BAY-876   中文名称: BAY-876

Glucose transporter 1/GLUT1 (IC50 = 2 nM); GLUT2/3/4 (IC50 = 10~ 0.3 μM)

生长抑制性 BAY-876（25–75 nM；24 和 72 小时）以剂量依赖性方式减少 SKOV-3 和 OVCAR-3 细胞的数量 [2]。

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为了了解GLUT1失调在肿瘤发生中的生物学结果，我们询问癌症卵巢细胞是否依赖GLUT1来支持糖酵解代谢。正如我们和其他人之前所证明的，卵巢癌症细胞在常规培养条件下表现出高的基础糖酵解活性（图1A）。尽管BAY-876已被证明可以抑制葡萄糖摄取，但其对下游糖酵解代谢的影响尚不清楚。因此，我们检测了BAY-876对卵巢癌症细胞系中糖酵解和乳酸产生的影响，包括已知缺乏功能性GLUT1的A2780作为阴性对照。如图1A所示，与BAY-876一起孵育会剂量依赖性地降低SKOV-3、OVCAR-3和HEY细胞的糖酵解速率。同样，BAY-876降低了这些细胞培养上清液中的乳酸水平（图1B）。尽管BAY-876的这种抗糖酵解作用在单个数字纳摩尔浓度下是可以检测到的，但在25-50nM的化合物下实现了半最大抑制。我们还在其他常用的卵巢癌症细胞系如OVCR-429和OVCA-432中观察到BAY-876类似的抗糖酵解活性。 据报道，在A2780卵巢癌症细胞系中，GLUT1与突变PTEN共同定位于细胞核而非质膜。与BAY-876通过特异性抑制GLUT1而非其他GLUT1成员或脱靶蛋白抑制糖酵解一致，BAY-876不影响A2780细胞中的糖酵解或乳酸产生（图1A、B）。BAY-876对GLUT1介导的糖酵解的特异性作用进一步通过GLUT1的siRNA沉默得到证实。分子方法降低了SKOV-3和OVCAR-3细胞的糖酵解速率和乳酸产量（图1C）。 [2]

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GLUT1介导应激条件下糖酵解的上调[2]
与正常细胞相比，癌症和其他恶性细胞的基础有氧糖酵解通常较高。癌症细胞的糖酵解活性也随着肿瘤微环境提示的变化而波动，以满足快速生长的肿瘤细胞的生物能量和生物合成需求。特别是，糖酵解在缺氧条件下会增强。已知GLUT1是缺氧靶基因之一，由HIF上调[18]。我们使用氯化钴（CoCl2）作为稳定HIF的手段来检测卵巢癌症细胞中GLUT1的诱导性。如图2A所示，在所有卵巢癌症细胞系中，CoCl2高度诱导GLUT1。GLUT1的诱导与细胞糖酵解的增加有关（图2A）BAY-876降低了SKOV-3、OVCAR-3和HEY细胞中基础和CoCl2刺激的糖酵解。尽管CoCl2增加了A2780细胞中GLUT1的表达和糖酵解，但BAY-876对基础糖酵解或CoCl2驱动的糖酵解都没有影响，这表明GLUT1非依赖性机制涉及A2780细胞的HIF驱动糖酵解。

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抑制GLUT1会导致生物能量损失和AMP激活蛋白激酶（AMPK）的激活[2]
与使用氧化磷酸化作为主要生物能量源的正常细胞不同，癌症细胞严重依赖糖酵解对ADP进行底物磷酸化以形成ATP。接下来，我们确定GLUT1抑制是否足以减少卵巢癌症细胞中ATP的产生。如图3A所示，用BAY-876处理SKOV-3和OVCAR-3后，细胞ATP水平显著降低。与ATP丰度降低一致，治疗导致5′-腺苷酸活化蛋白激酶α（AMPKα）激活，这反映在AMPKα在Thr-172处的磷酸化增加（图3B）。BAY-876再次对A2780细胞中的ATP水平或AMPKα磷酸化没有影响。总之，这些结果支持了BAY-876通过特异性抑制GLUT1来损害糖酵解相关ATP生成的结论。

