Astragaloside IV   中文名称: 黄芪皂苷 Ⅳ

MMP-2; MMP-9; ERK1; ERK2; JNK
This study investigates the anti-inflammatory mechanisms of Astragaloside IV in a mouse model of cerebral ischemia and reperfusion. The compound modulates several key targets in the inflammatory pathway:

- Toll-like receptor 4 (TLR4) and its downstream signaling pathway (MyD88, TRIF, TRAF6). [1]
- Nuclear factor-kappa B (NF-κB), specifically inhibiting its phosphorylation (p-p65). [1]
- NLRP3 inflammasome, suppressing its activation. [1]
- Microglial activation (reducing Iba1 expression). [1]
- Reactive oxygen species (ROS) production. [1]
- Pro-inflammatory cytokines (IL-1β and TNF-α). [1]

黄芪甲苷IV（10、20、40 ng/mL）可抑制非小细胞肺癌（NSCLC）细胞的生长，而低浓度黄芪甲苷IV（1、2.5、5 ng/mL）对细胞活力无明显毒性。此外，黄芪甲苷IV联合治疗可显著提高NSCLC细胞对顺铂的化疗敏感性。在顺铂存在的情况下，黄芪甲苷IV联合治疗可显著降低B7-H3的mRNA和蛋白水平[2]。黄芪甲苷IV可降低基质金属蛋白酶（MMP）-2和-9的活性，抑制丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族成员ERK1/2和JNK的活化，并抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞的活力和侵袭能力[4]。

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黄芪甲苷IV在非小细胞肺癌（NSCLC）细胞系中表现出显著疗效，尤其是在与顺铂联合使用时。

1. 细胞毒性和细胞活力：在A549、HCC827和NCI-H1299 NSCLC细胞中，高剂量黄芪甲苷IV（10、20、40 ng/mL）处理48小时后显著抑制细胞生长。低浓度（1、2.5、5 ng/mL）对细胞活力无明显细胞毒性作用。同样，高浓度顺铂（5、10、20、40 μM）降低了细胞活力，而低剂量（0.5、1、2.5 μM）则没有这种作用。[2]

2. 增强顺铂化疗敏感性：与单独使用顺铂相比，低剂量（5 ng/mL）无细胞毒性的黄芪甲苷IV与低剂量（2.5 μM）联合治疗显著抑制了A549、HCC827和NCI-H1299细胞的活力（CCK-8检测结果）。这表明黄芪甲苷IV可增强非小细胞肺癌细胞对顺铂的敏感性。 [2]

3. 诱导细胞凋亡：流式细胞术分析显示，碘化丙啶 (PI) 染色显示，单独使用 2.5 μM 顺铂处理并未诱导明显的细胞凋亡。然而，2.5 μM 顺铂与 5 ng/mL 黄芪甲苷 IV 联合处理显著增加了 A549 细胞、HCC827 细胞和 NCI-H1299 细胞的凋亡细胞比例，分别达到 39.57%、36.77% 和 34.85%。 [2]

4. B7-H3表达的抑制：实时PCR和Western blot分析显示，与单独使用顺铂相比，黄芪甲苷IV与顺铂联合处理显著抑制了A549和HCC827细胞中B7-H3的mRNA和蛋白水平。[2]

5. B7-H3在化疗增敏中的作用：通过质粒转染在A549、HCC827和NCI-H1299细胞中异位过表达B7-H3显著降低了黄芪甲苷IV的化疗增敏作用。在B7-H3过表达细胞中，与单独使用顺铂相比，黄芪甲苷IV与顺铂联合治疗不再显著降低细胞活力，证实黄芪甲苷IV的作用是通过抑制B7-H3介导的。[2]

黄芪甲苷IV（10、20 mg/kg，口服）能有效预防短暂性脑缺血再灌注损伤引起的认知功能障碍。与模型组相比，黄芪甲苷IV（10 mg/kg）和黄芪甲苷IV（20 mg/kg）均能显著降低细胞因子水平。鉴于黄芪甲苷IV能显著降低TLR4及其下游蛋白的水平，其抗炎作用可能涉及MyD88依赖性和非依赖性通路。此外，黄芪甲苷IV还能降低Iba1蛋白的表达，并抑制NLRP3和cleaved-caspase-1的表达。在小鼠模型中，高剂量黄芪甲苷IV组显著提高了48小时存活率[60% (9/15) vs 13.3% (2/15)，P < 0.05]，显著降低了血清ALT和AST水平（P < 0.01），显著降低了肝脏组织病理学指标和肝细胞凋亡程度（P < 0.01），显著提高了SOD活性（P < 0.01），并显著降低了MDA含量。

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黄芪甲苷IV在短暂性脑缺血再灌注损伤的小鼠模型中表现出显著的神经保护和抗炎作用。

