BAY885

ERK5 (IC50 = 35 nM)

BAY-885 在 SN12C-MEF2 报告细胞系中显示出强烈的 ERK5 激酶和转录抑制作用 (IC50 = 115 nM/IC90 = 691 nM)，但对 SN12C-CMV-luc 报告细胞对照细胞系没有影响 (IC50 > 30 M)，排除作为一般转录或翻译抑制剂的潜在影响。[1]

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最佳残基和性质的结合导致了41（BAY-885）的鉴定：一种有效且选择性的体外ERK5探针分子（图4）。方案2中概述了41的合成。4,7-二氯吡啶并[3,2-d]嘧啶43通过Suzuki反应转化为44，随后进行Buchwald胺化，得到45。Boc保护基团的裂解，然后双键的氢化和酰胺的形成产生41（BAY-885）。作为药理学实验的对照化合物，我们还提供了阴性ERK5探针42（BAY-693，表6）。
此外，化合物41/BAY-885在1μM浓度下对商业欧陆激酶组中的358种激酶进行了测试，其中只有Fer（r）、EphB3（h）和EphA5（h）激酶分别被抑制了62%、58%和43%。对于其他激酶，抑制率≤20%，从而证明化合物41（BAY-885）是一种高度选择性的ERK5抑制剂（表S2）。与XMD8-92相反，化合物41在20μM内没有与BRD4结合。

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ERK5探针41（BAY-885）在SN12C-MEF2报告细胞系中显示出强烈的ERK5激酶和转录抑制作用（IC50=115 nM/IC90=691 nM），对具有组成型萤光素酶表达的报告对照细胞系没有影响（SN12C CMV-luc，IC50>30μM），从而排除了作为转录或翻译的一般抑制剂的潜在影响。为了进一步探讨ERK5作为肿瘤学治疗靶点的潜力，我们测试了化合物41（BAY-885）对具有ERK5基因组扩增（SN12C、SNU-449、MFM-223）或具有组成型活性ERK5信号传导（BT-474、SK-BR-3）的细胞增殖的影响。重要的是，尽管化合物41（BAY-885）的效力很高，但它未能抑制所有这些细胞系的增殖。这些结果与文献数据形成鲜明对比，文献数据表明ERK5是ERK5信号失调的肿瘤的致癌驱动因素。一种可能的解释在于所使用的不同方法，上述研究采用RNAi技术沉默ERK5蛋白，而我们的结果基于小分子对ERK5激酶的抑制。

生化ERK5抑制试验[1]
N-末端谷胱甘肽-S-转移酶（GST）和人ERK5片段（登录号NP_002740.2的氨基酸1-398）的重组融合蛋白在大肠杆菌中表达，通过谷胱甘肽琼脂糖亲和层析纯化，随后用His标记的MAP2K5激活，用作激酶。作为激酶反应的底物，使用生物素化肽生物素Ahx PPGDYSTTPGTLFSTTPGGTRI（酰胺形式的C末端）。 对于该测定，将50 nL 100倍浓度的受试化合物DMSO溶液移入黑色低容量384孔微量滴定板或黑色1536孔微量滴定板中，加入2μL ERK5水性测定缓冲液溶液[50 mM Hepes pH 7.0，15 mM MgCl2，1 mM二硫苏糖醇，0.5 mM EGTA，0.05%（w/v）牛γ-球蛋白，混合物在22°C下孵育15分钟，以便在激酶反应开始前将受试化合物预结合到酶上。然后通过加入3μL三磷酸腺苷（ATP，417μM→ 最后的conc。在5μL的测定体积为250μM）和底物（1.67μM→ 最终浓度。在5μL的测定体积为1μM）的测定缓冲液中，将所得混合物在22°C下孵育60分钟。ERK5的浓度根据酶批的活性进行调节，并选择合适的浓度使测定在线性范围内，典型浓度为0.5μg/mL。通过加入3μL TR-FRET检测试剂溶液（0.33μM链霉抗生物素-XL665和1.67 nM抗4E-BP1（pT46）抗体和1.67 nM LANCE EU-W1024标记的抗抗体IgG，溶于EDTA水溶液（83.3 mM EDTA，0.2%（w/v）牛血清白蛋白溶于50 mM HEPES，pH 7.5）来停止反应。将所得混合物在22°C下孵育1小时，以使磷酸化生物素化肽与检测试剂形成复合物。随后，通过测量从Eu螯合物到链霉抗生物素XL的共振能量转移来评估磷酸化底物的量。因此，在TR-FRET阅读器（例如Pherastar FS或Viewlux）中测量了350nm激发后620和665nm处的荧光发射。将665nm和622nm处的发射比作为磷酸化底物量的度量。数据已标准化（无抑制剂的酶反应=0%抑制；除酶外的所有其他测定成分=100%抑制）。通常，在同一微量滴定板上以20μM至0.07 nM范围内的11种不同浓度对受试化合物进行测试（20μM、5.7μM、1.6μM、0.47μM、0.13μM，38 nM、11 nM、3.1 nM、0.9 nM、0.25 nM和0.07 nM，在测定前通过连续稀释在DMSO中的100倍浓缩溶液水平上单独制备的稀释系列；确切浓度可能因使用的移液器而异），每种浓度的重复值，IC50值使用Genedata Screener软件计算。

