AZD7545

PDHK2 (IC50 = 6.4 nM); PDHK1 (IC50 = 36.8 nM); pyruvate dehydrogenase kinase 2 (PDHK2)

AZD7545（10 μM；对于 BRAF V600E 人类黑色素瘤细胞为 90 小时，对于 NRASmut 人类黑色素瘤细胞为 120 小时）特异性抑制具有 BRAF 和 NRAS 突变的细胞以及对抑制剂耐药的人类黑色素瘤细胞的生长[2]。

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PDH（丙酮酸脱氢酶）多酶复合物催化氧化糖酵解中的关键调节步骤。丝氨酸残基上复合物E1亚基的磷酸化导致酶活性失活。存在一个由四种专用PDH激酶同工酶组成的家族，每种同工酶都显示出不同的组织特异性表达谱AZD7545是为治疗2型糖尿病而开发的一系列PDH激酶抑制剂之一。本文描述了AZD7545和相关化合物的同工酶选择性谱，并讨论了其体内作用模式的后果。[1]

单剂量 AZD7545（口服；10 mg/kg，每日一次（08:00 小时）或每日两次（08:00 和 18:00 小时）；持续 7 天）可增加肝脏 PDH 活性、去磷酸化的比例在 Wistar 大鼠中以剂量相关的方式形成。在肥胖 Zucker (fa/fa) 大鼠中，单次 10 mg/kg 剂量也显着增加肌肉 PDH 活性 [2]。

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PDH（丙酮酸脱氢酶）是控制葡萄糖氧化速率和糖异生前体可用性的关键酶。骨骼肌和肝脏中PDH的激活可能会增加葡萄糖摄取并减少葡萄糖产生。本研究描述了新型PDHK（PDH激酶）小分子抑制剂AZD7545的性质。在PDHK2存在的情况下，AZD7545增加了PDH活性，EC（50）值为5.2 nM。在大鼠肝细胞中，丙酮酸氧化速率被刺激2倍（EC（50）105 nM）。Wistar大鼠单剂量服用AZD7545后，其活性去磷酸化形式的肝脏PDH比例在30mg/kg时以剂量相关的方式从24.7%增加到70.3%；骨骼肌中为21.1%至53.3%。单剂量10mg/kg也显著提高了肥胖Zucker（fa/fa）大鼠的肌肉PDH活性。肥胖、胰岛素抵抗的Zucker大鼠与瘦大鼠相比，餐后血糖水平升高（12周龄时为8.7 mM对6.1 mM）。AZD754510mg/kg）每日两次，持续7天，通过消除餐后血糖升高，显著改善了24小时血糖状况。这些结果表明，PDHK抑制剂可能是改善2型糖尿病治疗中葡萄糖控制的有益药物[2]。

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体内PDH激活[2]
通过Coore等人描述的连接分光光度酶测定法在组织提取物中离体评估PDH活性。在纯化的猪心磷酸酶完全去磷酸化前后评估活性。喂食Wistar大鼠的单次急性剂量AZD7545以剂量依赖的方式将肝脏中活性PDH的百分比从基础（赋形剂给药）水平24.7±6.2%增加到最高评估剂量（30mg/kg）的70.3±2.6%，很明显没有达到最大活化（图1）。在相似剂量的化合物下，腓肠肌中的PDH增加，但在测试的剂量下（从21.1±1.9%到53.3±4.0%）仍未达到完全激活。Aicher等人在经历了一段禁食期的大鼠身上证明了体内活性；PDH活化通过血浆乳酸间接测定或通过体外测量PDH活性测定[14]。在20µmol/kg（约8mg/kg）的剂量下，代表性化合物引起的肝脏和胫骨前肌PDH的增加相对温和，但结果并未表示为活动状态下PDH的比例，因此无法与我们自己的研究结果进行比较。

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AZD7545对Zucker（fa/fa）大鼠的影响[2]
肥胖（fa/fa）Zucker大鼠是胰岛素抵抗或糖尿病前期状态的常用模型。它表现为糖耐量受损、食欲亢进、高胰岛素血症和高脂血症。虽然没有明显的高血糖，但与瘦肉型大鼠相比，fa/fa大鼠在进食后表现出异常的葡萄糖水平（在黑暗进食阶段4小时后，血糖水平为8.7 mM，而瘦肉型动物为6.1 mM）。这与糖化血红蛋白水平小幅但持续显著升高有关（3.49%对3.26%）。在我们研究中使用的年龄（12周），与瘦Zucker或Wistar大鼠相比，fa/fa大鼠的PDH活性升高。我们测量了肥胖和瘦Zucker大鼠之间PDHK2或PDHK4的表达水平没有差异。与Wistar大鼠一样，喂食fa/fa大鼠的PDH可以被PDHK抑制剂进一步激活（例如，10mg/kgAZD7545使肌肉PDH从61.0%增加到97.0%，肝脏PDH从33.5%增加到72.8%）。肥胖的Zucker大鼠口服PDHK抑制剂AZD7545治疗7天，在此期间结束时监测24小时的葡萄糖谱（图2）。在对照组中，经赋形剂处理的大鼠血糖最高升至9.45±1.11 mM，而在每天08:00用AZD7545治疗的大鼠中，同时血糖浓度为6.55±0.58 mM。每天两次给药后，餐后血糖升高也出现了类似的消失。