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为了进一步了解GLUT1抑制的代谢结果，我们通过跟踪用或不用BAY-876处理的SKOV-3、OVCAR-3和A2780细胞的耗氧率（OCR）来测量氧化磷酸化。与对糖酵解的影响相反，BAY-876增加了这些细胞的OCR，这是使用Seahorse XF24分析仪测定的（图3C）。在SKOV-3细胞中观察到基础线粒体呼吸（基础OCR）、ATP连锁OCR和最大呼吸能力的显著增加。在OVCAR-3中，检测到基础OCR和ATP相关OCR的增加。BAY-876治疗后呼吸增加的机制尚不完全清楚。由于它在A2780细胞中不存在，BAY-876对SKOV-3和OVCAR-3细胞OCR的这种影响也是GLUT1依赖性的，可能是对GLUT1糖酵解ATP级联抑制的补偿反应。 [2]

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抑制GLUT1抑制卵巢癌症细胞的增殖、活力和锚定依赖性生长[2]
鉴于过度活跃的糖酵解在支持癌症恶性特征方面的重要性，我们接下来评估了BAY-876对卵巢癌症细胞生长和生存能力的影响。首先，我们用<100 nM浓度的BAY-876处理卵巢癌症细胞系，其显著降低糖酵解，细胞毒性很小，如图1所示。用这些浓度的BAY-876治疗一天导致SKOV-3和OVCAR-3细胞数量的剂量依赖性减少（图4A）。在75 nM BAY-876存在下的三天生长曲线进一步证实了SKOV-3、OVCAR-3和HEY的生长抑制作用，但在A2780细胞中没有（图4B）。为了评估BAY-876对细胞生长和细胞毒性的联合作用，这些细胞系用高达10µM的更大剂量范围的BAY-877处理3天。用MTT法测定活细胞的线粒体活性。图4C的结果显示，OVCAR-3对BAY-876最敏感，IC50值约为60 nM。SKOV-3和HEY的IC50值分别为188和1002 nM。与缺乏功能性GLUT1和抗糖酵解作用一致，A2780细胞即使在高达2µM的浓度下也对BAY-876的处理无效（图4C）。

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从中等效力和代谢不稳定的HTS hit 1开始，在喹啉的2位携带呋喃基部分，总共携带四个甲基，我们通过替换呋喃并去除两个喹啉甲基，迅速提高了效力和代谢稳定性。使用化合物3的喹啉核心，我们发现一个未取代的亚甲基是苯基和吡唑环之间的最佳间隔物。在成功地将一个吡唑甲基替换为代谢上更稳定的CF3基团（12）后，对喹啉核心的进一步SAR探索表明，2位的未取代酰胺和7位的氟（19，BAY-876）对GLUT1的效力和对其他GLUTs的选择性非常有益。 在吡唑核心，发现位置3和5的双取代对于优异的效力/选择性特征至关重要，尤其是对GLUT3。关于苄基环上的取代基，对位比邻位或间位产生了更有前景的化合物。化合物54具有对氰基和额外的环氮，也表现出有趣的GLUT谱。 N-（1H-吡唑-4-基）喹啉-4-甲酰胺的合成很简单，如BAY-876所示（19）。体外PK数据显示，BAY‐876（19）和54在肝微粒体和肝细胞中都非常稳定，尽管54的流出率很高，约为16[1]。

口服 BAY-876（1.5–4.5 mg/kg/天，持续 28 天）的小鼠表现出显着的剂量依赖性致癌性降低 [2]。

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BAY-876抑制卵巢癌症细胞系和卵巢癌症PDXs的致瘤性[2]
GLUT1在调节癌症卵巢细胞糖酵解、能量代谢和凤尾藻依赖性和非依赖性生长中的作用表明，GLUT1是一个有前途的抗癌靶点。由于BAY-876尚未在体内被彻底评估为抗癌剂，我们评估了其在携带SKOV-3皮下（皮下）异种移植物的雌性NOD-cid IL2rgull（NSG）小鼠中的抗肿瘤潜力和安全性。本研究中的所有动物实验均按照VCU IACUC的政策和规定进行。四组肿瘤大小范围相似（~100 mm3）的小鼠口服0、1.5、3.0和4.5 mg/kg/天，持续4周。监测肿瘤生长曲线和体重变化，如图5所示。BAY-876对致瘤性有明显的剂量依赖性抑制作用。在4.5mg/kg/天治疗组中观察到最大效果。治疗2周后，肿瘤明显缩小。在终点，与赋形剂对照组的这些参数相比，最终的平均肿瘤体积和肿瘤重量分别下降了68%和66%。然而，4.5 mg/kg/天的剂量对NSG小鼠有一定的毒性。在治疗的最后一周，小鼠的体重开始下降。在4周结束时，与对照组或其他两个较低剂量组相比，该组的体重减轻平均达到18%。然而，除了体重减轻，这些小鼠没有其他明显的健康状况

