BTS

Skeletal muscle myosin II subfragment 1 (S1) ATPase

BTS (2–12 μM) 在缺乏肌动蛋白的情况下抑制 Ca2+ 刺激的肌球蛋白 S1 ATP 酶活性，IC50 约为 5 μM [1]。 BTS (2–20 μM) 可逆地抑制重肌球蛋白 (HMM) 滑动速率 [1]。在 ADP 存在的情况下，BTS (100 μM) 从肌动蛋白中释放肌球蛋白 [1]。 BTS (0-20 μM) 的 IC50 分别约为 3 μM 和 1 μM，可逆地降低兔子和青蛙中等长度带皮骨骼肌纤维中 Ca2+ 激活的张力 [1]。

化合物库的高通量筛选[1]
将5微升0.1 mg ml−1肌球蛋白S1、0.4 mg/ml F-肌动蛋白、1 mM DTT在测定缓冲液（25 mM HEPES pH 7.6、50 mM KCl、2 mM MgCl2）中的混合物分配到384孔的白色斜板中。使用安装在X、Y、Z机器人上的钢针阵列将储存在DMSO中的浓度为5 mg ml-1的化合物转移到384孔板中，使最终浓度达到约100μM。通过每孔加入5μl 200μM ATP引发反应，然后在环境温度（20-24°C）下孵育1小时。为了测量剩余的ATP，向每个孔中加入40μl显影溶液（0.5 mM荧光素、1.25μg ml-1荧光素酶、25 mM Tricine pH 7.8、5 mM MgSO4、100μM EDTA和1 mM DTT）。然后在15分钟内使用平板读数器测量每个测定孔中的发光信号。

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稳态ATP酶。[2]
使用NADH偶联测定法进行ATP酶测定，监测340nm处的吸光度。这些实验是在25°C下使用应用光物理停流装置或标准紫外/可见分光光度计进行的。ATP酶反应在含有100 U/mL丙酮酸激酶、20 U/mL乳酸脱氢酶、200μM NADH和500μM磷酸（烯醇）丙酮酸盐的缓冲液A[10 mM咪唑（pH 7.0）、2 mM MgCl2、1 mM EGTA和1 mM DTT]中含有50 nM S1。肌动蛋白浓度从0到150μM不等。通过加入2mM MgATP引发反应。[2]

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内部色氨酸荧光。[2]
使用应用光物理停流装置进行实验。在295nm处激发蛋白质荧光，并通过320nm长通发射滤光片收集。实验在25°C下在缓冲液A（见上文）或缓冲液B[20 mM Tris-HCl（pH 7.0）、200 mM KCl、2 mM MgCl2和1 mM DTT]中进行。[2]

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芘-肌动蛋白荧光。在25°C下，通过芘标记的肌动蛋白在缓冲液B中的荧光淬灭来测量不同条件下S1与肌动蛋白的强结合程度。使用365nm的激发波长在标准荧光计上进行稳态测量。通过400nm截止滤光片和设置为412nm的单色器测量发射。在Applied Photophysics停流装置上进行了瞬态实验，在365nm处激发并通过400nm截止滤光片监测发射。

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磷酸盐释放。[2]
使用荧光标记的磷酸盐结合蛋白突变体（PiBP；18,19）在顺序混合模式下停止流动，并使用440nm长通滤光片（λex=425nm）测量瞬时磷酸盐（Pi）释放。在这种配置下，仪器的死时间约为2 ms。通过在缓冲液A中与0.5 mM 7-甲基鸟苷和1 U/mL核苷磷酸化酶一起孵育过夜，从注射器、塑料制品和停流装置中去除污染的磷酸盐。通过与0.1 mM 7-甲基鸟苷和0.02 U/mL核苷磷酸酶一起孵育，从实验溶液中去除背景磷酸盐。[2]

In vitro motility/体外运动[1]
根据Sellers等人24，对肌球蛋白S1和HMM上滑动的肌动蛋白丝进行了以下修改。HMM以0.1 mg ml-1的浓度吸附在流动池室中的硝化纤维涂层盖玻片上。用0.5 mg ml-1酪蛋白封闭腔室，然后以20 nM的浓度加入用TRITC鬼笔环肽稳定的F-actin。通过在测定缓冲液（20 mM KCl、10 mM MOPS pH 7.2、5 mM MgCl2、0.1 mM EGTA、10 mM DTT、2.5 mg ml-1葡萄糖、0.1 mg ml-1葡萄糖苷氧化酶、0.02 mg ml-1过氧化氢酶）中加入1 mM ATP来启动运动，并使用1.4 NA 60×镜头（尼康）和冷却电荷耦合显示器（CCD）相机（普林斯顿仪器）以10秒的间隔记录细丝滑动。对于对照组，5C、20μM BTS和2μM BTS在8、3、6和5个单独实验中跟踪的细丝数量分别为63、27、51和54。速率表示为速度，单位为μm秒-1±标准误差。[1]

