BI-6901

Chemokine receptor CCR10 (antagonist) [1]
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抑制CCL27依赖性Ca²⁺内流：在稳定转染人CCR10和水母素的CHO-K细胞中，初步筛选得到的化合物1以690 nM的IC50值抑制CCL27依赖性Ca²⁺内流。优化后得到化合物cut-22，其在该实验中的效力约为化合物1的300倍。具体而言，在用CCL27刺激的CHO-K细胞中，cut-22（外消旋体）在FLIPR Ca²⁺内流测定中显示出8.7 ± 0.2的pIC50值。活性对映体eut-22在同一检测中pIC50为9.0 [8.9, 9.1] [1]
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抑制CCL28依赖性Ca²⁺内流：cut-22也抑制了另一种已知的CCR10配体CCL28刺激的Ca²⁺内流。在CHO-K细胞中，cut-22抑制CCL28刺激的Ca²⁺内流的pIC50为7.9 ± 0.3（FLIPR检测）和7.9 ± 0.1（水母素检测）。对于eut-22，pIC50 为 8.9 (FLIPR) 和 9.0 [8.9, 9.1] (水母素) [1]
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抑制 CCL27 依赖性趋化作用：在稳定转染人 CCR10 的 Ba/F3 细胞中，化合物 1 抑制 CCL27 依赖性趋化作用，IC50 为 53 nM。cut-22 在此功能测定中表现出强效拮抗作用，pIC50 为 9.0 ± 0.3。活性对映体eut-22在类似的趋化性测定中对小鼠CCR10的pIC50值为7.6 [7.4, 7.9] [1]
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竞争性结合测定：cut-22与CCR10竞争性且可逆地结合。在使用HEK细胞膜制备物和Fc-CCL27融合蛋白作为探针的免疫化学结合测定中，化合物14（一种结构相似的化合物）的结合pIC50值为8.5。虽然本表中未提供cut-22的确切值，但其在功能测定中的活性与直接受体结合一致[1]
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GTP结合测定：cut-22影响CCR10与G蛋白的偶联。在用 CCL27 刺激的 HEK 细胞膜制备物进行的 GTP-Eu 结合实验中，cut-22 的 pIC50 为 8.0 [1]
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抑制 CCL27 依赖性 cAMP 生成：cut-22 抑制 CCL27 依赖性 cAMP 生成。在转染 CCR10 并用 CCL27 刺激的 HEK 细胞中，cut-22 在 cAMP 测定中显示出 pIC50 为 7.6 [1]
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选择性：cut-22 对 CCR10 具有高度选择性。未观察到该化合物对 29 种 GPCR（包括 6 种其他趋化因子受体）的显著结合或活性（数据见补充材料）[1]。
R¹ 基团的构效关系 (SAR)：初始先导化合物（化合物 1，IC50 690 nM）咪唑上的硝基虽然重要，但可以被取代。未取代的咪唑（化合物 2）活性较低。用氰基（化合物 3）或氯基（化合物 4）取代硝基后，活性得以维持或提高。进一步研究发现，氰基吡咯（化合物 14，人 CCR10 pIC50 为 7.7±0.2）是一种高效的替代化合物，消除了硝基咪唑类化合物潜在的毒性问题[1]。
R² 基团（磺酰胺）的构效关系 (SAR)：最初筛选出的先导化合物（化合物 1）中的苯胺磺酰胺存在潜在的毒性风险。虽然苯胺类化合物（例如化合物 16、17 和 18）活性较高，但为了避免毒性风险，我们用具有类似氢键供体性质的吲哚类化合物替代了它们。由此发现了 1H-吲哚-4-基磺酰胺类化合物 cut-22，其活性显著提高（外消旋体 cut-22 的 pIC50 为 8.7±0.1），优于类似的苯胺类化合物，并消除了苯胺类化合物的潜在毒性风险。吲哚NH基团至关重要，因为N-甲基吲哚类似物(23)的效力降低了约70倍[1]。
R³基团（酰胺）的构效关系(SAR)：4-甲基哌啶酰胺被确定为最佳构效关系。哌啶4位取代基的变化（例如，如27、28中的较大基团或如29中的极性基团）、甲基在环上的位置(30-33)或环大小/同系化(34-38)的变化均导致效力低于4-甲基哌啶类似物[1]。
立体选择性：CCR10拮抗作用具有高度立体选择性。同苯丙氨酸类似物R-10和S-10对其中一种对映体表现出强烈的偏好。对于cut-22的对映体也观察到了这一点，其中eut-22（pIC50 9.0）是活性对映体，而dis-22（pIC50 5.5±0.1）的活性明显较低[1]
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在致敏小鼠中，BI-6901（腹腔注射；100 mg/kg；每日两次）可模拟DNFB刺激引起的耳水肿的抗炎反应。在同一模型中，BI-6901引起的疾病程度与抗CCL27抗体的治疗水平（60-85%）相符[1]。

