Bavachinin (BVC; 7-O-Methylbavachin; Bavachinin A)   中文名称: 补骨脂二氢黄酮甲醚

PPAR-γ(IC50 = 0.622 μM); PPARα (IC50 = 21.043 μM); PPARδ (IC50 = 12.819 μM); HIF-1α

本研究旨在证明天然化合物Bavachinin在体外和体内都具有强大的抗血管生成活性。Bavachinin以浓度依赖的方式抑制缺氧下人KB癌（HeLa细胞衍生物）和人HOS骨肉瘤细胞中HIF-1α活性的增加，可能是通过增强von Hippel-Lindau（VHL）和HIF-1α之间的相互作用。此外，Bavachinin降低了与HIF-1调节的血管生成和能量代谢相关的基因的转录，如血管内皮生长因子（VEGF）、Glut 1和己糖激酶2。Bavachinin还抑制了人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的管形成以及KB细胞的体外迁移。2.

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Bavachinin抑制Th2细胞分化[3]
为了研究Bavachinin对Th2细胞分化的影响，在IL-4存在的情况下，用刀豆蛋白A激活IL-4-GFP（4get）小鼠的脾细胞48小时，并通过流式细胞术分析GFP+细胞的百分比。我们观察到Bavachinin以剂量依赖的方式显著降低了GFP+细胞的百分比（图1a和b）。通过定量PCR分析，这种减少反映了IL-4表达的抑制。同样，Bavachinin抑制了IL-5和IL-13的mRNA表达（图1c）。这些结果表明，Bavachinin抑制Th2细胞因子的表达。

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Bavachinin（BNN）是补骨脂的主要活性成分之一，可以激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）。PPARγ已成为癌症的一个有前景的治疗靶点。本研究旨在探讨BNN对非小细胞肺癌（NSCLC）的抗肿瘤作用。进行细胞计数Kit-8和乳酸脱氢酶释放试验以测量细胞毒性。Western blot和免疫荧光法分析凋亡相关因子和PPARγ的表达。通过药物亲和反应靶稳定性（DARTS）和细胞热转移试验（CETSA）评估PPARγ与BNN结合的能力。使用活性氧（ROS）测定试剂盒检测ROS水平。结果表明，BNN以剂量依赖的方式降低了A549细胞的存活率和细胞存活率。本研究结果还表明，BNN剂量依赖性地改变了Bcl-2、Bax、caspases-3/9和PPARγ的表达。此外，通过细胞毒性和抗增殖作用，BNN的凋亡相关蛋白的抑制特性被PPARγ拮抗剂T0070907和GW9662完全抑制。DARTS和CETSA结果证实了PPARγ的蛋白结合活性。此外，已经证明BNN诱导的ROS产生依赖于PPARγ的激活。综上所述，本研究表明，BNN通过激活PPARγ诱导A549细胞死亡，这是一种由ROS水平升高介导的作用。这些结果强调了BNN作为抗NSCLC化疗药物的潜在作用。[4]

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BVC/Bavachinin是一种天然的泛PPAR激动剂，具有强大的结合亲和力[5]
采用报告基因分析法测定BVC/Bavachinin对PPAR-α、-β/δ或-γ的活性。如图1所示，BVC（图1a）剂量依赖性地诱导了小鼠LBD（图1b-d）和三种PPAR亚型全长（图1e-g）的转录活性。值得注意的是，BVC对PPAR-γ的活性强于PPAR-α和PPAR-β/δ（EC50=0.74μmol/l、4.00μmol/l和8.07μmol/l）；表1）。 为了研究BVC对PPAR-γ的细胞作用，使用胰岛素、地塞米松和RSG或BVC诱导3T3-L1前脂肪细胞分化。BVC以剂量依赖的方式促进3T3-L1脂肪细胞分化（图1h）。1μmol/l BVC能有效激活3T3-L1的分化，10μmol/l的BVC几乎完全激活了3T3-L1分化。结果表明，BVC在细胞水平上激活PPAR-γ