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Ca2+刺激的S1 ATP酶的测定[1]
将肌球蛋白S1在反应缓冲液（200 mM KCl、50 mM Tris pH 7.5、2.5 mM CaCl2、1 mM MgCl2、1 mmol DTT、0.2 mM 2-氨基-6-巯基-7-甲基嘌呤核苷（MESG）和10 U ml-1嘌呤核苷磷酸化酶（PNP））中稀释至0.025 mg ml-1。通过向100μM中加入ATP引发反应，每5秒读取360 nm处的吸光度。在0、0.625、1.25、2.5、5和10μM BTS处测定抑制作用。[1]

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Mant-ADP结合试验[1]
在测定缓冲液（25 mM HEPES pH 7.6，50 mM KCl，2 mM MgCl2）中，将0.5μM肌球蛋白S1与5μM Mant ADP（分子探针）混合。将ADP、BTS和5%DMSO或5%DMSO的溶液加入肌球蛋白S1和Mant-ADP的混合物中，使ADP或BTS的最终浓度为5、10、50、100、200或400μM。Mant-ADP荧光在290nm激发，在448nm测定。ADP或BTS存在下的荧光值除以缓冲液对照的荧光，以校正稀释效应。[1]

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F-actin与HMM的共沉积[1]
G-actin（35μM）在37°C下在F缓冲液（100 mM KCl、25 mM Tris pH 7.0、1 mM MgCl2、0.2 mM CaCl2、0.5 mM DTT、1 mM ATP）中聚合45分钟。通过将鬼笔环肽添加到45μM来稳定F-actin，并用自旋下降缓冲液（200 mM KCl、50 mM Tris pH 7.0、2 mM MgCl2、1 mM DTT、50 mM葡萄糖）透析以去除残留的ATP。HMM（0.5μM）在室温下在结合缓冲液中与或不与F-actin（1.5μM）一起孵育15分钟，然后将10μl混合物分配到单独的试管中。ADP（50 mM）与50 U ml−1己糖激酶（Sigma）在37°C的自旋缓冲液中预孵育20分钟，以水解污染物ATP。向肌动蛋白-肌球蛋白混合物中加入等体积的单独结合缓冲液或含有2 mM ATP或2 mM ADP和0.2 U己糖激酶的结合缓冲液。在添加核苷酸时加入溶解在DMSO或单独DMSO中的BTS，使其最终浓度为100μM BTS或0.1%DMSO。将反应混合物在22°C下孵育10分钟，然后在TLA-100转子中以217000 g（75000 rpm）的速度离心10分钟。将上清液和颗粒溶解在SDS-PAGE样品缓冲液中，在10%SDS-PAGE凝胶上分离，并用考马斯亮蓝染色。

Relaxed bundles of rabbit psoas or soleus muscle were chemically skinned in a 50% glycerol-extraction solution (5 mM MgATP, <10−8 M Ca2+, −20 °C)25 to remove the sarcolemma, leaving the contractile apparatus intact. Single fibres were teased from the bundles under silicone oil (12 °C) and rinsed with glycerol-free relaxing solution. Aluminum foil clips (T-clips) were fastened around the ends of the fibres to secure the fibre between hooks on a force transducer and a servomotor (200 μs length changes)[1]

[1]. A small-molecule inhibitor of skeletal muscle myosin II. Nat Cell Biol. 2002 Jan;4(1):83-8.

[2]. Mechanism of inhibition of skeletal muscle actomyosin by N-benzyl-p-toluenesulfonamide. Biochemistry. 2003 May 27;42(20):6128-35.

4-methyl-N-(phenylmethyl)benzenesulfonamide is a sulfonamide.

C14H15NO2S

261.33

261.082

C, 64.34; H, 5.79; N, 5.36; O, 12.24; S, 12.27

1576-37-0

95801

White to off-white solid powder

1.204 g/cm3

419.1ºC at 760 mmHg

115 °C

207.3ºC

3.12E-07mmHg at 25°C

1.589

3.945

54.55

1

3

4

18

333

0

S(C1C([H])=C([H])C(C([H])([H])[H])=C([H])C=1[H])(N([H])C([H])([H])C1C([H])=C([H])C([H])=C([H])C=1[H])(=O)=O

WTHKAJZQYNKTCJ-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C14H15NO2S/c1-12-7-9-14(10-8-12)18(16,17)15-11-13-5-3-2-4-6-13/h2-10,15H,11H2,1H3

N-benzyl-4-methylbenzenesulfonamide

BnNHTs; BTS; N-Benzyl-p-toluenesulfonamide; 1576-37-0; N-Benzyl-4-methylbenzenesulfonamide; N-Tosylbenzylamine; N-Benzyl-4-methyl-benzenesulfonamide; N-Benzyl-p-toluenesulphonamide; Benzenesulfonamide, 4-methyl-N-(phenylmethyl)-; p-Toluenesulfonamide, N-benzyl-;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ≥ 33.33 mg/mL (~127.54 mM)
H2O : ~0.1 mg/mL (~0.38 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (9.57 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (9.57 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (9.57 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。