实时增殖检测[3]
将5个黑色素瘤细胞系的50×103个细胞/孔接种在12孔板上，24小时后用10μM的AZD7545刺激。在IncuCyte ZOOM活细胞显微镜中监测细胞生长，每3小时拍摄一次相位对比图像，共90小时。对三个生物重复进行增殖试验，每个图显示一个代表性重复。

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长期增殖试验[3]
A375 iRFP细胞用于测试1μM PLX4032和10μM AZD7545的组合与单独使用PLX4032。每孔接种10000个细胞（6孔板），并用抑制剂处理3周。每周更换两次介质。治疗3周后，扫描细胞，并使用LI-COR Odyssey仪器测量iRFP信号的强度。使用Image Studio lite 4.0版软件对iRFP信号进行量化。

肥胖雄性（fa/fa）Zucker大鼠[2]；
10 mg/kg；
口服给药；每日一次（08:00）或每日两次（08:00和18:00）；连续7天；

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雄性Wistar大鼠（200–240 g）于08:00口服AZD7545悬浮液（溶于0.5% (w/w) 甲基纤维素/0.1% 聚山梨酯80）。2小时后，用戊巴比妥钠（60 mg/kg，腹腔注射）麻醉动物，切取组织，冷冻钳夹后置于液氮中保存，以备后续测定。制备组织提取物，并采用Coore等人的方法测定PDH活性。提取物中的总丙酮酸脱氢酶 (PDHt) 活性通过猪心 PDP 在 20 mM MgCl2/0.8 mM CaCl2 存在下进行脱磷酸化测定。PDH 活性以肝脏 (
) 和腓肠肌 (_) 提取物中活性（脱磷酸化）形式的比例表示。结果与对照组组织进行比较。[2]

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肥胖雄性 (fa/fa) Zucker 大鼠饲养于 06:00 开/18:00 关光周期下，连续 7 天分别口服 10 mg/kg AZD7545，给药时间为 08:00 ( ) 或 08:00 和 18:00 ()，或给予溶剂 (
)。第 8 天，使用手持式血糖仪测量血糖。[2]

[1]. AZD7545 is a selective inhibitor of pyruvate dehydrogenase kinase 2. Biochem Soc Trans. 2003 Dec;31(Pt 6):1168-70.

[2]. AZD7545, a novel inhibitor of pyruvate dehydrogenase kinase 2 (PDHK2), activates pyruvate dehydrogenase in vivo and improves blood glucose control in obese (fa/fa) Zucker rats. Biochem Soc Trans. 2003 Dec;31(Pt 6):1165-7.

[3]. ROS production induced by BRAF inhibitor treatment rewires metabolic processes affecting cell growth of melanoma cells. Mol Cancer. 2017 Jun 8;16(1):102.

AZD7545 是一种砜类化合物，其苯环分别在 1、3 和 4 位被 [4-(二甲基氨基甲酰基)苯基]磺酰基、氯和 [(2R)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰基]氨基取代。它是一种强效的非 ATP 竞争性丙酮酸脱氢酶激酶 2 (PDHK2) 抑制剂，IC50 为 6.4 nM，并具有降血糖活性。此外，它还能以更高的浓度抑制 PDHK1 (IC50 = 36.8 nM)。AZD7545 可用作降血糖药物和 EC 2.7.11.2 型丙酮酸脱氢酶（乙酰转移）激酶抑制剂。它属于苯甲酰胺类、砜类、叔醇类、叔羧酰胺类、仲羧酰胺类、单氯苯类和有机氟化合物。

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这是首次报道在肥胖的Zucker大鼠中测试一种新型PDHK抑制剂，并提供了明确的证据，表明PDHK抑制剂可以改善葡萄糖稳态受损动物模型的血糖控制。这与Aicher等人[14]的说法相反，他们认为小分子抑制剂在糖尿病动物模型（ob/ob小鼠和ZDF大鼠）中无效。显然，我们的数据表明，PDHK抑制剂将成为治疗2型糖尿病的一种有效新疗法。[2]