竞争性结合试验（图1i-k）表明，BVC/Bavachinin与人PPAR-γ的结合更强（k i=223 nmol/l；表1）比人PPAR-α和-β/δ（K i=7.88和5.28μmol/l；表1）。此外，BVC对PPAR-γ的结合亲和力比RSG弱五倍，对PPAR-α的结合亲和力是非诺贝特酸和WY14643的两倍

与完全PPAR-γ激动剂RSG和PPAR-α激动剂GW7647相比，BVC/Bavachinin没有诱导经典转录辅因子、过氧化物酶体增殖激活受体γ、辅激活因子1α（PGC1α）和介体复合物亚基1（TRAP220/DRIP）的募集（ESM图1a-c）。使用报告基因和辅激活子募集试验，BVC没有激活与代谢综合征相关的其他核受体，如肝脏x受体（LXR）-α、LXR-β/δ和法尼醇x受体（FXR）（ESM图1d-g），表明BVC对PPAR的特异性。

在裸鼠中，Bavachinin（5 mg/kg；腹腔注射；连续7天）可以阻碍kit KB肿瘤生长和血管生成[2]。小鼠肿瘤可用贝伐菌素（50mg/kg；腹腔注射；连续7天）治疗.

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Bavachinin可减少肿瘤生长和微血管形成[2]
为了证实Bavachinin在体内具有抗肿瘤作用，将KB细胞接种到裸鼠体内以产生肿瘤，并在植入后三天开始用Bavachinin（5mg/kg）或载体对照（PBS）治疗（肿瘤为50mm3）。在开始治疗后28天内测量体重和肿瘤生长。对照组的肿瘤体积稳步增加，达到1800 mm3，在四周内增加了36倍。与仅使用载体相比，腹腔注射Bavachinin可显著减少肿瘤体积40.06%（图7A和C）。在治疗过程中，根据组织病理学评估，Bavachinin没有进行全面尸检，因此建议Bavachini没有毒性迹象（图7B）。尽管对照组和Bavachinin治疗组小鼠的体重没有差异，但在四周内观察到体重略有增加，这可能是由于正常生长。因此，Bavachinin可以阻断体内血管生成。为了进一步研究Bavachinin的抗血管生成作用，我们通过免疫组织化学分析了肿瘤内微血管的密度。从对照组和Bavachinin治疗的小鼠制备4μm厚的肿瘤切片。切片用抗CD31抗体染色以检测微血管。尽管在Bavachinin治疗的肿瘤中仍检测到小血管，但与对照肿瘤相比，Bavachini治疗的肿瘤具有更少的管腔大小的血管（图7D）。此外，CD31染色显示，在Bavachinin治疗的小鼠中，存在一种异常形态，其特征是周细胞附着松散或缺失，这表明Bavachini在体内抑制了肿瘤血管生成。

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Bavachinin治疗哮喘的疗效[3]
Th2细胞和IL-4、IL-5和IL-13在哮喘的病理生理学中至关重要。基于对Th2细胞分化和细胞因子产生的显著抑制，我们研究了Bavachinin在体内对哮喘的潜在影响。从激发的最后一天开始，每天通过PEG400（50mg/kg体重）经口灌胃给药巴伐希宁，持续7天（图2）。我们观察到，与用磷酸缓冲盐水治疗的哮喘小鼠相比，用Bavachinin治疗的小鼠的支气管壁厚度和气道平滑肌面积显著减少（图3a）。与对照组小鼠相比，经治疗的哮喘小鼠在攻击后气道高反应性降低（图3a）。此外，与哮喘小鼠相比，Bavachinin的给药导致ACh反应性显著下调（图3b）。为了进一步证实Bavachinin在体内的作用，还测量了血清中IL-4和IgE的水平。事实上，Bavachinin治疗显著抑制了IL-4和IgE的血清水平，这是哮喘的标志（图3c和d）。总的来说，我们的研究结果首次证明了Bavachinin在哮喘动物模型中的治疗效果。