我们开发了来自高级别浆液性卵巢癌患者的PDX。这些PDX的H&E染色证实了乳头状腺癌的组织学表现，与原始患者肿瘤组织相似（补充图S2）。我们研究了在表达GLUT1蛋白的两个PDX OVC-PDX2和OVC-PDX3中BAY-876的作用（图6D，H）。携带PDX的雌性NSG小鼠接受4.0mg/kg/天的治疗，该剂量是根据早期SKOV-3异种移植物实验确定的。在30天内用这种剂量的BAY-876治疗显著降低了肿瘤生长，体重没有明显减轻（图6B，F）。在两个PDX中，平均终点肿瘤体积减少了60%以上（图6A，E）。OVC-PDX2和OVC-PDX3的最终肿瘤重量分别降低了50%和71%（图6C，G）。

这些结果表明，当以4.0mg/kg/天或更低的剂量口服时，BAY-876是一种有效且安全的抗癌剂。我们接下来问，在较短的时间内使用更高剂量的急性治疗是否可以获得更好的治疗效果。因此，携带OVC-PDX2的雌性NSG小鼠接受7.5mg/kg/天的治疗，并密切监测肿瘤生长和健康状况。不幸的是，这些小鼠不能耐受这种剂量，在18天的治疗后全部死亡。补充图S3显示了7.5 mg/kg/天的BAY-876对对照组和治疗组的肿瘤生长、体重和Kaplan-Meier生存率的影响。

人GLUT1超高通量筛选（uHTS）：[1]
众所周知，线粒体电子传递链和葡萄糖分解代谢的小分子抑制剂的组合协同抑制ATP的产生。对于uHTS，CHO-K1细胞用人GLUT1和组成型表达萤光素酶稳定转染，如前所述。 将细胞接种在1536个密度为每孔1000个细胞的微量滴定板中，并在1%FCS存在的无葡萄糖DMEM中饥饿24小时。在测量之前，细胞在37°C下在10μm鱼藤酮的存在下孵育30分钟，以完全阻断氧化磷酸化。试验化合物和笼状荧光素同时装载。在应用0.5mm葡萄糖并相应激活GLUT1之前，通过萤光素酶活性间接测量基础ATP，以确定对细胞ATP水平的影响，而与葡萄糖无关；施加500μm葡萄糖后10分钟的萤光素酶动力学记录允许研究化合物诱导的GLUT1抑制。

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GLUT亚型特异性检测：[1]
为了进行GLUT1、GLUT2、GLUT3和GLUT4之间的特异性测试，我们使用了DLD1（用于GLUT1）、DLD1GLUT1-/-（用于GLUT3）、CHO-hGLUT2和CHO-hGRUT4（GLUT2与4）细胞，并结合氧化磷酸化抑制剂（鱼藤酮1μm）。在标准条件下，细胞系在添加了10%FCS、1%青霉素-链霉素溶液和2%谷氨酸的DMEM培养基中维持。用胰蛋白酶处理细胞，并以每孔4000个细胞的密度接种到384个板中。然后将细胞在含有1%FCS的无葡萄糖培养基中培养过夜，以降低细胞内ATP水平。对于GLUT1/2/3，16小时后将细胞与适当的葡萄糖浓度或GLUT2果糖浓度（GLUT1为0.1m，GLUT3为0.3 m，GLUT2为30 mm果糖），含或不含化合物和1μm鱼藤酮，持续15分钟。然后使用CellTiter‐Glo®发光细胞活力测定法测量ATP水平。将测定标准化为对照细胞松弛素B（IC50 GLUT1:0.1μm GLUT2：2.8μm，GLUT3：0.12μm，GLUT4：0.28μm），测定方差：9 %, IC50计算R2>0.9。对于GLUT4，16小时后去除无葡萄糖培养基，将细胞适应无KCl的酪德缓冲液3小时。加入化合物和鱼藤酮，20分钟后将细胞与葡萄糖（终浓度0.1m）孵育15分钟 然后使用Promega的CellTiter‐Glo®发光细胞活力测定法测量ATP水平。

