详情见在线补充方法）。 [1]
蛋白质印迹分析：将KG-1和MOLM-14细胞用DMSO、0.5 µM或1 µM ASLAN003处理48小时后，提取全细胞裂解物或胞质组分，通过标准免疫印迹法检测凋亡相关蛋白（cleaved caspase 8、caspase-3、caspase-7、细胞色素c）和蛋白合成标志物（EIF4B、RPL6、c-FOS），以GAPDH作为内参。[1]
髓系分化的FACS分析：将细胞用ASLAN003或DMSO处理96小时（或处理时间不超过48小时），然后用针对人CD11b、CD14、CD13、CD33的荧光标记抗体进行染色，并在流式细胞仪上进行分析。对于原发性 AML/MDS 样本，根据这些标志物的增加百分比对疗效进行分类。[1]
Wright-Giemsa 染色和硝基蓝四唑 (NBT) 还原试验：将 1×10^6 个 AML 细胞暴露于 ASLAN003 或 DMSO 96 小时后，收集细胞并等分，用于细胞涂片制备，随后进行 Wright-Giemsa 染色以评估形态学变化，并进行 NBT 还原试验以评估髓系功能成熟（计数将 NBT 还原为甲臜的细胞）。[1]
线粒体膜电位 (MMP) 评估：将 THP-1、MOLM-14 和 KG-1 细胞暴露于 1 µM 或 2 µM ASLAN003 或 DMSO 48 小时，然后用 JC-10 染料染色，并通过流式细胞术分析以定量 MMP 的去极化。 [1] RNA测序和分析：用ASLAN003或DMSO处理KG-1和MOLM-14细胞后，进行RNA提取、文库构建和测序。进行差异表达分析（差异表达后验概率0.95-1，倍数变化阈值1.5）。进行基因本体论和单样本基因集富集分析。[1] 蛋白质合成分析（Click-iT）：将MOLM-14和KG-1细胞暴露于1 µM或2 µM ASLAN003中1小时，然后加入O-丙炔基嘌呤霉素（OPP，20 mM）1小时。洗涤、固定、透化细胞，并通过流式细胞术分析OPP掺入情况（Alexa Fluor 488）。 [1] qRT-PCR：从经ASLAN003处理的细胞中提取总RNA，进行逆转录，并使用特异性引物序列（在线补充表S1）进行定量PCR，以确认所选基因的表达变化。[1]

动物/疾病模型：雌性NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ、NGS小鼠（4-6周龄），接种MOLM-14细胞[1]
剂量：50 mg/kg
给药途径：po（灌胃）；每日一次；第3天至第30天的结果：播散性肿瘤的数量和肿瘤大小显著减少。生存期显著延长。

---

人AML细胞系异种移植模型：雌性NOD.Cg-Prkdc-scid Il2rg-tm1Wjl/SzJ (NSG)小鼠（4-6周龄）经尾静脉注射3×10^6个处于指数生长期的THP-1或MOLM-14细胞。接种后第二天，小鼠分别接受载体对照或ASLAN003（50 mg/kg）灌胃给药，每日一次，每次200 µL。根据模型不同，治疗持续2至11周。监测小鼠的体重、血红蛋白浓度和血小板计数。采用Kaplan-Meier生存曲线和log-rank检验分析生存率。在实验终点，采集骨髓、外周血、脾脏和肝脏，用于流式细胞术分析人CD45+、CD11b+和CD14+细胞。[1] 建立了人急性髓系白血病（AML）患者来源的异种移植（PDX）模型：AML-14 PDX细胞系（源自AML-M4，核型正常）和AML-23 PDX细胞系（源自加速期慢性粒细胞白血病）。将患者来源的急性髓系白血病（AML）细胞移植到NSG小鼠体内，然后用载体或ASLAN003（50 mg/kg，每日一次，灌胃给药）进行治疗。治疗方案和终点与细胞系异种移植模型相似。采用流式细胞术（FACS）检测骨髓、外周血、脾脏和肝脏中的白血病负荷（人CD45+细胞）和分化标志物（CD11b+、CD14+）。全程监测小鼠体重。[1]

