Aurintricarboxylic acid inhibits influenza virus neuraminidase (NA) activity (IC50 values: 7.2 μg/mL for PR8, 16.6 μg/mL for NC, 16.4 μg/mL for NY, 6.3 μg/mL for influenza B virus, 0.52 μg/mL for recombinant N1 protein, and 1.0 μg/mL for recombinant N4 protein) [2].
Aurintricarboxylic acid inhibits TWEAK-Fn14-NF-κB signaling (IC50 of ~0.6 μM in HEK293 NF-κB-Luc/Fn14 cells) [4].

金霉素三羧酸对P2X2/3R、P2X2R、P2X4R和P2X7R均有轻微抑制作用[1]。金霉素三羧酸以浓度依赖的方式抑制ATP激活电流[1]，其机制是通过调控钙调磷酸酶的作用[2]。金霉素三羧酸对TWEAK-Fn14的抑制作用较弱。在胶质母细胞瘤（GBM）细胞中，金霉素三羧酸（10 μM；0.5-2小时）可抑制TWEAK-Fn14介导的NF-κB、Akt和Src磷酸化[4]。金精三羧酸抑制TWEAK并刺激金三羧酸（化合物8），后者可阻止外源性siRNA被RISC加载，但不能控制培养细胞中内源性let-7在AGO2上的加载[4]。

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金精三羧酸（ATA）可保护MDCK细胞免受甲型流感病毒（H1N1毒株PR8、NC；H3N2毒株NY）和乙型流感病毒的感染，中性红摄取试验结果显示（p < 0.0001）。ATA在577 μg/mL浓度下对MDCK细胞产生50%的细胞毒性（CC50），在6.5 μg/mL浓度下可保护50%的细胞免受PR8感染（EC50），选择性指数为88.8。感染前24小时用ATA预处理细胞并不能预防细胞病变效应（CPE）[2]。
RT-PCR检测显示，ATA以浓度依赖的方式降低了MDCK细胞中甲型流感病毒PR8的核蛋白（NP）RNA水平[2]。
ELISA定量分析显示，ATA（50和100 μg/mL）显著降低了感染MDCK细胞上清液中的病毒产量，PR8分别降低了93%和95%，NC分别降低了86%和94%，NY分别降低了72%和81%[2]。
与未处理的对照组（均为1×10⁷ PFU/mL）相比，100 μg/mL的ATA处理显著降低了PR8感染的MDCK细胞中细胞内（至5×10⁴ PFU/mL）和细胞外（至1.3×10⁴ PFU/mL）的病毒产量。细胞，通过噬斑试验测定[2]。
ATA 与盐酸金刚烷胺 (AH) 同时治疗显示出对甲型流感病毒诱导的细胞病变效应 (CPE) 的叠加保护作用，并且几乎完全抑制了病毒的产生，如中性红试验和 ELISA 所示[2]。
甲型和乙型流感病毒与 ATA (50、100 μg/mL) 预孵育可减少噬斑数量，表明 ATA 可直接灭活病毒[2]。
电子显微镜显示，用 ATA (100 μg/mL) 处理 PR8 感染的 MDCK 细胞可诱导病毒在细胞表面聚集[2]。
在无细胞化学发光试验中，ATA 抑制了 PR8、NC、NY、乙型流感病毒、WSN 和奥司他韦耐药的 H274Y 病毒以及重组 N1 和 N4 蛋白的 NA 酶活性[2]。
ATA 抑制在MDCK细胞中，野生型WSN病毒和奥司他韦耐药的H274Y病毒的复制均呈剂量依赖性，其对神经氨酸酶（NA）抑制的IC50值分别为2 μg/mL和18 μg/mL [2]。
在胶质瘤细胞系（T98G、A172）和患者来源的异种移植瘤细胞系（GBM44）中，ATA（10 μM）处理不改变Fn14蛋白水平，但可抑制TWEAK诱导的NF-κB（p65）、Akt和Src的磷酸化[4]。
ATA（10 μM）抑制了TWEAK诱导的A172和T98G胶质瘤细胞中Rac1的激活[4]。
共免疫沉淀实验表明，ATA（10 μM）抑制了TWEAK诱导的A172和GBM44细胞中TRAF2与Fn14的结合。 [4].
ATA (10 μM) 显著抑制了 TWEAK 诱导的 T98G、A172 和 GBM44 胶质瘤细胞的趋化迁移（Transwell 实验）和侵袭（Matrigel 实验），且不影响细胞活力（CellTiterGlo 实验）[4]。
ATA (10 μM) 消除了 TWEAK 赋予胶质瘤细胞的存活表型，表现为 PARP 裂解增加以及替莫唑胺 (TMZ) 或放射 (2 Gy) 处理后克隆形成能力显著受损[4]。
金精三羧酸 (10 μM) 在基于荧光素酶的 miR-21 功能细胞实验中使荧光素酶信号增加约五倍，表明其抑制了 miR-21。它不影响 miR-30 或 miR-93。 ATA 不改变成熟或初级 miR-21 的表达水平，表明其抑制 miR-21 的功能而非表达 [6]。
在 A498 肾癌细胞中，ATA (10 μM) 在剂量依赖性细胞活力测定中将拓扑替康的 IC50 值从 1 μM 降低至 90 nM，在为期 2 周的克隆形成测定中将 IC50 值从 2 μM 降低至 74 nM，表明化疗敏感性恢复 [6]。