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葡萄糖竞争： [1]
对于葡萄糖竞争，DLD1细胞用胰蛋白酶处理，以每孔4000个细胞的密度接种到384个板中。然后将细胞在含有1%FCS的无葡萄糖培养基中培养过夜，以降低细胞内ATP水平。16小时后，将细胞与不同葡萄糖浓度（分别为0.1；1和10 mm）、化合物（30μm至1 nm）和1μm鱼藤酮一起孵育15分钟。然后使用Promega的CellTiter‐Glo®发光细胞活力测定法测量ATP水平。

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GLUT1敲除[2]
根据制造商的说法，使用Amaxa™Nucleofector™试剂盒V将GLUT1 siRNA（赛默飞世尔科技公司，siRNA ID:s12925）或非靶向对照siRNA转染到SKOV-3或OVCAR-3细胞中。用100 pmol siRNA对100万个细胞进行电穿孔。接种后24小时，转染细胞被喂食新鲜培养基并再孵育72小时，然后进行糖酵解和免疫印迹分析。

细胞增殖测定[2]
细胞类型： SKOV-3 和 OVCAR-3 细胞
测试浓度： 25、50、75 nM
孵育持续时间：24 和 72 小时
实验结果：导致 SKOV-3 和 OVCAR-3 细胞数量呈剂量依赖性减少。

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OCR测量[2]
如前所述，使用Seahorse XF24细胞外通量分析仪测量用或不用BAY-876处理的培养细胞的OCR（pMoles/min）。将卵巢癌症细胞系接种在XF24微孔板中，培养18-20小时，然后切换到补充有10 mM葡萄糖和2 mM谷氨酰胺的海马测定培养基。如前所述，计算了基础线粒体呼吸、ATP连接呼吸、最大呼吸能力和储备能力。

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细胞生长试验[2]
为了评估BAY-876（0、25、50、75 nM）对增殖的影响，在胰蛋白酶处理后，用库尔特计数器对12孔板中的细胞进行计数。为了确定BAY-876的细胞毒性作用，用更宽范围的指定浓度处理细胞3天，然后进行MTT染色并测量570nm处的吸光度。使用SigmaPlot 13.0计算IC50值。 进行锚定非依赖性生长，以评估BAY-876对细胞在半固体软琼脂中生长能力的影响。在完全培养基中用1.5 mL 0.6%软琼脂预涂六孔板。将悬浮在含有0.3%软琼脂的1.5mL生长培养基中的细胞覆盖在预涂孔上。每3-5天将含有0.3%琼脂（1.5 mL）的新鲜完整培养基添加到顶部。3周后计数直径大于100μm（SKOV-3、HEY和A2780）或50μm（OVCAR-3）的菌落。

动物/疾病模型：携带SKOV-3皮下（sc）异种移植瘤的雌性NOD-scid IL2rgnull (NSG)小鼠[2]
剂量：1.5、3、4.5 mg/kg
给药途径：口服；每日一次；持续28天
实验结果：表现出明显的剂量依赖性肿瘤发生抑制作用。

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BAY-876在小鼠体内的抗癌活性分析[2]
利用上述PDX模型和细胞系来源的异种移植瘤来评估BAY-876的抗肿瘤作用。将处于指数生长期的细胞系用胰蛋白酶消化，用PBS洗涤两次，并重悬于无血清培养基中。将 SKOV-3 细胞 (4 × 10⁶) 皮下注射到 6-7 周龄雌性 NSG 小鼠的右侧腹部。使用数字游标卡尺监测并测量皮下肿瘤的形成。肿瘤体积根据公式 lw²/2 计算，其中 l 为肿瘤长度，w 为肿瘤最短宽度。当 PDX 或细胞系来源的肿瘤平均体积达到 100 mm³ 时，将小鼠分为对照组和实验组（每组 5 只小鼠），两组小鼠的肿瘤体积范围相近。小鼠通过灌胃给予指定剂量的 BAY-876 进行治疗。

