beta-Naphthoflavone   中文名称: β-萘基黄酮

细胞活力保护：在暴露于 20 μM H₂O₂ 24 小时（氧化应激模型）的人类神经元 SH-SY5Y 细胞中，用 β-萘黄酮（测试浓度范围为 0-20 μM）处理 24 小时后，H₂O₂ 抑制的细胞活力显著逆转，且呈剂量依赖性。10 μM 时效果最佳，更高浓度时效果略有下降。在 10 μM 时，β-萘黄酮显著提高了细胞活力，与仅用 H₂O₂ 处理的细胞相比（p < 0.05）。[2]
细胞凋亡抑制：H₂O₂ 处理使 SH-SY5Y 细胞的凋亡率增加至 24.1%（约 5 倍）。与仅用H₂O₂处理的细胞相比，用10 μM β-萘黄酮进行后处理显著降低了细胞凋亡率（p < 0.05）。α-萘黄酮（20 μM）和β-萘黄酮（10 μM）联合处理可将细胞凋亡率降低至7.2%（与仅用H₂O₂处理组相比，p < 0.01）。[2]
总抗氧化能力：H₂O₂处理显著降低了SH-SY5Y细胞的总抗氧化能力（TAC）（p < 0.01）。用10 μM β-萘黄酮进行后处理可显著逆转这种降低（与仅用H₂O₂处理组相比，p < 0.05）。α-萘黄酮和β-萘黄酮联合处理的效果最为显著。 [2]
丙二醛水平：H₂O₂处理使MDA水平升高至对照组（13.24 μmol/mg蛋白）的约2.5倍。10 μM β-萘黄酮后处理显著降低MDA水平至9.01 μmol/mg蛋白（与仅H₂O₂处理组相比，p < 0.05）。联合处理使MDA水平进一步降低至6.74 μmol/mg蛋白。[2]
抗氧化酶活性：与对照组相比，H₂O₂使过氧化氢酶活性降低82%，超氧化物歧化酶（SOD）活性降低79%，谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性降低63%。与仅H₂O₂处理的细胞相比，10 μM β-萘黄酮显著提高了CAT和SOD酶活性（p < 0.05）。单独使用β-萘黄酮不能显著恢复GPx活性，但与α-和β-萘黄酮联合处理可有效逆转GPx活性。 [2] p38 MAPK 磷酸化：H₂O₂ 使 p38 MAPK 在 Thr180 和 Tyr182 位点的磷酸化水平升高 2.2 倍（与对照组相比，p < 0.05）。10 μM β-萘黄酮后处理显著抑制了这种磷酸化（与仅 H₂O₂ 处理组相比，p < 0.05）。Thr322 位点的磷酸化水平未受影响。[2] 凋亡相关蛋白表达：H₂O₂ 显著增加了 Bax 的表达（p < 0.01）、细胞色素 c 的释放（p < 0.01）以及切割型 caspase-3 与未切割型 caspase-3 的比值（p < 0.01）。 β-萘黄酮处理显著降低了这些凋亡标志物（与仅使用H₂O₂组相比，p < 0.05），且β-萘黄酮比α-萘黄酮更有效，尤其是在抑制细胞色素c表达方面。[2]
与α-萘黄酮的比较：在包括细胞活力恢复、凋亡减少、过氧化氢酶活性上调和细胞色素c释放抑制在内的多个参数中，β-萘黄酮对H₂O₂诱导的神经元损伤的保护作用优于α-萘黄酮。[2]
与α-萘黄酮的协同作用：在多项实验中，α-萘黄酮（20 μM）和β-萘黄酮（10 μM）联合处理的效果比单独使用任何一种化合物都更显著，表明二者具有协同神经保护作用。 [2]
无毒性：在本研究使用的浓度范围内（最高达 20 μM），未观察到 β-萘黄酮的有害作用。[2]