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生化BRD4 BD1和BD2结合抑制试验[1]
为了测试抑制剂对含溴链4（BRD4）的溴结构域BD 1和2的亲和力，使用了一种基于TR-FRET的生化测定法，与之前所述的方法类似。在该测定中，通过N-末端His6标记的人BRD4 BD1或BD2与源自人组蛋白4的合成四乙酰化肽结合产生荧光信号。BD1（氨基酸44-168）和BD2（氨基酸333-460）蛋白在大肠杆菌中表达，通过亲和层析/IMAC和尺寸排阻色谱纯化。乙酰化、生物素化肽（BD1相互作用肽：SGRGK（Ac）GGK（Ac）GLGK（Ac）GGAK（Ac）RHGSGSK Btn；用于BD2相互作用的肽：SGRGK（Ac）GGK（Ac）GLGK（Ac）GGAK（Ac）RHRKVLRDNGSGSK Btn）。抑制剂与BRD4结合的程度，即生物素化肽的置换，通过信号降低的程度进行监测。实验在384孔黑色小体积微量滴定板上进行，其中预先分配了50nL的受试化合物（见下文最终浓度）在DMSO中的100倍浓缩溶液。将BRD4 BD1（测定中的最终浓度为10 nM）加入到由50 mM HEPES（pH 7.5）、50 mM NaCl、0.25 mM CHAPS和0.05%牛血清白蛋白组成的2μL测定缓冲液中。在室温下预孵育10分钟后，将含有BD1相互作用生物素化肽（最终浓度50 nM）、抗6His-XL665（最终浓度10 nM）、链霉抗生物素蛋白Eu3+螯合物和氟化钾（KF；最终浓度50 mM）的3μL检测溶液加入到平板中。在4°C下孵育3小时后，使用均匀时间分辨荧光（HTRF）模块（激发，337 nm；发射，620和665 nm）在PheraStar阅读器中测量平板。类似地进行BRD4 BD2（测定中的最终浓度为100 nM）测定，除了以下修改：条件测定缓冲液（50 mM HEPES（pH 7.5）、100 mM NaCl、0.25 mM CHAPS和0.05%BSA）和检测溶液（3μL，含有BD2相互作用的生物素化肽（测定中最终浓度为50 nM）、抗6His-XL665（最终浓度为50nM），链霉抗生物素蛋白Eu3+螯合物（最终浓度8.6 nM）和KF（测定缓冲液中最终浓度50 mM））。计算665和620nm处的发射率，并将其归一化为中性（DMSO代替试验化合物=0%结合抑制）和抑制剂对照（除BRD4 BD1/BD2外的所有测定成分=100%结合抑制）。在20μM至0.07 nM（20μM、5.7μM、1.6μM、0.47μM、0.13μM，38 nM、11 nM、3.1 nM、0.9 nM、0.25 nM和0.07 nM）的范围内，对每种浓度的化合物进行了11种不同浓度的测试，并使用Genedata Screener软件计算IC50值。