为了进一步表征，我们首先使用不同物种的肝微粒体和肝细胞，对BAY-876 (19) 和其他候选化合物进行了代谢稳定性测定。此外，我们还对最有前景的化合物进行了Caco-2细胞渗透性测定。从在大鼠肝细胞中具有中等至高代谢清除率的化合物2、3和12（图1和图2）出发，在喹啉环上引入2-羧酰胺基团，在吡唑环上引入CF3基团（如化合物13所示），即可得到在人、犬、小鼠肝微粒体以及犬肝细胞中代谢清除率较低的化合物。然而，大鼠肝细胞的清除率较高，根据充分混合模型，其最大生物利用度仅为平均水平。比较化合物 2、3、12 和 13 的 Caco-2 数据，其渗透性从低（3.5 nm s⁻¹）到高（200 nm s⁻¹）（从顶端到基底外侧）变化，表明 N-(1H-吡唑-4-基)喹啉类化合物的渗透性存在较大差异。[1]
BAY-876 (19) 在所有测试物种中均表现出较低的体外代谢清除率，但猴肝细胞的清除率中等（表 6）。其 Caco-2 渗透性较高，外排比率并不显著。与三唑 33 在小鼠肝微粒体和大鼠肝细胞中的中等稳定性相比，二甲基吡唑 39 在小鼠肝微粒体和大鼠肝细胞中分别表现出 88% 和 75% 的良好生物利用度。其在人肝微粒体中的稳定性略低，为 66%。与化合物 39 相比，相应的异丙基吡唑 43 在人肝微粒体中的清除率高出一倍。这种代谢不稳定性不仅在化合物 43 中观察到，而且在该项目中的其他异丙基吡唑化合物中也观察到。由于这一发现，没有选择任何异丙基吡唑进行更深入的体内研究。[1]
尽管化合物 52 具有亚纳摩尔级的效力，但其代谢不稳定性阻碍了进一步的体内表征。氰基吡啶 54 不仅在 GLUT 检测中显示出良好的效力和选择性，而且在所有测试物种的肝微粒体和肝细胞中均表现出非常好的代谢稳定性。然而，与 BAY-876 (19) 相比，该化合物在 Caco-2 细胞检测中表现出的强外排率似乎是一个主要缺点。吡嗪 57 和嘧啶 58 在大鼠肝细胞中的清除率比 BAY-876 (19) 高两到三倍。 [1]
考虑到 GLUT 抑制、代谢稳定性以及 Caco-2 细胞的性能，我们选择 BAY-876 (19) 作为候选药物，在两种不同动物（表 7）中开展体内药代动力学研究。与体外肝细胞数据高度一致，BAY-876 在大鼠和犬体内也显示出较低的清除率。两种动物的稳态分布容积 (V_ss) 均处于中等水平。由于清除率极低，大鼠的末端半衰期为中等，而犬的末端半衰期较长。正如预期，由于血药清除率低，在给定的剂量和制剂下，口服生物利用度较高。总体而言，BAY-876 的初步数据表明其具有良好的体内药代动力学特征。

[1]. Identification and Optimization of the First Highly Selective GLUT1 Inhibitor BAY-876. ChemMedChem. 2016 Aug 23.

[2]. Ovarian Cancer Relies on Glucose Transporter 1 to Fuel Glycolysis and Growth: Anti-Tumor Activity of BAY-876. Cancers (Basel). 2018 Dec 31;11(1).

尽管人们早已认识到，葡萄糖转运蛋白GLUT1是维持多种肿瘤细胞即使在正常氧气供应条件下也能增加葡萄糖消耗的关键因素之一（即瓦博格效应），但寻找GLUT1选择性小分子抑制剂的研究却寥寥无几。由于GLUT1家族的其他转运蛋白也参与重要的生物学过程，因此这类抑制剂不应影响这些转运蛋白。为了找到具有如此高活性和选择性的小分子，我们对一个包含约300万个化合物的化合物库进行了高通量筛选。结果表明，N-(1H-吡唑-4-基)喹啉-4-甲酰胺类化合物是进一步化合物优化的理想起始点。经过广泛的构效关系研究，我们最终获得了对GLUT2、GLUT3和GLUT4选择性因子均大于100的纳摩尔级抑制剂。最有前景的化合物BAY-876 [N4-[1-(4-氰基苄基)-5-甲基-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-4-基]-7-氟喹诺林-2,4-二甲酰胺]在体外表现出良好的代谢稳定性，在体内具有较高的口服生物利用度。[1]