预防马兜铃酸I诱导的急性肾损伤：雄性C57BL/6小鼠在给予马兜铃酸I（AAI，10 mg/kg，腹腔注射）前，预先给予BNF（80 mg/kg，腹腔注射，连续3天），与仅接受AAI治疗的小鼠相比，肾损伤显著减轻。BNF预处理可防止AAI给药后第7天血尿素氮和血清肌酐的升高（与AAI组相比，p < 0.01），其水平与对照组相当。[3]
组织病理学保护：肾脏组织学（H&E染色）显示，BNF预处理显著减少了AAI诱导的肾小管坏死、肾小管扩张、颗粒管型和透明管型以及间质纤维化，这些现象在AAI给药后第3、7和14天均有明显改善。 [3]
抑制细胞凋亡：TUNEL 检测显示，BNF 预处理显著抑制了 AAI 诱导的肾小管上皮细胞凋亡（与第 3 天的 AAI 组相比，p < 0.01）。[3]
预防纤维化：α-SMA（肌成纤维细胞标志物）免疫组化显示，BNF 预处理可预防 AAI 诱导的第 7 天肾小管间质纤维化（与 AAI 组相比，p < 0.01）。[3]
AAI 的药代动力学：BNF 预处理显著降低了小鼠体内 AAI 的暴露水平。单次腹腔注射 10 mg/kg AAI 后的药代动力学参数：Cmax 从 8.73 ± 1.57 μg/mL 降至 3.08 ± 0.61 μg/mL（p < 0.01）。 tmax 从 16.00 ± 5.48 分钟降至 6.25 ± 2.50 分钟 (p < 0.05)；AUC 从 418.37 ± 126.09 分钟·μg/mL 降至 149.84 ± 20.30 分钟·μg/mL (p < 0.05)；t1/2 无变化（27.55 ± 3.37 分钟 vs. 31.46 ± 8.80 分钟，差异无统计学意义）。BNF 预处理小鼠血清中 AAIA（主要代谢物）水平较高。[3]
AAI 及其代谢物的组织分布：注射 AAI 后 30 分钟，BNF 预处理导致肝脏和肾脏中 AAI 水平降低 3 倍 (p < 0.01)。BNF 预处理对 AAIA 水平无显著影响。 BNF预处理后，肝脏和肾脏中的ALI（阿司匹林I）水平均降低（肝脏p < 0.05，肾脏p < 0.01）。[3]
CYP1A诱导（mRNA）：实时RT-PCR结果显示，BNF处理（80 mg/kg/天，连续3天）后，肝脏中CYP1A1 mRNA水平升高约4倍（p < 0.01），CYP1A2 mRNA水平升高约16倍（p < 0.01），CPR mRNA水平升高约3倍（p < 0.05）。肾脏中，仅CYP1A1 mRNA水平升高约2倍（p < 0.05）；CYP1A2和CPR mRNA水平未见显著变化。[3]
CYP1A诱导（蛋白）：Western blot分析证实，BNF处理显著上调了肝微粒体中CYP1A1、CYP1A2和CPR蛋白的表达水平。在肾微粒体中，仅CYP1A1蛋白被诱导表达；CYP1A2和CPR蛋白水平未发生显著变化。[3]

过氧化氢酶活性测定：将细胞匀浆置于含有 250 mM H₂O₂ 的比色皿中，反应 1-5 分钟。剩余的 H₂O₂ 与显色底物偶联，生成在 520 nm 处具有最大吸收的红色产物（N-4-安替比利基-3-氯-5-磺酸-对苯醌单亚胺）。通过计算与酶反应的 H₂O₂ 量来确定 CAT 活性。[2] 超氧化物歧化酶活性测定：样品中的 SOD 抑制 WST-8 转化为水溶性甲臜。通过测量 450 nm 处的吸光度来评估这种抑制作用，从而确定 SOD 活性。 [2]
谷胱甘肽过氧化物酶活性测定：GPx活性测定基于偶联反应中NADPH的消耗，该反应中还原型谷胱甘肽被GPx转化为氧化型谷胱甘肽，然后又被谷胱甘肽还原酶还原回还原型谷胱甘肽。340 nm处NADPH吸光度的降低可间接反映GPx活性。[2]