1. 改善认知障碍（莫里斯水迷宫）：在双侧颈总动脉闭塞（BCCAO）的小鼠中，口服黄芪甲苷IV（10和20 mg/kg，一次）术前7天和术后7天每日给予黄芪甲苷IV可显著减轻记忆缺陷。这体现在训练试验中逃避潜伏期的缩短（20 mg/kg组从第2天起显著改善；10 mg/kg组在第5天显著改善）以及探针试验中表现的改善，包括目标象限停留时间的增加（10 mg/kg组，p<0.05；20 mg/kg组，p<0.01）和平台穿越频率的增加（两个剂量组，p<0.01），与模型组相比。[1]

2. 促炎细胞因子的减少：通过ELISA检测，黄芪甲苷IV（10和20 mg/kg）治疗显著降低了BCCAO小鼠海马中白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的升高水平。 [1]

3. 氧化应激标志物的调节：黄芪甲苷IV治疗显著逆转了缺血再灌注引起的氧化应激标志物的变化。它提高了超氧化物歧化酶（SOD）的活性，并降低了海马中丙二醛（MDA）和活性氧（ROS）的水平。[1]

4. TLR4信号通路的抑制：海马组织的Western blot分析显示，黄芪甲苷IV显著下调了TLR4及其下游衔接蛋白（包括MyD88、TRIF和TRAF6）的蛋白表达。它还抑制了NF-κB p65亚基的磷酸化。 [1]

5. 抑制 NLRP3 炎症小体活化：通过蛋白质印迹和免疫组化检测，黄芪甲苷 IV 处理显著降低了海马中 NLRP3 和 cleaved caspase-1 的蛋白表达，表明 NLRP3 炎症小体受到抑制。[1]

6. 抑制小胶质细胞活化：通过蛋白质印迹检测，黄芪甲苷 IV 显著降低了 BCCAO 小鼠海马中活化小胶质细胞标志物 Iba1 的表达。[1]

简而言之，按照建议处理的MDA-MB-231细胞或肿瘤组织被收集，并在含有50 mM Tris（pH 7.5）、10 mM MgCl2、0.5 M NaCl和蛋白酶抑制剂混合物的Mg2+裂解缓冲液中裂解。等量的裂解液与PAK-PBD磁珠在4°C下孵育1小时。离心沉淀PAK-PBD磁珠，然后用含有25 mM Tris（pH 7.5）、30 mM MgCl2和40 mM NaCl的溶液洗涤。采用Western blotting检测活性Rac1。

CCK-8 法用于测定细胞活力。简而言之，将 4×10⁴ 个（细胞/孔）培养的非小细胞肺癌 (NSCLC) 细胞接种于 96 孔板中。然后在 37°C 避光条件下孵育 2 小时，之后加入 10 µL/孔的 CCK-8 溶液。使用 490 nm 波长计算吸光度。

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采用多种基于细胞的检测方法来评估黄芪甲苷 IV 的作用。

1. 细胞系和培养：使用人 NSCLC 细胞系 A549、HCC827 和 NCI-H1299。将细胞在添加 10% FBS 的 DMEM 培养基中，于 37°C、5% CO₂ 培养箱中培养。 [2]

2. 细胞活力检测 (CCK-8)：将细胞以 4 × 10⁴ 个细胞/孔的密度接种于 96 孔板中。用黄芪甲苷 IV 和/或顺铂处理 48 小时后，每孔加入 10 μL CCK-8 溶液，并在 37°C 避光孵育 2 小时。在 490 nm 波长处测量吸光度以确定细胞活力。[2]

3. 细胞凋亡检测 (流式细胞术)：处理后，用 PBS 洗涤细胞，用胰蛋白酶消化，并通过离心收集细胞。将细胞重悬于结合缓冲液中，浓度为 9 × 10⁵ 个细胞/mL。加入碘化丙啶 (PI)，并在 4°C 避光孵育 5 分钟。采用流式细胞术评估细胞凋亡率，每次分析记录10,000个事件。[2]

4. RNA提取和实时定量PCR：使用TRIzol试剂从细胞中分离总RNA。使用商业试剂盒进行逆转录。使用SYBR Green Premix在ABI 7500系统上进行实时定量PCR，以GAPDH作为内参，定量B7-H3 mRNA的表达。[2]

5. Western Blot：用RIPA裂解缓冲液裂解细胞，并使用BCA法定量蛋白浓度。将蛋白样品通过SDS-PAGE分离，然后转移至PVDF膜。将膜与抗B7-H3一抗在4℃孵育过夜，随后与HRP标记的二抗孵育。通过化学发光法检测蛋白条带。 [2]