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从中等活性且代谢不稳定的高通量筛选先导化合物1出发，该化合物在喹啉环的2位带有呋喃基，总共含有四个甲基，我们通过取代呋喃基并去除喹啉环上的两个甲基，迅速提高了其活性和代谢稳定性。利用化合物3的喹啉核心，我们发现未取代的亚甲基是苯基和吡唑环之间最佳的间隔基。成功地将吡唑环上的一个甲基替换为代谢更稳定的CF3基团（12）后，对喹啉核心的进一步构效关系研究表明，2位未取代的酰胺基和7位氟原子（19，BAY-876）对于提高GLUT1的活性和对其他GLUT的选择性非常有利。在吡唑核心，3位和5位的双取代对于获得优异的活性/选择性，尤其是对GLUT3的活性/选择性至关重要。关于苄基环上的取代基，对位取代比邻位或间位取代能产生更有前景的化合物。化合物54具有对位氰基和额外的环氮原子，也表现出有趣的GLUT活性。N-(1H-吡唑-4-基)喹啉-4-甲酰胺的合成非常简单，如BAY-876（19）所示。体外药代动力学数据显示，化合物BAY-876 (19) 和 54 在肝微粒体和肝细胞中均非常稳定，尽管 54 的外排比率约为 16。BAY-876 (19) 的初步体内药代动力学研究表明，其具有良好的口服生物利用度和较长的终末半衰期，使其成为一种优秀的化学探针，可用于进一步评估使用高选择性 GLUT1 抑制剂治疗癌症的假设。[1]

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近年来，对癌症糖酵解表型的认识不断深入，为治疗卵巢癌和其他恶性肿瘤提供了新的策略。然而，由于肿瘤糖酵解机制复杂，以及缺乏选择性强、效力高且安全的糖酵解抑制剂，靶向糖酵解治疗癌症仍然未能取得成功。近期，BAY-876 被鉴定为一种新型葡萄糖转运蛋白 1 (GLUT1) 抑制剂。GLUT1 是一种常见的 GLUT 亚型，在卵巢癌中普遍过表达，但其功能尚不明确。值得注意的是，自发现以来，BAY-876 尚未在任何细胞或临床前动物模型中进行评估。本文利用 BAY-876 和分子生物学方法，研究了 GLUT1 的调控、靶向性及其与癌症糖酵解的功能相关性。我们使用卵巢癌细胞系和患者来源的异种移植 (PDX) 模型评估了 BAY-876 的抗肿瘤活性。结果表明，抑制 GLUT1 足以阻断基础和应激调节的糖酵解，以及卵巢癌细胞的锚定依赖性和非锚定依赖性生长。BAY-876 显著抑制了细胞系来源的异种移植瘤和 PDX 的致瘤性。这些研究提供了直接证据，表明GLUT1与卵巢癌的糖酵解表型存在因果关系。BAY-876是一种强效的GLUT1活性、糖酵解代谢和卵巢癌生长抑制剂，有望成为一种新型的靶向糖酵解的抗癌药物。
总之，我们的研究结果提供了直接证据，表明GLUT1与卵巢癌的糖酵解表型存在因果关系。使用新开发的候选抑制剂BAY-876选择性靶向GLUT1足以抑制糖酵解代谢以及卵巢癌的体外和体内生长。因此，BAY-876是一种理想的靶向糖酵解的抗癌药物。[2]

C24H16F4N6O2

496.4165

496.127

C, 58.07; H, 3.25; F, 15.31; N, 16.93; O, 6.45

1799753-84-6

1799753-84-6(BAY-876)

118191391

White to off-white solid powder

1.5±0.1 g/cm3

632.3±55.0 °C at 760 mmHg

336.2±31.5 °C

0.0±1.9 mmHg at 25°C

1.649

3.89

127

2

9

5

36

870

0

FC(C1C(=C(C)N(CC2C=CC(C#N)=CC=2)N=1)NC(C1=CC(C(N)=O)=NC2C=C(C=CC1=2)F)=O)(F)F

BKLJDIJJOOQUFG-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C24H16F4N6O2/c1-12-20(21(24(26,27)28)33-34(12)11-14-4-2-13(10-29)3-5-14)32-23(36)17-9-19(22(30)35)31-18-8-15(25)6-7-16(17)18/h2-9H,11H2,1H3,(H2,30,35)(H,32,36)

4-N-[1-[(4-cyanophenyl)methyl]-5-methyl-3-(trifluoromethyl)pyrazol-4-yl]-7-fluoroquinoline-2,4-dicarboxamide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.04 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入900 μL 玉米油中，混合均匀。

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配方 2 中的溶解度: 5 mg/mL (10.07 mM) in 50% PEG300 50% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。