BTS

Skeletal muscle myosin II subfragment 1 (S1) ATPase
Skeletal muscle myosin II subfragment 1 (S1) ATPase. BTS is a potent inhibitor of Ca2+-stimulated myosin S1 ATPase activity with an IC50 of approximately 5 μM. It weakens myosin's interaction with F-actin and reversibly blocks gliding motility. BTS does not affect platelet myosin II, indicating specificity for skeletal muscle myosin.

BTS (2–12 μM) 在无肌动蛋白存在的情况下抑制 Ca2+ 刺激的肌球蛋白 S1 ATPase 活性，IC50 约为 5 μM [1]。BTS (2–20 μM) 可逆地抑制重肌球蛋白 (HMM) 的滑动速率 [1]。在 ADP 存在的情况下，BTS (100 μM) 可使肌球蛋白从肌动蛋白上释放 [1]。BTS (0–20 μM) 分别以约 3 μM 和 1 μM 的 IC50 值可逆地降低兔和蛙中等长度去膜骨骼肌纤维中 Ca2+ 激活的张力 [1]。
BTS 以约 5 μM 的 IC50 值抑制 Ca2+ 刺激的肌球蛋白 S1 ATPase 活性。它是一种选择性骨骼肌肌球蛋白 II 亚片段 1 (S1) ATPase 活性抑制剂。该化合物可降低ADP-肌球蛋白与肌动蛋白的亲和力，并可逆地阻断肌球蛋白沿肌动蛋白丝的滑动运动。BTS不影响血小板肌球蛋白II，表明其对骨骼肌肌球蛋白具有选择性。

由于BTS主要用作体外肌肉收缩研究的工具，因此其体内活性数据有限。该化合物抑制肌球蛋白ATPase活性的能力使其成为研究肌球蛋白II在各种生理过程中作用的宝贵工具。可能需要进一步的体内研究来全面了解其潜在的治疗应用。

高通量筛选化合物库[1]
将5 μL含有0.1 mg/mL肌球蛋白S1、0.4 mg/mL F-肌动蛋白和1 mM DTT的混合溶液（溶于25 mM HEPES pH 7.6、50 mM KCl和2 mM MgCl2的测定缓冲液中）分装至384孔白色平板中。将浓度为5 mg/mL的DMSO溶液中的化合物转移至384孔板中，转移过程使用安装在X、Y、Z轴机器人上的钢针阵列，使最终浓度约为100 μM。向每个孔中加入5 μL 200 μM ATP启动反应，并在室温（20–24 °C）下孵育1小时。为了测定剩余的ATP，向每个孔中加入40 μl显色液（0.5 mM荧光素、1.25 μg ml⁻¹荧光素酶、25 mM Tricine pH 7.8、5 mM MgSO₄、100 μM EDTA和1 mM DTT）。然后在15分钟内使用酶标仪测量每个检测孔中的发光信号。稳态ATP酶活性测定。[2] ATP酶活性测定采用NADH偶联法，监测340 nm处的吸光度。这些实验在25 °C下使用Applied Photophysics停流装置或标准紫外/可见分光光度计进行。 ATPase反应体系包含50 nM S1，缓冲液A [10 mM咪唑（pH 7.0）、2 mM MgCl2、1 mM EGTA和1 mM DTT]，其中含有100 U/mL丙酮酸激酶、20 U/mL乳酸脱氢酶、200 μM NADH和500 μM磷酸（烯醇式）丙酮酸。肌动蛋白浓度为0至150 μM。反应通过加入2 mM MgATP启动。[2]

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内部色氨酸荧光。[2]
实验使用Applied Photophysics公司的停流装置进行。蛋白质荧光在295 nm处激发，并通过320 nm长通发射滤光片收集。实验在缓冲液 A（见上文）或缓冲液 B [20 mM Tris-HCl (pH 7.0)、200 mM KCl、2 mM MgCl2 和 1 mM DTT] 中于 25 °C 下进行。[2]

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芘-肌动蛋白荧光。[2]
在 25 °C 下，通过在缓冲液 B 中测定芘标记的肌动蛋白的荧光猝灭来测量不同条件下 S1 与肌动蛋白的强结合程度。稳态测量在标准荧光计上进行，激发波长为 365 nm。发射光通过 400 nm 截止滤光片和设置为 412 nm 的单色仪进行测量。瞬态实验在 Applied Photophysics 停流装置上进行，激发波长为 365 nm，发射光通过 400 nm 截止滤光片进行监测。