在颅内异种移植小鼠模型中，GBM44胶质瘤细胞中Fn14（ATA靶点）的缺失，联合替莫唑胺（TMZ）治疗（50 mg/kg，连续5天，灌胃给药），与单独使用TMZ治疗相比，显著提高了生存率（p < 0.0008）。Fn14表达降低的肿瘤显示出凋亡标志物γH2AX和cleaved-caspase 3水平显著升高[4]。

流感病毒神经氨酸酶抑制试验（无细胞）：采用化学发光法测定神经氨酸酶抑制情况。将ATA进行系列稀释（浓度范围为2000 μg/mL至0.002 μg/mL），稀释液为测定缓冲液（26 mM MES，pH 6.0，4 mM CaCl₂）。取25 μL各稀释液与25 μL稀释后的病毒或重组神经氨酸酶蛋白（溶于测定缓冲液）混合，于37℃孵育30分钟。加入10 μL NA-Star底物（终浓度10 μM），于37℃孵育30分钟。最后加入60 μL NA-Star加速剂，测定化学发光信号。 IC50 值根据 NA 活性相对于对照组的百分比计算得出 [2]。
Rac1 激活实验：胶质瘤细胞预先用 10 μM ATA 或溶剂处理 1 小时，然后用 TWEAK (100 ng/mL) 刺激。收集细胞裂解液，并使用商业化的 pull-down 检测试剂盒，按照制造商的方案 [4] 检测等量蛋白浓度下的 Rac1 活性。
TRAF2-Fn14 结合的共免疫沉淀 (Co-IP)：A172 和 GBM44 细胞预先用 10 μM ATA 或溶剂处理 1 小时，然后用 100 ng/mL TWEAK 刺激 2 分钟。裂解细胞，并使用 TRAF2 抗体或同型对照抗体对 1 mg 蛋白进行免疫沉淀。免疫沉淀物经洗涤后，通过SDS-PAGE电泳分离，转移至硝酸纤维素膜，并用Fn14和TRAF2抗体进行检测[4]。

Western Blot 分析 [4]
细胞类型： T98G、A172、GBM44 胶质瘤细胞
测试浓度： 10 μM
孵育时间： 0.5 小时、1 小时、2 小时
实验结果： 在所有三种 GBM 细胞系中，TWEAK 下游信号通路（包括 NF-κB 家族成员 p65、Akt 和 Src）的激活均被抑制。