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在小鼠DNFB接触性超敏反应模型中的疗效：活性对映体eut-22在小鼠接触性超敏反应模型中显示出疗效。当以100 mg/kg的剂量腹腔注射eut-22，每日两次（0和8小时）给药时，eut-22显著抑制了经DNFB（2,4-二硝基氟苯）致敏和激发的Balb-C小鼠的耳肿胀。该作用呈剂量依赖性。无活性的对映体dis-22在同一模型中未显示任何活性，证实其疗效是由于特异性CCR10拮抗作用所致。其疗效水平与先前报道的抗CCL27抗体（60-85%）相似[1]
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GTP结合实验（GTP-Eu）：该实验用于验证化合物是否影响CCR10与G蛋白的偶联。实验采用表达人CCR10的HEK细胞膜。将细胞膜与测试化合物、激动剂CCL27以及不可水解的铕标记GTP类似物（GTP-Eu）孵育。利用时间分辨荧光（TRF）技术，随时间推移测量GTP-Eu的结合情况，该结合反映了G蛋白的激活。测定了cut-22抑制GTP结合的pIC50值[1]
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竞争性结合实验（Fc-CCL27）：进行结合实验以验证化合物与CCR10的直接和竞争性相互作用。实验采用含有CCR10的HEK细胞膜。使用Fc与趋化因子CCL27的融合蛋白（Fc-CCL27）作为探针。采用免疫化学方法测定了测试化合物与Fc-CCL27竞争结合CCR10的能力。测定了化合物14在该测定中的pIC50值[1]
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Ca²⁺ 流检测（FLIPR 和水母素）：初步筛选和表征检测采用稳定转染人 CCR10 和生物发光蛋白水母素的 CHO-K 细胞。对于 FLIPR（荧光成像板读数仪）检测，细胞加载钙敏感荧光染料。细胞预先与不同浓度的测试化合物孵育，然后用激动剂（CCL27 或 CCL28）刺激。通过荧光（FLIPR）或水母素产生的化学发光来测量细胞内 Ca²⁺ 的瞬时增加，该增加是受体激活的指标。计算抑制该 Ca²⁺ 流的 IC50 值 [1]。趋化性检测：该功能性检测采用稳定转染人或鼠 CCR10 的 Ba/F3 细胞进行。将细胞置于 Transwell 小室的上室中。将测试化合物加入上室，并将趋化因子 CCL27 作为趋化剂加入下室。孵育一段时间后，计数迁移至下室的细胞数量。测定测试化合物抑制 CCL27 依赖性趋化作用的 IC50 值 [1]。
cAMP 测定：该测定在转染人 CCR10 的 HEK 细胞中进行。CCL27 激活 CCR10 会导致腺苷酸环化酶抑制和 cAMP 生成减少。将细胞与测试化合物预孵育，然后在福斯克林（用于提高基础 cAMP 水平）存在下用 CCL27 刺激细胞。测量细胞内 cAMP 水平，并将测试化合物逆转 CCL27 介导的 cAMP 生成抑制（即提高 cAMP 水平）的能力量化为 pIC50 值 [1]。

动物/疾病模型： Balb-C 小鼠的 DNFB 接触性超敏反应模型。
剂量： 100 mg/kg
给药途径： 腹腔注射 (ip)
实验结果： 对致敏 Balb-C 小鼠中 DNFB 刺激的炎症反应具有抑制作用。

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小鼠 DNFB 接触性超敏反应模型：** 雌性 Balb-C 小鼠连续两天在剃毛后的腹部局部涂抹 DNFB 溶液进行致敏。初次致敏五天后，测量基线耳厚度。然后，在小鼠右耳局部涂抹 DNFB 溶液进行激发。测试化合物（eut-22和dis-22）配制于赋形剂（30%聚氧乙烯蓖麻油）中，并以100 mg/kg的剂量进行腹腔注射（ip），分别在两个时间点给药：DNFB激发后立即（0小时）和8小时后。实验设置阳性对照组（环孢素A，30 mg/kg，给药途径未在实验方案部分详细说明）和赋形剂对照组。DNFB激发后24小时，使用游标卡尺测量耳肿胀程度，以此作为炎症反应的指标[1]。