6. 质粒转染：将编码 B7-H3 的 cDNA 片段克隆到 pcDNA3.1(+) 载体中。使用 Lipofectamine 2000 按照制造商的说明书将表达 B7-H3 的质粒或空载体转染到细胞中。12 小时后，将转染培养基更换为完全培养基。[2]

双侧颈总动脉闭塞术（BCCAO）用于构建短暂性脑缺血再灌注模型，因为它被认为是研究短暂性脑缺血再灌注损伤介导的炎症反应的最佳模型。将小鼠随机分为假手术组、模型组、黄芪甲苷IV（10 mg/kg）治疗组和黄芪甲苷IV（20 mg/kg）治疗组。黄芪甲苷IV治疗组在术前7天开始，直至处死当日通过灌胃给药。手术当日缺血前2小时，给予黄芪甲苷IV。假手术组和模型组均给予蒸馏水处理。小鼠腹腔注射水合氯醛（350 mg/kg）麻醉后，通过颈部腹侧小切口暴露并小心分离双侧颈总动脉。在对先前描述进行一些细微修改后，使用结扎的手术丝线对颈总动脉进行两次（每次 20 分钟）阻断。两次阻断之间（缺血 20 分钟，再灌注 10 分钟，缺血 20 分钟）设有 10 分钟的再灌注期。对未进行手术丝线结扎的假手术小鼠进行相同的手术操作。在整个手术过程中以及直至动物从麻醉中苏醒之前，使用加热器将小鼠的体温维持在 370±5°C。1. **动物：** 使用雄性 ICR 小鼠（20±2 g）。它们饲养在受控条件下（25±1°C，湿度 60-65%，12 小时光照/黑暗循环），并可自由获取食物和水。 [1]

2. **给药方法：**黄芪甲苷IV（纯度98%）溶于蒸馏水，以10 mg/kg和20 mg/kg的剂量进行灌胃给药。每日给药一次，从手术诱导缺血前7天开始，持续至术后7天，直至处死当日。手术当日，在诱导缺血前2小时给药。假手术组和模型组仅给予蒸馏水。[1]

3. **脑缺血再灌注的诱导：**采用双侧颈总动脉闭塞（BCCAO）诱导短暂性脑缺血再灌注。小鼠用水合氯醛（350 mg/kg，腹腔注射）麻醉。双侧颈总动脉暴露后，分别进行两次阻断，每次20分钟，两次阻断之间间隔10分钟再灌注（20分钟缺血 - 10分钟再灌注 - 20分钟缺血）。假手术组小鼠接受相同的手术操作，但不进行结扎。术中及术后直至恢复，体温维持在37 ± 0.5°C。[1]

4. **莫里斯水迷宫（MWM）测试：** 从术后第8天开始评估小鼠的空间学习和记忆能力。该测试持续5天。在连续4天的训练中，小鼠每天进行两次寻找隐藏平台的试验（记录逃避潜伏期，最长90秒）。在第5天（探针试验），移除平台，并记录小鼠在目标象限停留的时间以及穿越原平台位置的频率，持续90秒。 [1]

5. **组织采集和生化分析：**行为学测试后，处死小鼠并解剖海马。制备组织匀浆用于各种检测：IL-1β、TNF-α 和 ROS 的 ELISA 检测；SOD 活性和 MDA 含量的比色法检测；以及蛋白质表达分析的 Western blot 检测。[1]

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1. 动物：使用雄性 ICR 小鼠（20 ± 2 g）。小鼠饲养于受控条件下（25 ± 1°C，湿度 60-65%，12 小时光照/黑暗循环），可自由摄取食物和水。[1]

2. 给药：将黄芪甲苷 IV（纯度 98%）溶于蒸馏水中，以 10 mg/kg 和 20 mg/kg 的剂量进行灌胃给药。治疗每日一次，从手术诱导缺血前7天开始，持续至术后7天，直至处死当日。手术当日，在诱导缺血前2小时给药。假手术组和模型组仅给予蒸馏水。[1]

3. 脑缺血和再灌注的诱导：采用双侧颈总动脉闭塞（BCCAO）诱导短暂性脑缺血和再灌注。小鼠用水合氯醛（350 mg/kg，腹腔注射）麻醉。暴露双侧颈总动脉，并进行两次闭塞，每次20分钟，两次闭塞之间间隔10分钟再灌注（20分钟缺血 - 10分钟再灌注 - 20分钟缺血）。假手术组小鼠接受相同的手术操作，但不进行结扎。手术期间及术后直至恢复，体温维持在 37 ± 0.5°C。[1]

4. Morris 水迷宫 (MWM) 测试：从术后第 8 天开始评估小鼠的空间学习和记忆能力。该测试持续 5 天。在连续 4 天的训练中，小鼠每天进行两次寻找隐藏平台的试验（记录逃避潜伏期，最长 90 秒）。在第 5 天（探针试验），移除平台，并记录小鼠在目标象限停留的时间以及穿越原平台位置的频率，持续 90 秒。[1]