细胞培养：人神经元SH-SY5Y细胞培养于含10%胎牛血清（FBS）和100 U/mL链霉素/青霉素的DMEM培养基中，置于37℃、5% CO₂培养箱中培养。[2]
细胞活力检测（CCK-8）：将SH-SY5Y细胞以1 × 10⁴个细胞/孔的密度接种于96孔板中，并在37℃、无血清DMEM培养基中培养48小时。为建立氧化应激模型，将细胞暴露于不同浓度的H₂O₂（0-320 μM）中24小时。在另一组实验中，将细胞暴露于20 μM H₂O₂中24小时，随后分别用β-萘黄酮（0-20 μM）、α-萘黄酮（20 μM）或二者联合处理24小时。在 p38 MAPK 抑制研究中，细胞用 0.5 μM SB203580 处理 24 小时。向每个孔中加入 10 μL CCK-8 溶液，在 37°C 下孵育 5-8 小时，并在 450 nm 处测量光密度值。[2]
细胞凋亡率分析（流式细胞术）：将 SH-SY5Y 细胞（~2 × 10⁵）用 5 μL Annexin V-FITC 和 5 μL 碘化丙啶在室温下避光染色 15 分钟。使用 FACSCalibur 流式细胞仪和 ModFit LT 软件分析细胞凋亡。[2]
总抗氧化能力测定：用 RIPA 缓冲液裂解细胞。使用 ABTS 法测定 TAC。将 ABTS 与 H₂O₂ 和高铁肌红蛋白孵育以生成 ABTS•⁺ 自由基阳离子。样品中的抗氧化剂与显色反应呈比例抑制。以Trolox为标准。结果以μmol Trolox当量/mg蛋白表示。[2]
丙二醛测定：取2 mL细胞上清液与2 mL 0.6%硫代巴比妥酸混合，沸水浴15分钟，冰浴冷却，于532 nm处测定光密度值。结果以nmol MDA/mg蛋白表示。[2]
蛋白质印迹分析：用含磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液裂解细胞。采用BCA法测定蛋白浓度。将约 20 μg 蛋白质通过 10% SDS-PAGE 电泳分离，转移至 PVDF 膜上，用 5% 脱脂牛奶封闭，然后用针对 p38 MAPK、磷酸化 p38 (Thr180+Tyr182)、磷酸化 p38 (Thr322)、细胞色素 c、Bax、caspase-3 和 GAPDH 的一抗进行孵育。膜与 HRP 标记的二抗孵育后，扫描光密度值进行定量分析。[2]

动物：**雄性C57BL/6小鼠（6周龄，18-22 g）购自上海实验动物中心。所有动物实验均经上海市动物伦理委员会批准[证书编号：SCXK（上海）2002-0010]。[3]
* **处理组：**小鼠分为三组（每组n=15）：（1）AAI组：连续3天腹腔注射玉米油（CO），末次注射CO后24小时，单次腹腔注射10 mg/kg AAI（溶于生理盐水）；（2）BNF+AAI组：连续3天腹腔注射80 mg/kg BNF（溶于CO），末次注射BNF后24小时，单次腹腔注射10 mg/kg AAI；（3）对照组：连续3天腹腔注射CO，末次注射CO后24小时，单次腹腔注射生理盐水。 [3]
* **样本采集：** 在注射AAI后不同时间点，通过尾部采血（每次20 μL）采集血样，并置于肝素涂层毛细管中。在注射AAI后30分钟采集组织（肝脏和肾脏）用于代谢物分析，或在最后一次注射BNF/CO后24小时采集组织用于微粒体制备和RNA提取。对于组织病理学和血清生化分析，分别在注射AAI/生理盐水后3、7和14天处死小鼠。[3]
* **血清生化分析：** 使用日立7080型全自动临床分析仪测定血尿素氮和血清肌酐。[3]
* **组织病理学：** 将肾脏固定于10%福尔马林溶液中，石蜡包埋，切片厚度为3 μm，并用苏木精-伊红染色。采用抗小鼠α-SMA抗体（1:800）和亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法进行α-SMA免疫染色。TUNEL检测采用罗氏诊断试剂盒，并按照供应商说明进行。[3]
* **高效液相色谱分析：**采用HP1100高效液相色谱系统，在250 nm波长下进行紫外检测，定量分析AAI及其代谢物（AAIa和ALI）。分离采用Welchorn XB-C18色谱柱，流动相为甲醇：0.1%乙酸水溶液（7:3），流速为0.8 mL/min。对血清、肝脏和肾脏样本进行了校准曲线、线性范围、精密度和回收率测定。[3]
* **实时荧光定量PCR：**采用UNIQ-10柱和TRIZOL试剂盒提取总RNA。使用克隆的AMV逆转录酶合成cDNA。实时荧光定量PCR采用TaKaRa Ex Taq R-PCR试剂盒，使用CYP1A1、CYP1A2、CPR和β-actin的基因特异性引物。PCR反应进行45个循环，退火温度为60℃。相对表达量以β-actin mRNA为内参进行标准化。[3]
* **Western Blotting：**将微粒体蛋白（30 μg）进行10% SDS-PAGE电泳分离，转移至硝酸纤维素膜，并用CYP1A1（1:100）、CYP1A2（1:1000）和CPR（1:1000）抗体进行孵育。使用ECL系统检测信号。[3]