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中性红染色法检测细胞毒性和抗病毒活性：将 24 孔板中的 MDCK 细胞单层暴露于 ATA 48 小时以评估细胞毒性。对于抗病毒活性，在病毒吸附后，将细胞与 ATA 孵育 48 小时。加入中性红染料（0.033%）孵育2小时后，固定细胞，溶解掺入的染料。在540 nm处测量吸光度。细胞毒性以未处理对照组的百分比表示；保护作用以未感染对照组的百分比表示[2]。
逆转录-PCR (RT-PCR)：在感染和ATA处理后48小时，从细胞中提取总RNA。使用DNase I处理的RNA（200 ng）进行一步法RT-PCR，引物为流感病毒PR8核蛋白（NP）（正向引物：5'-ACTCACATGATGATCTGG-3'，反向引物：5'-CTGCATTGTCTCCGAAGA-3'）。室温（RT）条件为 50°C 30 分钟，随后进行 10 个循环（94°C 30 秒，58°C 30 秒，68°C 45 秒），再进行 18 个循环（每个循环延伸时间增加 5 秒），最后在 68°C 下延伸 7 分钟。产物在 1% 琼脂糖凝胶上进行电泳分析 [2]。
病毒抗原 ELISA：将感染和处理细胞的上清液澄清后加入包被有抗甲型流感病毒核蛋白单克隆抗体的孔中。孵育和洗涤后，加入生物素标记的兔抗流感病毒多克隆抗体。再次洗涤后，加入链霉亲和素偶联物，然后加入底物溶液。用硫酸终止反应，并在 450 nm 处读取吸光度。病毒丰度根据标准曲线计算为HA单位[2]。
病毒产量降低试验（噬斑试验）：将汇合的MDCK细胞接种于6孔板中，用PR8病毒（MOI 0.001）感染，并用化合物处理48小时。分别收集细胞和上清液。通过冻融循环裂解细胞。将上清液和裂解液与MDCK单层细胞孵育，然后覆盖含有琼脂糖的维持培养基。3天后，用中性红或结晶紫染色噬斑并计数[2]。
直接灭活试验（噬斑试验）：将病毒（约100 pfu）与ATA在37°C下孵育30分钟。将混合物转移至 MDCK 细胞单层上，孵育 2 小时，并按上述方法进行噬斑试验 [2]。
信号通路研究的蛋白质印迹分析：在有或无 ATA (10 μM) 的情况下，用 TWEAK (100 ng/mL) 刺激胶质瘤细胞 (T98G、A172、GBM44)。用 SDS 样品缓冲液裂解细胞。将蛋白质（30 μg）通过 SDS-PAGE 电泳分离，转移至硝酸纤维素膜，并用针对 Fn14、磷酸化 NF-κB p65、总 NF-κB p65、磷酸化 AKT、总 AKT、磷酸化 SRC、总 SRC、裂解型 PARP 和 α-微管蛋白的抗体进行检测 [4]。
趋化性迁移和 Matrigel 侵袭实验：将胶质瘤细胞接种于胶原蛋白包被的 Transwell 小室上室（用于迁移实验）或生长因子减少的 Matrigel 基质胶中（用于侵袭实验）。在下室中加入 TWEAK（100 ng/mL），并分别加入或不加入 ATA（10 μM）。 24小时后，去除未侵袭/迁移的细胞，并将已迁移/侵袭的细胞固定，用DAPI染色，并在五个高倍视野下计数[4]。
克隆形成实验：用TMZ（500 μM）或辐射（2 Gy）处理胶质瘤细胞，同时或不加入TWEAK（100 ng/mL）和/或ATA（10 μM）。24小时后，将250个细胞以三复孔接种于35 mm培养皿中。培养6-7天后，固定细胞，用结晶紫染色，并计数。存活率相对于未处理的对照组进行测定[4]。
细胞凋亡研究（PARP裂解）：用TMZ（250 μM）、TWEAK（100 ng/mL）和ATA（10 μM）处理细胞48小时。采用蛋白质印迹法分析全细胞裂解液中PARP的裂解情况[4]。
细胞活力检测（CellTiterGlo）：将T98G、A172和GBM44细胞以3000个细胞/孔的密度接种于96孔板中。加入不同浓度的ATA处理72小时。加入CellTiterGlo试剂，并测量发光值。原始值以载体对照组（100%细胞活力）和MG132对照组（0%细胞活力）进行标准化[4]。

颅内异种移植模型和替莫唑胺（TMZ）治疗：将表达对照shRNA或Fn14 shRNA的3×10^5个GBM44胶质瘤细胞颅内植入无胸腺裸鼠体内。肿瘤形成后，将小鼠随机分为治疗组（每组n=10）：载体对照组和TMZ组（50 mg/kg）。TMZ通过灌胃给药，连续5天。每日观察小鼠，待其濒死时处死。取出脑组织，用10%中性缓冲福尔马林固定48小时，然后进行石蜡包埋[4]。

在MDCK细胞中，金精三羧酸的半数细胞毒性浓度（CC50）为577 μg/mL，选择性指数（SI）为88.8，表明其在组织培养中毒性相对较低[2]。
浓度高达100 μM的金精三羧酸对HEK293 NF-κB-Luc或NF-κB-Luc/Fn14细胞未表现出任何细胞毒性作用，CellTiterGlo检测结果为[4]。
浓度高达10 μM的金精三羧酸处理未改变T98G、A172或GBM44胶质瘤细胞的细胞活力，CellTiterGlo检测结果为[4]。
先前在仓鼠中的研究表明，以高达1 mg/kg/小时的剂量持续输注ATA两周耐受性良好。 [2].