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Erk5复合体中1和35的X射线结构[1]
如前所述生产蛋白质，并在50 mM HEPES pH 6.5、150 mM NaCl、10%甘油和2 mM DTT中浓缩至12 mg/mL。 在结晶之前，向蛋白质溶液中补充化合物1或化合物35（终浓度为1mM），并在冰上孵育3小时。然后通过离心（5分钟 000g、 277 K）。使用悬滴法通过混合0.75μL蛋白质和0.5μL储液来生长复杂晶体（化合物1:11%PEG 4000、100mM MgCl2、160mM甲酸钠、100mM MES、pH 6.75和100mM Tris，pH 8.5；化合物35:15%PEG 4000、100mm MgCl2、180mM甲酸钠，100mM MES，pH 6.5和100mM Tris，pH 8.5）。收获晶体并通过短暂浸入由补充有30%甘油的母液组成的低温保护溶液中进行低温保护，然后在液氮中快速冷冻。数据是在瑞士Villigen SLS的同步加速器设施的低温条件下收集的。使用PDB 4IC8作为搜索模型，通过分子置换求解结构。该结构在CCP4套件中使用REFMAC5进行了改进。（24）表S3给出了最终模式的统计数据。

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人肝微粒体的体外代谢稳定性[1]
通过在pH 7.4的100 mM磷酸盐缓冲液（NaH2PO4·H2O+Na2HPO4·2H2O）中以1μM的浓度在肝微粒体悬浮液中孵育试验化合物，并在37°C下以0.5 mg/mL的蛋白质浓度孵育，测定试验化合物的体外代谢稳定性。通过在pH 7.4的磷酸盐缓冲液中加入含有8 mM Glukose-6-磷酸盐、4 mM MgCl2、0.5 mM NADP和1 IU/mL G-6-P脱氢酶的辅因子混合物来激活微粒体。随后不久，通过将试验化合物以1 mL的最终体积加入培养液中，开始代谢测定。培养液中的有机溶剂限制为≤0.01%二甲亚砜（DMSO）和≤1%乙腈。在孵育过程中，微粒体悬浮液以580 rpm的速度连续摇动，并在2、8、16、30、45和60分钟时取等分试样，立即向其中加入等体积的冷甲醇。将样品在-20°C下冷冻过夜，随后在3000 rpm下离心15分钟，用安捷伦1200 HPLC系统分析上清液，并进行LC-MS/MS检测。根据浓度-时间图确定试验化合物的半衰期。从半衰期开始，使用“充分搅拌”的肝脏模型以及其他参数肝脏血流量、比肝脏重量和微粒体蛋白质含量计算内在清除率、肝脏体内血液清除率（CL）和最大口服生物利用度（Fmax）。使用以下参数值：肝血流量1.32 L/h/kg，比肝重21 g/kg，微粒体蛋白含量40 mg/g。

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抑制CYP450代谢[1]
通过应用个体CYP亚型选择性标准探针（CYP1A2非那西丁、CYP2C8阿莫地喹、CYP2C9双氯芬酸、CYP2D6右美沙芬、CYP3A4咪达唑仑），在人肝微粒体中测定受试化合物对细胞色素P450依赖性代谢途径的抑制效力。参考抑制剂作为阳性对照。在代谢物形成的线性方面优化了培养条件（蛋白质和底物浓度、培养时间）。使用Genesis工作站在37°C下在96孔板中处理分析。蛋白质沉淀后，通过LC-MS/MS分析对代谢物形成进行定量，然后进行抑制评估和IC50计算。

在第 1 天，以 20 μL 培养基中每孔 10,000 个细胞的密度将细胞接种到 384 孔白板中。第 2 天，使用 HP D300 数字分配器分配测试化合物，包括 BAY-885 ，然后在 37°C 下孵育 16 小时。