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动物：雄性C57BL/6小鼠（6周龄，18-22 g）购自上海实验动物中心。所有动物实验均经上海市动物伦理委员会批准[证书编号：SCXK（上海）2002-0010]。[3]
处理组：小鼠分为三组（每组n=15）：（1）AAI组：连续3天腹腔注射玉米油（CO），末次注射CO后24小时，单次腹腔注射10 mg/kg AAI（溶于生理盐水）；（2）BNF+AAI组：连续3天腹腔注射80 mg/kg BNF（溶于CO），末次注射BNF后24小时，单次腹腔注射10 mg/kg AAI；（3）对照组：连续3天腹腔注射CO，末次注射CO后24小时，单次腹腔注射生理盐水。[3]
样本采集：在注射AAI后不同时间点，通过尾部采血（每次20 μL）采集血样，置于肝素抗凝毛细管中。在AAI注射后30分钟采集肝脏和肾脏组织用于代谢物分析，或在最后一次BNF/CO注射后24小时采集组织用于微粒体制备和RNA提取。对于组织病理学和血清生化分析，分别在AAI/生理盐水注射后3、7和14天处死小鼠。[3]
血清生化：使用日立7080型全自动临床分析仪测定血尿素氮和血清肌酐。[3]
组织病理学：将肾脏固定于10%福尔马林溶液中，石蜡包埋，切片厚度为3 μm，并进行苏木精-伊红染色。使用抗小鼠α-SMA抗体（1:800）和亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法进行α-SMA免疫染色。TUNEL检测使用罗氏诊断试剂盒，并按照供应商的说明进行操作。 [3]
高效液相色谱分析：使用配备250 nm紫外检测器的HP1100高效液相色谱系统对AAI及其代谢物（AAIa和ALI）进行定量分析。分离采用Welchorn XB-C18色谱柱，流动相为甲醇：0.1%乙酸水溶液（7:3），流速为0.8 mL/min。对血清、肝脏和肾脏样本建立了校准曲线、线性范围、精密度和回收率。[3]
实时荧光定量PCR：使用UNIQ-10柱和TRIZOL试剂盒提取总RNA。使用克隆的AMV逆转录酶合成cDNA。实时荧光定量PCR使用TaKaRa Ex Taq R-PCR试剂盒，并采用CYP1A1、CYP1A2、CPR和β-actin基因特异性引物。PCR反应进行45个循环，退火温度为60℃。相对含量以β-肌动蛋白mRNA进行标准化。[3]
蛋白质印迹：将微粒体蛋白（30 μg）在10% SDS-PAGE凝胶上分离，转移至硝酸纤维素膜，并用针对CYP1A1（1:100）、CYP1A2（1:1000）和CPR（1:1000）的抗体进行检测。使用ECL系统检测信号。[3]

AAI 药代动力学：BNF 预处理显著改变了 AAI 的药代动力学。单次腹腔注射 10 mg/kg AAI 后，与对照组小鼠相比，BNF 预处理小鼠的 Cmax 降低（3.08 ± 0.61 vs. 8.73 ± 1.57 μg/mL，p < 0.01），tmax 缩短（6.25 ± 2.50 vs. 16.00 ± 5.48 min，p < 0.05），AUC 降低（149.84 ± 20.30 vs. 418.37 ± 126.09 min·μg/mL，p < 0.05）。半衰期未发生显著变化。[3]
组织分布：AAI 给药后 30 分钟，BNF 预处理使肝脏和肾脏中的 AAI 水平降低约 3 倍（p < 0.01）。 AAIA 水平未发生显著变化。BNF 预处理后，肝脏和肾脏中的 ALI 水平均有所下降。[3]

[1]. Ishida T, Takechi S. β-Naphthoflavone, an exogenous ligand of aryl hydrocarbon receptor, disrupts zinc homeostasis in human hepatoma HepG2 cells. J Toxicol Sci. 2019;44(10):711-720.