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磷酸盐释放。 [2]
瞬时磷酸盐 (Pi) 释放采用荧光标记的磷酸盐结合蛋白突变体 (PiBP; 18, 19) 进行测量，使用顺序混合模式下的停流装置，并采用 440 nm 长通滤光片 (λex = 425 nm)。在此配置下，仪器的死时间约为 2 ms。通过在缓冲液 A 中用 0.5 mM 7-甲基鸟苷和 1 U/mL 核苷磷酸化酶孵育过夜，去除注射器、塑料器皿和停流装置中的磷酸盐污染。通过在用 0.1 mM 7-甲基鸟苷和 0.02 U/mL 核苷磷酸化酶孵育，去除实验溶液中的背景磷酸盐。[2]
BTS 的体外酶活性测定包括测量 Ca2+ 刺激的肌球蛋白 S1 ATPase 活性的抑制情况。将兔肌肌球蛋白亚片段1 (S1) 与ATP和不同浓度的BTS在Ca2+存在下孵育。采用比色法或偶联酶法测定无机磷酸盐的释放量。根据浓度-反应曲线确定IC50值（约5 μM）。

体外运动性[1]
肌动蛋白丝在肌球蛋白S1和HMM上的滑动情况根据Sellers等人24的方法进行测定，并作如下修改。将HMM以0.1 mg ml−1的浓度吸附到流动池腔室中的硝化纤维素涂层盖玻片上。用0.5 mg ml−1的酪蛋白封闭腔室，然后加入用TRITC-鬼笔环肽稳定的F-肌动蛋白，浓度为20 nM。在测定缓冲液（20 mM KCl、10 mM MOPS pH 7.2、5 mM MgCl₂、0.1 mM EGTA、10 mM DTT、2.5 mg ml⁻¹ 葡萄糖、0.1 mg ml⁻¹ 葡萄糖氧化酶、0.02 mg ml⁻¹ 过氧化氢酶）中加入 1 mM ATP 启动运动，并使用 1.4 NA 60× 镜头（尼康）和冷却式电荷耦合显示器 (CCD) 相机（普林斯顿仪器）以 10 秒的间隔记录丝状体的滑动情况。在对照组、5C 组、20 μM BTS 组和 2 μM BTS 组中，分别在 8、3、6 和 5 次独立实验中追踪到的丝状体数量为 63、27、51 和 54。速率以μm sec⁻¹的速度±标准误差表示。[1]

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Ca²⁺刺激的S1 ATPase的测定[1]
将肌球蛋白S1稀释至0.025 mg ml⁻¹，溶于反应缓冲液（200 mM KCl、50 mM Tris pH 7.5、2.5 mM CaCl₂、1 mM MgCl₂、1 mM DTT、0.2 mM 2-氨基-6-巯基-7-甲基嘌呤核苷 (MESG) 和10 U ml⁻¹嘌呤核苷磷酸化酶 (PNP)）。加入ATP至终浓度为100 μM启动反应，每5秒读取一次360 nm处的吸光度。在0、0.625、1.25、2.5、5和10 μM BTS浓度下测定抑制作用。[1]

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Mant-ADP结合测定[1]
将 0.5 μM 肌球蛋白 S1 与 5 μM Mant-ADP（Molecular Probes）混合于测定缓冲液（25 mM HEPES pH 7.6、50 mM KCl、2 mM MgCl2）中。向肌球蛋白 S1 和 Mant-ADP 的混合物中加入 ADP、BTS 和 5% DMSO 的溶液，或 5% DMSO 的溶液，使 ADP 或 BTS 的最终浓度分别为 5、10、50、100、200 或 400 μM。Mant-ADP 的荧光激发波长为 290 nm，检测波长为 448 nm。将 ADP 或 BTS 存在下的荧光值除以缓冲液对照的荧光值，以校正稀释效应。[1]

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F-肌动蛋白和 HMM 的共沉淀[1]
将 G-肌动蛋白 (35 μM) 在 F 缓冲液中聚合。将F-肌动蛋白与含有100 mM KCl、25 mM Tris pH 7.0、1 mM MgCl₂、0.2 mM CaCl₂、0.5 mM DTT和1 mM ATP的缓冲液在37 °C下孵育45分钟。加入鬼笔环肽至终浓度为45 μM以稳定F-肌动蛋白，并用离心缓冲液（200 mM KCl、50 mM Tris pH 7.0、2 mM MgCl₂、1 mM DTT和50 mM葡萄糖）透析以去除残留的ATP。将HMM（0.5 μM）与F-肌动蛋白（1.5 μM）在结合缓冲液中于室温下孵育15分钟，然后将10 μl混合物分装至不同的试管中。将ADP（50 mM）与50 U ml⁻¹己糖激酶（Sigma）在离心缓冲液中预孵育20分钟。在 37 °C 下水解污染物 ATP。向肌动蛋白-肌球蛋白混合物中加入等体积的结合缓冲液（单独使用）或含有 2 mM ATP 或 2 mM ADP 以及 0.2 U 己糖激酶的结合缓冲液。在加入核苷酸的同时加入溶于 DMSO 的 BTS 或单独的 DMSO，使最终浓度为 100 μM BTS 或 0.1% DMSO。反应混合物在 22 °C 下孵育 10 分钟，然后在 TLA-100 转子中以 217000 g (75000 rpm) 离心 10 分钟。将上清液和沉淀物溶解于 SDS-PAGE 上样缓冲液中，在 10% SDS-PAGE 凝胶上进行分离，并用考马斯亮蓝染色。
BTS 的体外细胞测定包括用该化合物处理表达肌球蛋白 II 的肌肉细胞或其他细胞类型，并测量 ATPase 活性。细胞活性、收缩或运动能力。用不同浓度的BTS处理细胞，并通过测量磷酸盐释放量来评估肌球蛋白ATPase活性。评估该化合物抑制肌球蛋白II功能以及影响细胞迁移和胞质分裂等细胞过程的能力。