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Caco2渗透性测定[1]
细胞培养：将Caco-2细胞以每孔2.5×105个细胞的密度接种在24孔插入板上，孔径0.4μm，0.3 cm2，并在添加了10%胎牛血清（FCS）、1%GlutaMAX（100×，GIBCO）、100 U/mL青霉素、100μg/mL链霉素和1%非必需氨基酸（100×）的DMEM培养基中生长13-15天。细胞在37°C的5%CO2大气压下保持湿润。每2-3天更换一次培养基。双向转运分析中Caco-2渗透性的评估：使用机器人系统（帝肯）在24孔插入板中进行双向转运分析。在进行双向转运试验之前，用转运培养基（不含FCS的HEPES碳酸盐转运缓冲液，pH 7.2）代替培养基。为了评估单层完整性，测量了跨上皮电阻（TEER）。仅使用TEER至少为400Ωcm2的单层。将试验化合物预先溶解在DMSO中，并以2μM的终浓度加入顶端或基底外侧室。评估一式三份。在37°C下孵育2小时前后，从两个隔室中取样，用甲醇沉淀后通过LC-MS/MS进行分析。计算顶端至基底外侧（A）的表观渗透系数（Papp）→ B） 基底外侧至心尖（B→ A） 使用以下方程式确定方向：Papp=（Vr/P0）（1/S）（P2/t），其中Vr是接收器室中培养基的体积，P0是t=0时供体室中测试药物的测量峰面积，S是单层的表面积，P2是孵育2小时后受体室中测试药物的测量峰区域，t是孵育时间。通过将Papp（B-A）除以Papp（A-B）计算基底外侧（B）与顶端（A）的流出比。

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细胞萤光素酶报告物测定[1]
SN12C-MEF2-luc报告细胞系是通过用萤火虫荧光素酶基因上游的MEF2反应性转录元件稳定转导SN12C细胞而产生的，并用于测定ERK5抑制剂的细胞活性。同时，已经产生了SN12C CMV-luc报告细胞系，该细胞系重组携带CMV启动子驱动的萤火虫荧光素酶基因，从而组成型表达荧光素酶。后者用于检测SN12C-MEF2-luc报告检测的假阳性结果，这些假阳性结果要么是有毒化合物，要么是转录或翻译机制的一般抑制剂，要么是萤光素酶活性的抑制剂。Tuebingen大学NMI进行了单克隆报告细胞系的多克隆和筛选。这些细胞系在不含酚红的RPMI 1640培养基中生长，该培养基补充了10%FCS和谷氨酸。此外，对于SN12C CMV-luc，培养基中还存在0.4μg/μL的Blasticidin。所有细胞均在37°C、5%CO2的加湿环境中生长。在第1天，将细胞以每孔10000个细胞的密度接种在20μL培养基中的384孔白色平板上。在第2天，使用HP D300数字分配器以连续稀释的方式加入受试化合物，并在37°C下孵育16小时。在第3天，向每个孔中加入EGF（终浓度=100 ng/mL），并将平板在37°C下再孵育2小时。然后，向每个孔中加入25μL的ONE Glo，并在室温下孵育平板5分钟（摇动）。在PHERAStar上读取发光信号。 IC50是使用DRC主电子表格计算的。用EGF和DMSO处理的细胞获得的值被定义为最大对照，而用EGF和10μM XMD8-92（SN12C-MEF2-luc）或1μM Staurosporine（SN12C CMV-luc）处理的细胞的值被确定为最小对照（即最大抑制）。