ASLAN003具有很高的血浆蛋白结合率（>99%）。在 I 期单次和多次递增剂量临床试验中，健康志愿者已证实其耐受性良好。[1]

ASLAN003对正常造血细胞无明显影响；在2 µM和4 µM浓度下，其对健康供体单核细胞的细胞活力和分化状态的影响可忽略不计。[1]
在CD34⁺CD38⁺正常骨髓髓系祖细胞（分裂细胞）中，ASLAN003的IC50为5.22 µM，且ASLAN003在急性髓系白血病（AML）细胞中的活性平均比在这些正常细胞中高11倍，提示其具有良好的治疗指数。[1]
在小鼠异种移植模型（MOLM-14和THP-1）中，ASLAN003（50 mg/kg，每日一次灌胃）治疗耐受性良好：载体对照组和治疗组在体重、血红蛋白浓度或血小板计数方面均无显著差异。在PDX模型（AML-14和AML-23）中，接受治疗的小鼠体重与对照组无统计学差异（AML-14 P=0.42，AML-23 P=0.73）。即使长期给药，该药物在小鼠体内也表现出良好的安全性。[1]

[1]. ASLAN003, a potent dihydroorotate dehydrogenase inhibitor for differentiation of acute myeloid leukemia. Haematologica. 2019 Nov7;haematol.2019.230482.

[2]. Human Dihydroorotate Dehydrogenase (hDHODH) as a new target on Acute Myelogenous Leukemia (AML): Targeting Myeloid Differentiation using Potent and Innovative hDHODH Inhibitors. 23rd Swedish Conference on Macromolecular Structure an.

Farudodstat (ASLAN003) 目前正在进行临床试验 NCT03451084（ASLAN003 治疗急性髓系白血病的剂量优化研究）。Farudodstat 是一种口服二氢乳清酸脱氢酶 (DHODH) 抑制剂，具有潜在的抗肿瘤活性。给药后，Farudodstat 可特异性靶向并结合 DHODH，抑制其活化，从而阻断嘧啶从头合成的第四步酶促反应。这会抑制尿苷单磷酸 (UMP) 的生成、DNA 合成、细胞分裂和增殖，导致活性氧 (ROS) 的产生，促进易感肿瘤细胞的分化，并诱导细胞凋亡。二氢乳清酸脱氢酶 (DHODH) 是一种线粒体酶，催化二氢乳清酸 (DHO) 转化为乳清酸，参与内源性 UMP 的合成。

---

ASLAN003 是一种强效的 DHODH 抑制剂，可诱导急性髓系白血病 (AML) 细胞分化。它能触发细胞凋亡通路，抑制蛋白质合成，并激活 AP-1 转录因子，从而增强其分化能力。该药物可显著降低 AML 异种移植和患者来源异种移植 (PDX) 模型中的白血病负荷，并延长生存期。[1]
ASLAN003 已被美国食品药品监督管理局 (FDA) 授予治疗 AML 的孤儿药资格，目前正在 AML 患者中进行 IIa 期临床试验 (ClinicalTrials.gov: NCT03451084)。 [1]在另一份报告中，ASLAN003被提及为正在进行 AML 相关临床试验（II 期）的三种 DHODH 抑制剂之一。[2]

C19H14F2N2O3

356.322871685028

356.097

1035688-66-4

24986824

White to off-white solid powder

4.6

71.4

2

7

5

26

470

0

FC1C=C(C=C(C=1NC1C(C(=O)O)=CC=CN=1)F)C1C=CC=C(C=1)OC

OMPATGZMNFWVOH-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C19H14F2N2O3/c1-26-13-5-2-4-11(8-13)12-9-15(20)17(16(21)10-12)23-18-14(19(24)25)6-3-7-22-18/h2-10H,1H3,(H,22,23)(H,24,25)

2-((3,5-difluoro-3'-methoxy-[1,1'-biphenyl]-4-yl)amino)nicotinic acid

ASLAN003 ASLAN 003 ASLAN-003 Aslan-003.

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~125 mg/mL (~350.81 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.17 mg/mL (6.09 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 21.7 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

---

配方 2 中的溶解度: ≥ 2.17 mg/mL (6.09 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 21.7 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL玉米油中，混合均匀。

---

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。