[2]. α- and β-Naphthoflavone synergistically attenuate H2O2-induced neuron SH-SY5Y cell damage. Exp Ther Med. 2017 Mar;13(3):1143-1150.

[3]. β-Naphthoflavone protects mice from aristolochic acid-I-induced acute kidney injury in a CYP1A dependent mechanism. Acta Pharmacologica Sinica 30.11 (2009): 1559-1565.

β-萘黄酮是一种由苯环与黄酮类化合物的f侧稠合而成的延伸黄酮类化合物。它是一种芳烃受体激动剂。它是一种延伸黄酮类化合物、有机杂环三环化合物和萘并-γ-吡喃酮。β-萘黄酮，也称为5,6-苯并黄酮，是芳烃受体的强效激动剂，可诱导细胞色素P450 (CYP) 和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶 (UGT)。它可能是一种化学预防剂。β-萘黄酮是一种多环芳烃，由一个黄酮基团连接到一个苯环上构成。β-萘黄酮是肝细胞色素P450 CYP1A1和CYP1A2的诱导剂。一种能诱导 P4501A1 和 P4501A2 细胞色素的多环芳烃化合物。(Proc Soc Exp Biol Med 1994 Dec:207(3):302-308)

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背景：β-萘黄酮是天然黄酮类化合物的合成衍生物，天然黄酮类化合物存在于西番莲(Passiflora incarnata Linn.)中。它是萘黄酮仅有的两种结构异构体之一（另一种是 α-萘黄酮）。本研究探讨了其作为一种易于获得且价格低廉的神经系统疾病治疗药物的潜力。[2]
作用机制（推测）：β-萘黄酮通过多种机制发挥抗氧化应激的神经保护作用：(1) 上调抗氧化酶活性（CAT、SOD、GPx）；(2) 抑制 p38 MAPK 在 Thr180 和 Tyr182 位点的磷酸化； (3)抑制促凋亡蛋白（Bax、细胞色素c释放）的表达和caspase-3的激活；(4)提高总抗氧化能力并降低脂质过氧化（MDA）。[2]
与α-萘黄酮的比较：β-萘黄酮在保护神经元免受H₂O₂诱导损伤方面比α-萘黄酮更有效，尤其是在恢复细胞活力、减少细胞凋亡、上调CAT活性和抑制细胞色素c释放方面。[2]
协同作用：α-萘黄酮和β-萘黄酮联合治疗比单独使用任一化合物均能产生更强的神经保护作用，表明二者联合治疗在神经系统疾病方面具有潜力。[2]
临床应用潜力：该研究表明，在神经系统疾病的临床治疗中联合使用α-萘黄酮和β-萘黄酮可能是有益的。 [2] p38 MAPK信号通路：该研究证实，H₂O₂诱导的神经元凋亡至少部分依赖于p38 MAPK在特定位点（Thr180/Tyr182）的磷酸化，而β-萘黄酮的神经保护作用是通过抑制该通路实现的。[2]

C19H12O2

272.3

272.083

6051-87-2

2361

White to light yellow solid powder

1.3±0.1 g/cm3

460.9±45.0 °C at 760 mmHg

185-189 °C

215.8±22.3 °C

0.0±1.1 mmHg at 25°C

1.695

4.79

30.21

0

2

1

21

433

0

OUGIDAPQYNCXRA-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C19H12O2/c20-16-12-18(14-7-2-1-3-8-14)21-17-11-10-13-6-4-5-9-15(13)19(16)17/h1-12H

3-phenylbenzo[f]chromen-1-one

beta-Naphthoflavone beta-NF

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~25 mg/mL (~91.81 mM)

配方 1 中的溶解度: 1 mg/mL (3.67 mM) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液；超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 10.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 1 mg/mL (3.67 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 10.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。