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大鼠肝细胞体外代谢稳定性[1]
通过两步灌注法分离Han/Wistar大鼠的肝细胞。灌注后，小心地从大鼠体内取出肝脏：打开肝包膜，将肝细胞轻轻摇晃到装有冰冷的威廉姆斯培养基E（WME）的培养皿中。将所得细胞悬浮液在50毫升猎鹰管中通过无菌凝视过滤，并在室温下以50克离心3分钟。将细胞沉淀重新悬浮在30mL WME中，并通过100g的Percoll梯度离心两次。再次用WME洗涤肝细胞，并将其重新悬浮在含有5%FCS的培养基中。通过台盼蓝排斥法测定细胞存活率。对于代谢稳定性测定，将肝细胞以1.0×106个活细胞/mL的密度分布在含有5%FCS的WME中的玻璃瓶中。将试验化合物添加至1μM的终浓度。在孵育过程中，以580rpm连续摇动肝细胞悬浮液，并在2、8、16、30、45和90分钟时取等分试样，立即向其中加入等体积的冷甲醇。将样品在-20°C下冷冻过夜，随后在3000 rpm下离心15分钟，用安捷伦1200 HPLC系统分析上清液，并进行LC-MS/MS检测。根据浓度-时间图确定试验化合物的半衰期。从半衰期开始，使用“充分搅拌”的肝脏模型以及肝脏血流、比肝脏重量和体内外肝细胞数量的其他参数计算内在清除率、肝脏体内血液清除率（CL）和最大口服生物利用度（Fmax）。使用以下参数值：肝血流量4.2 L/h/kg，比肝重32 g/kg，体内肝细胞1.1×108个细胞/g肝，体外肝细胞1.0×106/mL。

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自动化hERG K+电流电压钳检测[1]
hERG K+电流测定基于KCNH2（hERG）基因稳定表达的重组HEK293细胞系。使用加湿培养箱（37°C，5%CO2）和标准培养基（含Earle盐和l-谷氨酰胺的MEM，10%非活化胎牛血清，0.1 mmol/l非必需氨基酸，1 mmol/l丙酮酸钠，青霉素/链霉素（各50μg/mL），0.4 mg/mL Geneticin）培养细胞。细胞分离后约0.5-8小时，在带有PatchControlHT软件（Nanion）的自动化8通道系统中，通过“全细胞电压钳”技术对细胞进行研究，以控制Patchliner系统并处理数据采集和分析。电压钳位控制由两个EPC 10四路放大器在PatchMasterPro软件的控制下提供，并在室温（22-24°C）下使用NPC-16中电阻（约2 MΩ）芯片作为平面基板。NPC-16芯片填充有细胞内和细胞外溶液（细胞内溶液（mmol/L）：NaCl 10、KCl 50、KF 60、EGTA 20、HEPES 10，pH 7.2（KOH）；细胞外溶液（单位为mmol/L）：NaCl 140、KCl 4、CaCl2 2、MgCl2 1、葡萄糖5、HEPES 10、pH 7.4（NaOH））和细胞悬浮液。在形成GΩ密封并进入全细胞模式（包括几个自动质量控制步骤）后，细胞膜被夹紧到保持电位（-80 mV）。在激活钳位步骤（+20 mV，1000 ms）后，仅通过+20 mV至-120 mV的超极化电压步骤（持续500 ms）引发hERG介导的内向尾电流；该钳夹方案每12秒重复一次。（27）在初始稳定阶段（5-6分钟）后，以单一浓度（10μmol/L）或递增浓度（0.1、1和10μmol/L；每种浓度5-6 min）加入测试化合物，然后进行几个洗脱步骤。通过分析hERG介导的内向尾电流的幅度（以药物前对照的百分比表示）作为测试化合物浓度的函数来量化测试化合物的效果。平均浓度-反应数据采用标准的S型4参数逻辑方程进行拟合，其形式为：Y=底部+（顶部-底部）/（1+exp（对数IC50-X）×斜率），其中Y是当前抑制（以药物前对照的百分比表示），X是药物浓度的对数，IC50是产生半最大电流抑制的药物浓度，并使用以下约束：顶部=100%，底部=0%。在明显缺乏浓度依赖性电流抑制和/或效应大小太小（约≤20%）的情况下，没有进行曲线拟合。

化合物 41 (BAY-885) 具有良好的理化性质，例如高溶解度和适中的亲脂性（以 LogD 值衡量，见图 4）。化合物 41 在 Caco 细胞渗透性测定中表现出高渗透性，且在浓度高达 20 μM 时未显示对 CYP 酶活性的抑制作用。其在大鼠肝细胞和人肝微粒体中的代谢稳定性分别为低至中等。化合物 41 在不同的 pH 值下均具有良好的化学稳定性。[1]

BAY-885在浓度高达10 μM时未表现出对hERG的抑制作用。[1]

[1]. Discovery and Characterization of the Potent and Highly Selective (Piperidin-4-yl)pyrido[3,2- d]pyrimidine Based in Vitro Probe BAY-885 for the Kinase ERK5. J Med Chem. 2019 Jan 24;62(2):928-940.