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Bavachinin显著降低肺中Th2细胞因子的表达和细胞浸润[3]
为了验证Bavachinin的治疗效果，进一步分析了哮喘小鼠的肺组织。我们观察到Bavachinin抑制肺组织中Th2细胞因子的表达，IL-4、IL-5和IL-13的模式相似（图4a）。我们还评估了肺中嗜酸性粒细胞和中性粒细胞的浸润情况。与哮喘小鼠相比，服用该化合物后肺间质中嗜酸性粒细胞和中性粒细胞的数量显著减少（图4b）。我们的研究结果进一步支持Bavachinin通过改变局部细胞因子表达对哮喘发病机制的治疗作用。

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用Bavachinin治疗可选择性降低全身Th2细胞因子水平[3]
为了测试Bavachinin对CD4+T细胞分化的整体影响，用PMA/离子霉素激活哮喘小鼠的脾细胞进行细胞内细胞因子染色。Bavachinin治疗显著降低了CD4+T细胞产生IL-4、IL-5和IL-13，而IFN-λ和IL-17的产生没有受到影响（图5）。总之，Bavachinin的给药选择性地改变了OVA免疫诱导的Th2分化。

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BVC/Bavachinin显示出降血糖特性，不会引起体重增加和肝毒性。重要的是，BVC与合成PPAR-γ激动剂噻唑烷二酮类和PPAR-α激动剂贝特类协同作用，诱导PPAR转录活性，并降低db/db小鼠的葡萄糖和三酰甘油水平。我们进一步发现，除了PPAR合成激动剂的典型位点外，BVC还占据了一个新的替代结合位点，合成PPAR-γ激动剂罗格列酮可以阻断BVC与该典型位点的结合，但不能阻断BVC对替代位点的结合。 结论/解释：这是首次报道BVC/Bavachinin和合成激动剂通过与PPAR-γ或-α的独特结合诱导的协同降糖降脂作用。这种组合可能会提高上市药物作为治疗代谢综合征的辅助疗法的疗效并降低其毒性[5]。

药物亲和力反应靶稳定性（DARTS）[4]
DARTS按照我们之前的研究所述进行。细胞用补充有1%磷酸酶和蛋白酶抑制剂的M-PER裂解缓冲液裂解，并在4°C下以16000×g离心20分钟。接下来，在室温下将10X TNC缓冲液（50 mM Tris·Cl、50 mM NaCl、10 mM CaCl2）加入上清液中10分钟。将裂解物与DMSO或Bavachinin（1、10或100µM）在室温下孵育1小时，然后在室温下与0.03 mg/ml链霉蛋白酶孵育30分钟。使用SDS负载缓冲液停止蛋白水解。所有样本均通过蛋白质印迹法进行分析。

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细胞热位移测定（CETSA）[4]
收集在37°C下用BavachininBNN（10µM）或DMSO处理24小时的细胞，将细胞悬浮液分配到0.2 ml PCR管中，每管中有200µl细胞悬浮液。将PCR管在指定温度（42、45、48、51和54°C）下加热3分钟。然后在加热后立即将其取出并在4°C下孵育。然后使用用于蛋白质的细胞裂解缓冲液裂解细胞，并按照上述蛋白质印迹方法所述通过蛋白质印迹进行分析。

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细胞内活性氧（ROS）的测量[4]
ROS检测试剂盒用于测量细胞内ROS积累。将A549细胞接种在6孔培养板上（8×103个细胞/孔），用不同浓度的Bavachinin/ BNN（10、20、40µM）、PPARγ拮抗剂GW9662（20µM）和T0070907（10µM）处理。将细胞与10µM DCFH-DA在37°C下孵育20分钟，并使用荧光显微镜捕获图像。然后收集细胞，并使用SpectraMax iD3酶标仪在488nm的激发波长和525nm的发射波长下进行测量。

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TR-FRET测定[5]
LanthaScreen时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）竞争性结合或共激活子检测使用标记有谷胱甘肽S-转移酶（GST）的人核受体的配体结合结构域（LBD）、铽标记的抗GST抗体和荧光小分子或共激活肽。