5. 组织采集和生化分析：行为学测试结束后，处死小鼠并解剖海马。制备组织匀浆用于各种检测：IL-1β、TNF-α 和 ROS 的 ELISA 检测；SOD 活性和 MDA 含量的比色法检测；以及蛋白质表达分析的 Western blot 检测。 [1]

[1]. Astragaloside IV attenuates cognitive impairments induced by transient cerebral ischemia and reperfusion in mice via anti-inflammatory mechanisms. Neurosci Lett. 2016 Dec 20. pii: S0304-3940(16)30994-

[2]. Astragaloside IV Enhances Cisplatin Chemosensitivity in Non-Small Cell Lung Cancer Cells Through Inhibition of B7-H3. Cell Physiol Biochem. 2016;40(5):1221-1229. Epub 2016 Dec 14.

[3]. [Protective effect of astragaloside IV against acute liver failure in experimental mice]. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi. 2016 Oct 20;24(10):772-777.

[4]. Astragaloside IV inhibits breast cancer cell invasion by suppressing Vav3 mediated Rac1/MAPK signaling. Int Immunopharmacol. 2016 Dec 5;42:195-20.

黄芪甲苷IV是一种五环三萜类化合物，属于环黄芪醇类，其O-3和O-6位分别连接有β-D-木糖和β-D-葡萄糖残基。它分离自蒙古黄芪（Astragalus membranaceus var. mongholicus）。黄芪甲苷IV具有多种活性，包括作为碳酸酐酶（EC 4.2.1.1）抑制剂、抗炎剂、神经保护剂、抗氧化剂、促血管生成剂和植物代谢产物。它是一种三萜皂苷和五环三萜类化合物，在功能上与环黄芪醇相关。据报道，黄芪甲苷IV也存在于黄芪、白花黄芪以及其他具有相关数据的生物体中。

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黄芪甲苷IV (AS-IV) 是一种小分子皂苷（C₄₁H₆₈O₁₄，分子量 = 784），是从传统中药黄芪中分离得到的主要活性成分。它在中国被广泛用于治疗多种疾病，包括心血管疾病、肝脏疾病和肾脏疾病。本研究提供了黄芪甲苷IV对小鼠短暂性脑缺血再灌注损伤引起的认知功能障碍具有神经保护作用的证据。其作用机制归因于其抗炎特性，特别是通过抑制TLR4信号通路（包括MyD88依赖性和非依赖性分支）以及抑制NLRP3炎症小体的过度激活。这些作用可降低小胶质细胞活化，减少促炎细胞因子（IL-1β、TNF-α）的产生，并减轻氧化应激，最终改善记忆缺陷。[1]

C41H68O14

784.9702

784.46

C, 62.73; H, 8.73; O, 28.54

84687-43-4

84687-43-4

13943297

White to off-white solid powder

1.4±0.1 g/cm3

895.7±65.0 °C at 760 mmHg

295-296ºC

495.5±34.3 °C

0.0±0.6 mmHg at 25°C

1.621

1.96

228.22

9

14

7

55

1460

21

C[C@@]12C[C@H](O)[C@H]([C@]3(CC[C@@H](C(O)(C)C)O3)C)[C@@]1(C)CC[C@@]13C[C@]41CC[C@H](O[C@@H]1OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O)C(C)(C)[C@@H]4[C@H](C[C@@H]23)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1

QMNWISYXSJWHRY-YLNUDOOFSA-N

InChI=1S/C41H68O14/c1-35(2)24(54-33-29(48)26(45)20(44)17-51-33)9-11-41-18-40(41)13-12-37(5)31(39(7)10-8-25(55-39)36(3,4)50)19(43)15-38(37,6)23(40)14-21(32(35)41)52-34-30(49)28(47)27(46)22(16-42)53-34/h19-34,42-50H,8-18H2,1-7H3/t19-,20+,21-,22+,23-,24-,25-,26-,27+,28-,29+,30+,31-,32-,33-,34+,37+,38-,39+,40-,41+/m0/s1

(2R,3R,4S,5S,6R)-2-[[(1S,3R,6S,8R,9S,11S,12S,14S,15R,16R)-14-hydroxy-15-[(2R,5S)-5-(2-hydroxypropan-2-yl)-2-methyloxolan-2-yl]-7,7,12,16-tetramethyl-6-[(2S,3R,4S,5R)-3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl]oxy-9-pentacyclo[9.7.0.01,3.03,8.012,16]octadecanyl]oxy]-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol

Astragaloside IV

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: ~100 mg/mL (~127.4 mM)

配方 1 中的溶解度: 2.5 mg/mL (3.18 mM) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液；超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (3.18 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (3.18 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。