能够以浓度和时间依赖的方式研究蛋白质特定结构域作用的化学探针具有重要价值。本文报道了通过高通量筛选和后续基于结构的优化，鉴定出一种高效且选择性极高的ERK5抑制剂BAY-885。ERK5是细胞信号转导的关键整合因子，已被证实参与多种细胞过程，例如增殖、分化、凋亡和细胞存活。我们发现，使用小分子抑制ERK5激酶活性和转录活性并未转化为在不同的细胞模型中观察到的抗增殖活性，这与RNAi技术的结果相反。[1]

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我们的结果与Lin等人的研究结果一致，表明ERK5激酶活性对于癌细胞生长并非必需，因此，ERK5激酶作为抗癌药物研发靶点的可行性值得商榷。高效且选择性强的化学探针，例如最近被SGC接收的捐赠化学探针化合物41（BAY-885），将极大地促进我们对ERK5信号通路在癌症中生物学机制的进一步理解。ERK5激酶活性的抑制是否能被其他通路补偿，仍需未来的研究来证实，例如，如Cox等人建议的，将ERK1/ERK2抑制剂与ERK5抑制剂联合使用。ERK5激酶小分子抑制剂疗效不佳，这与ERK5基因敲除或缺失的抗增殖作用形成鲜明对比，由此引发了ERK5是否也能作为支架蛋白的问题。在这种情况下，采用PROTAC策略降解整个ERK5蛋白，将是挖掘ERK5治疗潜力的合适方法。[1]

C25H28F3N7O2

515.5

515.23

C, 58.24; H, 5.47; F, 11.06; N, 19.02; O, 6.21

2307249-33-6

2307249-33-6

134128280

White to light yellow solid powder

3.3

101

1

11

4

37

774

0

FC(OC1C=CC(=C(C=1)N)C(N1CCC(C2C3C(=CC(=CN=3)N3CCN(C)CC3)N=CN=2)CC1)=O)(F)F

QXURFIGBRGWPQD-UHFFFAOYSA-N

hI=1S/C25H28F3N7O2/c1-33-8-10-34(11-9-33)17-12-21-23(30-14-17)22(32-15-31-21)16-4-6-35(7-5-16)24(36)19-3-2-18(13-20(19)29)37-25(26,27)28/h2-3,12-16H,4-11,29H2,1H3

[2-amino-4-(trifluoromethoxy)phenyl]-[4-[7-(4-methylpiperazin-1-yl)pyrido[3,2-d]pyrimidin-4-yl]piperidin-1-yl]methanone

BAY 885; BAY885; [2-amino-4-(trifluoromethoxy)phenyl]-[4-[7-(4-methylpiperazin-1-yl)pyrido[3,2-d]pyrimidin-4-yl]piperidin-1-yl]methanone; compound 41 [PMID: 30563338]; compound 41 (PMID: 30563338); (2-amino-4-(trifluoromethoxy)phenyl)-(4-(7-(4-methylpiperazin-1-yl)pyrido(3,2-d)pyrimidin-4-yl)piperidin-1-yl)methanone; 2307249-33-6; CHEMBL4445670; BAY-885

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中（例如氮气保护），避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: 16.67~30 mg/mL (32.3~58.2 mM)
Ethanol: ~8 mg/mL (~15.5 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.85 mM) (饱和度未知) in 5% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 50% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.85 mM) (饱和度未知) in 5% DMSO + 95% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 1.67 mg/mL (3.24 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 16.7 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 4 中的溶解度: ≥ 1.67 mg/mL (3.24 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100μL 16.7mg/mL澄清的DMSO储备液加入到900μL 20％SBE-β-CD生理盐水中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 5 中的溶解度: 0.5 mg/mL (0.97 mM) in 1% DMSO 99% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。