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小鼠DNFB接触性超敏反应模型：雌性Balb-C小鼠连续两天在剃毛后的腹部局部涂抹DNFB溶液进行致敏。首次致敏5天后，测量基线耳厚度。随后，将DNFB溶液局部涂抹于小鼠右耳进行刺激。测试化合物（eut-22和dis-22）溶于赋形剂（30%聚氧乙烯蓖麻油）中，并以100 mg/kg的剂量腹腔注射（ip），分别在两个时间点给药：DNFB刺激后立即（0小时）和8小时后。实验设置阳性对照组（环孢素A，30 mg/kg，给药途径未在实验方案部分详细说明）和赋形剂对照组。DNFB刺激24小时后，使用游标卡尺测量耳肿胀程度，以此作为炎症反应的指标[1]
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小鼠代谢稳定性：cut-22（及其对映体）在小鼠体内表现出高清除率。在小鼠肝微粒体试验中，其半衰期 (t½) 小于 3 分钟，对应的预测肝血清除率 (Qh) 大于 88% [1]。小鼠血浆暴露量（卫星药代动力学）：由于其高清除率，在疗效研究中需要高剂量才能维持暴露量。在腹腔注射 100 mg/kg eut-22（溶于 30% 聚氧乙烯醚）的 Balb-C 小鼠中，给药后 1 小时血浆浓度为 7.6 ± 4.5 μM，但给药后 7 小时降至 0.2 ± 0.2 μM。对于 30 mg/kg 剂量，1 小时时的浓度为 3.7 ± 0.4 μM，7 小时时未检测到。非活性对映体 dis-22 也观察到类似的暴露曲线 [1]。血浆蛋白结合率：eut-22 和 dis-22 在小鼠体内均显示出较高的血浆蛋白结合率，测量值为 99% [1]。

结构缺陷消除：最初的先导化合物 1 含有一些具有潜在毒性、致突变性和药物相互作用缺陷的结构特征：咪唑上的硝基（可能形成活性代谢物）和苯胺（与肝毒性和致癌性相关）。优化过程成功地通过将硝基咪唑替换为氰基吡咯，将苯胺磺酰胺替换为吲哚磺酰胺，从而消除了这两个结构缺陷，最终得到化合物 cut-22 [1]
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血浆蛋白结合率：eut-22 和 dis-22 在小鼠体内的血浆蛋白结合率均达到 99% [1]
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[1]. N-Arylsulfonyl-α-amino carboxamides are potent and selective inhibitors of the chemokine receptor CCR10 that show efficacy in the murine DNFB model of contact hypersensitivity. Bioorg Med Chem Lett. 2016 Nov 1;26(21):5277-5283.

背景与原理：CCR10 是一种趋化因子受体，在趋化因子 CCL27 的激活下，它在皮肤归巢记忆 T 细胞向皮肤迁移的过程中发挥着重要作用。CCR10 和 CCL27 均与过敏性接触性皮炎和银屑病等炎症性皮肤病相关。阻断 CCL27-CCR10 相互作用被认为是一种潜在的治疗方法。本研究描述了首批高效且选择性的 CCR10 小分子拮抗剂，以验证这一假设 [1]。化合物命名和立体化学：经药物化学优化后的化合物在文中被称为 cut-22。它是一种外消旋混合物。其两个对映异构体分别为 eut-22（活性对映异构体）和 dis-22（非活性对映异构体）。疗效研究采用活性对映体eut-22进行[1]
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作用机制：cut-22是一种强效且选择性的CCR10趋化因子受体拮抗剂。它直接与CCR10结合，阻止天然趋化因子CCL27和CCL28激活该受体。这种抑制作用阻断了下游信号通路，例如G蛋白偶联、Ca²⁺内流和cAMP生成，最终阻止CCR10介导的细胞趋化作用[1]
。
治疗潜力：eut-22在小鼠DNFB接触性超敏反应模型中的疗效表明，CCR10拮抗作用是治疗接触性皮炎等皮肤炎症性疾病以及潜在的银屑病的一种有效治疗方法。作者还建议，这些抑制剂可用于研究 CCR10 在粘膜炎症（例如哮喘）和癌症中的作用[1]
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C23H27N5O3S

453.557183504105

453.183

2040401-92-9

2040401-92-9; 1191030-85-9 (recamic);

131801164

White to off-white solid powder

2.6

119

2

5

7

32

811

1

S(C1=CC=CC2=C1C=CN2)(N[C@H](CCN1C=CC=C1C#N)C(N1CCC(C)CC1)=O)(=O)=O

BRJXJOWXAFLRTE-OAQYLSRUSA-N

InChI=1S/C23H27N5O3S/c1-17-8-13-28(14-9-17)23(29)21(10-15-27-12-3-4-18(27)16-24)26-32(30,31)22-6-2-5-20-19(22)7-11-25-20/h2-7,11-12,17,21,25-26H,8-10,13-15H2,1H3/t21-/m1/s1

N-[(2R)-4-(2-Cyanopyrrol-1-yl)-1-(4-methylpiperidin-1-yl)-1-oxobutan-2-yl]-1H-indole-4-sulfonamide

eut22BI6901 eut-22BI 6901 eut 22BI-6901

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中（例如氮气保护），避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~160 mg/mL (~352.76 mM)

配方 1 中的溶解度: 5 mg/mL (11.02 mM) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液；超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 50.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: 4 mg/mL (8.82 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 40.0mg/mL澄清的DMSO储备液加入到900μL 20％SBE-β-CD生理盐水中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 4 mg/mL (8.82 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 40.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入900 μL 玉米油中，混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。