将兔腰大肌或比目鱼肌松弛的肌束置于50%甘油提取液（5 mM MgATP，<10⁻⁸ M Ca²⁺，-20 °C）中，进行化学去膜处理，以去除肌膜，同时保持收缩装置完整。在硅油（12 °C）下，将单根肌纤维从肌束中分离出来，并用不含甘油的松弛液冲洗。将铝箔夹（T型夹）固定在肌纤维末端，使其位于力传感器和伺服电机（长度变化200 μs）的钩子之间[1]。由于BTS主要用作体外研究工具，因此其体内动物研究较为有限。该化合物对骨骼肌肌球蛋白II ATPase的强效选择性抑制作用可在肌肉功能或疾病的动物模型中进行研究。需要进一步研究以全面表征其体内疗效和药代动力学特性。

由于BTS主要用作研究工具，因此其药代动力学数据有限。该化合物分子量为261.34 g/mol，为白色结晶固体，可溶于氯仿、二氯甲烷和乙酸乙酯。BTS应储存于干燥、密封的容器中，室温避光保存。

BTS的临床前毒性研究有限。该化合物对大鼠的口服LD50大于500 mg/kg。BTS被归类为可燃固体，德国WGK等级为3级。处理该化合物时应采取适当的安全预防措施。任何潜在的治疗开发都需要进行全面的毒理学评估。

[1]. A small-molecule inhibitor of skeletal muscle myosin II. Nat Cell Biol. 2002 Jan;4(1):83-8.

[2]. Mechanism of inhibition of skeletal muscle actomyosin by N-benzyl-p-toluenesulfonamide. Biochemistry. 2003 May 27;42(20):6128-35.

4-甲基-N-(苯基甲基)苯磺酰胺是一种磺酰胺类化合物。
BTS（N-苄基-对甲苯磺酰胺，N-甲苯磺酰苄胺）是一种强效且选择性的骨骼肌肌球蛋白II亚片段1 (S1) ATPase活性抑制剂，IC50约为5 μM。它以不依赖于肌动蛋白的方式抑制Ca2+刺激的ATPase活性，降低ADP-肌球蛋白与肌动蛋白的亲和力，并可逆地阻断滑动运动。该化合物被广泛用作研究肌肉收缩机制和肌球蛋白II在细胞过程中作用的研究工具。

C14H15NO2S

261.33

261.082

C, 64.34; H, 5.79; N, 5.36; O, 12.24; S, 12.27

1576-37-0

95801

White to off-white solid powder

1.204 g/cm3

419.1ºC at 760 mmHg

115 °C

207.3ºC

3.12E-07mmHg at 25°C

1.589

3.945

54.55

1

3

4

18

333

0

S(C1C([H])=C([H])C(C([H])([H])[H])=C([H])C=1[H])(N([H])C([H])([H])C1C([H])=C([H])C([H])=C([H])C=1[H])(=O)=O

WTHKAJZQYNKTCJ-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C14H15NO2S/c1-12-7-9-14(10-8-12)18(16,17)15-11-13-5-3-2-4-6-13/h2-10,15H,11H2,1H3

N-benzyl-4-methylbenzenesulfonamide

BnNHTs; BTS; N-Benzyl-p-toluenesulfonamide; 1576-37-0; N-Benzyl-4-methylbenzenesulfonamide; N-Tosylbenzylamine; N-Benzyl-4-methyl-benzenesulfonamide; N-Benzyl-p-toluenesulphonamide; Benzenesulfonamide, 4-methyl-N-(phenylmethyl)-; p-Toluenesulfonamide, N-benzyl-;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ≥ 33.33 mg/mL (~127.54 mM)
H2O : ~0.1 mg/mL (~0.38 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (9.57 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (9.57 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (9.57 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。