免疫荧光[4]
细胞类型： A549 细胞
测试浓度： 25 μM、50 μM
孵育时间： 24小时
实验结果：显示细胞质中的PPARγ蛋白水平和细胞质Bavachinin（25、50μM；24小时）增加PPARγ蛋白表达[4]。细胞核显着升高。

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细胞计数试剂盒-8（CCK-8）测定[4]
A549和16HBE细胞都接种在96孔培养板上（2×103个细胞/孔），24小时后取出细胞培养基。向细胞中加入含有不同浓度的Bavachinin/BNN（0、25、50、100和150µmol/l）的培养基。在37°C下处理24小时后，向每个孔中加入10µl CCK-8溶液，并在37°℃下与5%CO2一起孵育1小时。然后使用SpectraMax iD3酶标仪测量450nm处的吸光度值。通过比较细胞存活率和BNN浓度来计算IC50。

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乳酸脱氢酶（LDH）释放试验[4]
将A549细胞接种在96孔培养板上（2×103个细胞/孔），用不同浓度的Bavachinin/ BNN（10、20、40或80µM）或PPARγ拮抗剂GW9662（20µM）和T0070907（10µM）处理24小时。根据制造商的说明，收集细胞培养基（100µl），使用LDH细胞毒性测定试剂盒测定LDH。反应后，使用SpectraMax iD3酶标仪在490nm波长下读取吸光度。

动物/疾病模型： 将KB细胞皮下接种到无胸腺裸鼠体内[2]
剂量： 5 mg/kg
给药途径： 腹腔注射
实验结果： 结果表明肿瘤体积显著缩小了40.06%，管腔大小和血管数量也减少了[3]。

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动物/疾病模型： 哮喘小鼠[3]
剂量： 50 mg/kg
给药途径： 灌胃
实验结果： 结果表明血清IL-4和IgE水平显著降低。

小鼠口服LD50 >1 gm/kg，《印度药物》，29(662)，1992

[1]. Isobavachalcone and bavachinin from Psoraleae Fructus modulate Aβ42 aggregation process through different mechanisms in vitro. FEBS Lett. 2013 Sep 17;587(18):2930-5.

[2]. Anti-angiogenic and anti-tumor activity of Bavachinin by targeting hypoxia-inducible factor-1α. Eur J Pharmacol. 2012 Sep 15;691(1-3):28-37.

[3]. Treatment of allergic inflammation and hyperresponsiveness by a simple compound, Bavachinin, isolated from Chinese herbs. Cell Mol Immunol. 2013 Nov;10(6):497-505.

[4]. Bavachinin exhibits antitumor activity against non small cell lung cancer by targeting PPARγ. Mol Med Rep. 2019 Sep;20(3):2805-2811.

[5]. Bavachinin, as a novel natural pan-PPAR agonist, exhibits unique synergistic effects with synthetic PPAR-γ and PPAR-α agonists on carbohydrate and lipid metabolism in db/db and diet-induced obese mice. Diabetologia. 2016 Jun;59(6):1276-86.

巴伐奇宁属于黄烷酮类化合物。
已有报道称巴伐奇宁存在于补骨脂（Cullen corylifolium）中，并有相关数据报道。
另见：补骨脂果实（部分）。

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Aβ的自发聚集是阿尔茨海默病发展的关键因素。为了从传统中药中寻找Aβ聚集抑制剂，我们从补骨脂中鉴定出两种活性化合物，即异补骨脂酮和巴伐奇宁。我们进一步证实，这两种化合物通过不同的机制调节Aβ42的聚集过程。异补骨脂酮显著抑制Aβ42的寡聚化和纤维化，而巴伐奇宁抑制纤维化并导致非典型聚集。这两种化合物均能减轻Aβ42在SH-SY5Y细胞模型中诱导的毒性。这些发现可能为未来新药研发和阿尔茨海默病治疗提供有价值的信息。 [1]