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背景：大多数BRAFV600E阳性黑色素瘤患者对BRAF激酶抑制剂和MEK抑制剂的联合治疗反应良好。然而，部分患者本身就存在耐药性，而大多数患者最终都会对治疗产生耐药性。对于BRAF和MEK抑制剂疗效不佳的患者，亟需寻找新的治疗靶点。细胞代谢就是一个很有前景的新靶点：突变型BRAFV600E已被证实会影响细胞代谢。
方法：我们对一组BRAFV600E和BRAFWT/NRASmut人黑色素瘤细胞进行了时间进程实验和一系列蛋白质印迹分析，这些细胞与BRAF和MEK1激酶抑制剂共同孵育。我们采用siRNA方法来研究相关的代谢因子。采用共聚焦显微镜检测活性氧（ROS），并测试了靶向丙酮酸脱氢酶激酶（PDK）的抑制剂AZD7545。结果：我们发现，在BRAFV600E突变细胞和BRAFWT/NRASmut突变细胞中，RAS/RAF/MEK/ERK通路抑制可诱导丙酮酸脱氢酶PDH-E1α亚基的磷酸化。抑制BRAF、MEK1以及使用siRNA敲低ERK1/2均可介导PDH的磷酸化。siRNA介导的PDK敲低或使用DCA（一种泛PDK抑制剂）均可消除PDH-E1α的磷酸化。BRAF抑制剂处理还诱导了ROS的上调，同时伴有PDH磷酸化的诱导。 MitoQ对ROS的抑制作用抑制了PDH-E1α的磷酸化，这强烈提示ROS介导了PDK的激活。有趣的是，使用AZD7545抑制PDK1可特异性地抑制BRAF突变型和BRAF抑制剂耐药型黑色素瘤细胞的生长。
结论：在BRAFV600E和BRAFWT/NRASmut黑色素瘤细胞中，RAS/RAF/MEK/ERK通路抑制后ROS生成增加，进而激活PDK，PDK反过来磷酸化并灭活PDH。作为一种可能的补救途径，三羧酸循环受到抑制，导致氧化代谢减少和ROS水平降低。我们发现，使用AZD7545抑制PDK可抑制BRAF突变型和BRAF抑制剂耐药型黑色素瘤细胞的生长。因此，像AZD7545这样的小分子PDK抑制剂可能成为治疗RAS/RAF/MEK/ERK通路激活突变（50% BRAF突变，25% NRAS突变，11.9% NF1突变）黑色素瘤患者的联合治疗药物。[3]DCA已在多种细胞培养和啮齿动物癌症模型中进行了测试，并且有研究表明PDK1敲低可以增强BRAFV600E阳性黑色素瘤对BRAF抑制剂的敏感性。我们测试了一种泛PDK抑制剂AZD7545，该抑制剂通过干扰PDK的脂酰结合口袋来抑制BRAFV600E和NRAS突变阳性细胞的生长。我们观察到，当AZD7545浓度为μM时，它可以抑制BRAFV600E阳性细胞和激酶抑制剂耐药细胞的生长。有趣的是，AZD7545 对角质形成细胞 (HaCaT) 和正常成纤维细胞（构成黑色素瘤肿瘤皮肤微环境的细胞类型）没有影响（数据未显示），表明其对 BRAF/NRAS 突变或耐药癌细胞具有选择性作用。最后，我们发现 BRAF 抑制剂与 PDK 抑制剂联合使用比单一疗法更能有效抑制肿瘤生长，这表明同时靶向代谢通路可能确实对黑色素瘤患者有益。[3]

C19H18CLF3N2O5S

478.87

478.057

C, 47.66; H, 3.79; Cl, 7.40; F, 11.90; N, 5.85; O, 16.71; S, 6.69

252017-04-2

16741245

White to off-white solid powder

1.5±0.1 g/cm3

683.1±55.0 °C at 760 mmHg

366.9±31.5 °C

0.0±2.2 mmHg at 25°C

1.573

2.66

67.25

2

8

5

31

778

1

ClC1C([H])=C(C([H])=C([H])C=1N([H])C([C@](C([H])([H])[H])(C(F)(F)F)O[H])=O)S(C1C([H])=C([H])C(C(N(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H])=O)=C([H])C=1[H])(=O)=O

DTDZLJHKVNTQGZ-GOSISDBHSA-N

InChI=1S/C19H18ClF3N2O5S/c1-18(28,19(21,22)23)17(27)24-15-9-8-13(10-14(15)20)31(29,30)12-6-4-11(5-7-12)16(26)25(2)3/h4-10,28H,1-3H3,(H,24,27)/t18-/m1/s1

4-[3-chloro-4-[[(2R)-3,3,3-trifluoro-2-hydroxy-2-methylpropanoyl]amino]phenyl]sulfonyl-N,N-dimethylbenzamide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.22 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.22 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.22 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。