[1]. Identification of aurintricarboxylic acid as a potent allosteric antagonist of P2X1 and P2X3 receptors. Neuropharmacology. 2019 Nov 1;158:107749.

[2]. Aurintricarboxylic acid is a potent inhibitor of influenza A and B virus neuraminidases. PLoS One. 2009 Dec 17;4(12):e8350.

[3]. Aurintricarboxylic acid, a putative inhibitor of apoptosis, is a potent inhibitor of DNA topoisomerase II in vitro and in Chinese hamster fibrosarcoma cells. Biochem Pharmacol. 1995 Jan 31;49(3):305-13.

[4]. Identification of aurintricarboxylic acid as a selective inhibitor of the TWEAK-Fn14 signaling pathway in glioblastoma cells. Oncotarget. 2017 Feb 14; 8(7): 12234–12246.

[5]. Discovery of a Bioactive Inhibitor with a New Scaffold for Cystathionine γ-Lyase. J Med Chem. 2019 Feb 14;62(3):1677-1683.

[6]. Small molecules with big roles in microRNA chemical biology and microRNA-targeted therapeutics. RNA Biol. 2019 Jun; 16(6): 707-718.

含金三羧酸（GC）属于醌甲烷类化合物。其化学名称为3-亚甲基-6-氧代环己基-1,4-二烯-1-羧酸，其中亚甲基氢被4-羧基-3-羟基苯基取代。其三钠盐为生物染色剂“铬紫CG”，三铵盐为“铝酸铵”。它可用作组织学染料、胰岛素样生长因子受体1拮抗剂和荧光染料。它是一种单羟基苯甲酸，属于醌甲烷类化合物，也是一种三羧酸。它是含金三羧酸盐的共轭酸。它是一种在蛋白质生物合成早期阶段抑制蛋白质合成的染料。其铵盐（铝酸铵）是一种用于比色法测定水、食品和组织中铝含量的试剂。

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金精三羧酸是一种多环芳烃羧酸衍生物，已被证明能够抑制核酸酶和核酸加工酶。此前已证实其对HIV、水疱性口炎病毒、SARS-CoV和牛痘病毒具有抗病毒活性[2]。
ATA的抗流感机制归因于其直接抑制病毒神经氨酸酶，从而导致病毒在细胞表面聚集[2]。
金精三羧酸在利用HEK293细胞（经基因工程改造表达Fn14和NF-κB驱动的荧光素酶报告基因）对LOPAC1280文库进行高通量筛选时，被鉴定为TWEAK-Fn14信号通路的特异性抑制剂。它不抑制TNFα诱导的NF-κB活化[4]。
金精三羧酸已被用作研究细胞过程的化学探针。例如，它被用于发现肌肉细胞中涉及miR-221/222、myoD和myomiRs的新型调控通路[6]。
金精三羧酸据报道具有多种生物活性，包括作为JAK-STAT通路抑制剂和抗凋亡因子[2]。

C22H14O9

422.35

422.063

4431-00-9

13186-45-3 (tri-hydrochloride salt);569-58-4 (tri-ammonium salt);63451-31-0 (calcium (2:3) salt);93480-02-5 (calcium (1:3) salt)

2259

Brown to black solid powder

1.6±0.1 g/cm3

759.6±60.0 °C at 760 mmHg

300 °C(lit.)

427.1±29.4 °C

0.0±2.7 mmHg at 25°C

1.751

4.09

169.43

5

9

5

31

841

0

GIXWDMTZECRIJT-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C22H14O9/c23-16-4-1-10(7-13(16)20(26)27)19(11-2-5-17(24)14(8-11)21(28)29)12-3-6-18(25)15(9-12)22(30)31/h1-9,23-24H,(H,26,27)(H,28,29)(H,30,31)

5-[(3-Carboxy-4-hydroxyphenyl)-(3-carboxy-4-oxocyclohexa-2,5-dien-1-ylidene)methyl]-2-hydroxybenzoic acid

Aurintricarboxylic acid ATA NSC 4056 NSC4056 NSC-4056

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~125 mg/mL (~295.97 mM)
NH4OH : 10 mg/mL (~23.68 mM)
H2O : < 0.1 mg/mL

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.92 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.92 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。