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缺氧诱导因子-1 (HIF-1) 由两个亚基组成：组成型表达的 HIF-1β 和氧响应性亚基 HIF-1α。HIF-1α 在缺氧条件下过度表达，增强与肿瘤进展、血管生成、转移和侵袭相关的转录活性。本研究旨在证明天然化合物巴伐奇宁在体外和体内均具有显著的抗血管生成活性。巴伐奇宁以浓度依赖的方式抑制缺氧条件下人 KB 癌细胞（HeLa 细胞衍生细胞）和人 HOS 骨肉瘤细胞中 HIF-1α 活性的增加，这可能是通过增强 von Hippel-Lindau (VHL) 蛋白与 HIF-1α 的相互作用实现的。此外，巴伐奇宁可降低与血管生成和能量代谢相关的、受HIF-1调控的基因的转录，例如血管内皮生长因子（VEGF）、谷氨酸转运体1（Glut 1）和己糖激酶2（Hexokinase 2）。巴伐奇宁还能抑制人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的管状结构形成以及KB细胞的体外迁移。体内研究表明，每周三次注射巴伐奇宁，持续四周，可显著降低裸鼠KB异种移植瘤的肿瘤体积和CD31表达。这些数据表明，巴伐奇宁可作为一种抑制肿瘤血管生成的治疗药物。[2] 哮喘炎症是由2型辅助性T细胞（Th2）细胞因子反应介导的，阻断Th2细胞因子的产生已被证实对哮喘炎症具有显著的治疗作用。我们利用IL-4-绿色荧光蛋白（GFP）报告基因小鼠，证实了从中药中分离得到的单一化合物巴伐宁能够显著抑制Th2细胞因子（包括IL-4、IL-5和IL-13）的产生。值得注意的是，该化合物几乎完全阻断了卵清蛋白（OVA）致敏动物哮喘模型中的炎症反应。此外，我们还证实该化合物选择性地影响GATA-3的水平，这很可能是通过影响GATA-3 mRNA的稳定性实现的。我们的研究结果首次揭示了这种源自中药的单一化合物的潜在治疗价值。[3] 目的/假设：泛过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）激动剂长期以来一直被认为是治疗代谢综合征的有效药物，但目前的PPAR激动剂疗效有限且存在不良反应。天然草药为预防和治疗复杂的代谢综合征提供了一种尚未充分利用的结构资源。方法：采用报告基因、竞争性结合和3T3-L1前脂肪细胞分化实验等体外方法筛选天然PPAR激动剂。在db/db小鼠和饮食诱导肥胖小鼠中验证其对代谢表型的影响。此外，通过核磁共振、分子对接、报告基因实验和小鼠实验，研究了巴伐奇宁（BVC，一种从传统中药降血糖药马来豆果实中提取的新型天然泛PPAR激动剂）与合成PPAR激动剂的潜在协同作用。[5]

C21H22O4

338.3970

338.151

19879-30-2

10337211

White to light yellow solid powder

1.2±0.1 g/cm3

537.1±50.0 °C at 760 mmHg

139-145ºC

190.3±23.6 °C

0.0±1.5 mmHg at 25°C

1.590

4.93

55.76

1

4

4

25

488

1

CC(=CCC1=CC2=C(C=C1OC)O[C@@H](CC2=O)C3=CC=C(C=C3)O)C

VOCGSQHKPZSIKB-FQEVSTJZSA-N

InChI=1S/C21H22O4/c1-13(2)4-5-15-10-17-18(23)11-20(14-6-8-16(22)9-7-14)25-21(17)12-19(15)24-3/h4,6-10,12,20,22H,5,11H2,1-3H3/t20-/m0/s1

(2S)-2,3-dihydro-2-(4-hydroxyphenyl)-7-methoxy-6-(3-methyl-2-buten-1-yl)-4H-1-benzopyran-4-one

7-O-Methylbavachin; Bavachinin; 19879-30-2; Bavachinin A; 7-O-Methylbavachin; 4H-1-Benzopyran-4-one, 2,3-dihydro-2-(4-hydroxyphenyl)-7-methoxy-6-(3-methyl-2-buten-1-yl)-, (2S)-; VL3EV483SZ; UNII-VL3EV483SZ; BRN 3629340;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~125 mg/mL (~369.39 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (6.15 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (6.15 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。