DprE1/decaprenyl-phosphoribose-epimerase

体外活性：BTZ043，也称为 8-硝基-苯并噻嗪酮 (BTZ)，是十异戊二烯基磷酸核糖差向异构酶 (DprE1) 的有效抑制剂，对结核分枝杆菌 H37Rv 和耻垢分枝杆菌的 MIC 值分别为 2.3 nM 和 9.2 nM，分别。它在体外对结核分枝杆菌具有纳摩尔级的杀菌活性。 BTZ 抗性 DprE1 的抑制遵循 MIC 测量中观察到的趋势，C387G 突变体对 PyrBTZ01、PyrBTZ02 和 BTZ043 的抑制作用比 C387S 突变体（2.5- IC50 增加 4 倍）。构效关系（SAR）研究表明，BTZ 支架的 8-硝基对于作用机制至关重要，涉及与 DprE1 活性位点的 Cys387 形成半巯基键。 BTZ043 表现出良好的体外吸收-分布-代谢-排泄/毒性 (ADME/T) 和体内药代动力学特征。 BTZ043 在急性结核病小鼠模型中没有显示出功效，这表明 BTZ 通过抑制 DprE1 介导的杀伤作用需要共价键形成和化合物效力的结合。激酶测定：BTZ043，也称为 8-硝基-苯并噻嗪酮 (BTZ)，是十异戊二烯基磷酸核糖差向异构酶 (DprE1) 的有效抑制剂，对结核分枝杆菌 H37Rv 和耻垢分枝杆菌的 MIC 值分别为 2.3 nM 和 9.2 nM 。细胞测定：BTZ043 对结核分枝杆菌 H37Rv 和耻垢分枝杆菌的 MIC 分别为 1 ng/mL (2.3 nM) 和 4 ng/mL (9.2 nM)。还测试了 BTZ043 针对 30 种巴西诺卡氏菌分离株的体外活性。 BTZ043 的 MIC50 和 MIC90 值为 0.125 和 0.25 μg/mL。 N. carnea ATCC 6847 的 MIC 为 0.003μg/mL，N. transvalensis ATCC 6865 的 MIC 为 0.003μg/mL，N. brasiliensis NCTC10300 的 MIC 为 0.03 μg/mL，N. brasiliensis HUJEG-1 的 MIC 为 0.125μg/mL 。结核分枝杆菌 H37Rv 的 MIC 值为 0.000976 μg/mL。 BTZ-043 对大肠杆菌 ATCC 25922 和金黄色葡萄球菌 ATCC 2921 的 MIC 值 >64 μg/mL。

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各种BTZ对不同分枝杆菌的最小抑菌浓度（MIC）非常低，速生菌的MIC范围为~0.1至80 ng/ml，结核分枝杆菌复合物的MIC范围则为1至30 ng/ml。BTZ043对结核分枝杆菌H37Rv和耻垢分枝杆菌的最低抑菌浓度分别为1 ng/ml（2.3 nM）和4 ng/ml（9.2 nM）（表1），与现有的结核药物异烟肼（INH）（0.02至0.2μg/ml）和乙胺丁醇（EMB）（1至5μg/ml）相比，具有优势。从结构-活性关系研究来看，>30种不同的BTZ衍生物对结核杆菌的MIC<50 ng/ml（示例如表S2所示）。至关重要的是，BTZ043对所有接受检测的结核分枝杆菌临床分离株，包括多重耐药和广泛耐药菌株，都显示出类似的活性，表明它靶向一种以前未知的生物功能（表S3）。BTZ043具有杀菌作用，在72小时内将体外存活率降低了1000倍以上（图1B），这与INH的杀菌效果相当。在涉及代谢惰性结核分枝杆菌的两种不同模型系统（营养缺陷型和饥饿型）中，BTZ043的效果较差，这意味着它阻断了活性代谢的一个步骤，类似于INH[3]。

BTZ在足菌瘤动物模型中的作用[1]
当PBTZ169和BTZ043以100mg/kg的剂量每天两次通过强饲法给药时（图4），与生理盐水对照组相比，只有前者显示出统计学上的显著效果（P=0.017）。BTZ043治疗组无显著性差异（P=0.667）。与对照组相比，接受SXT治疗的小鼠组显示出统计学上的显著差异（P=0.007）。

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苯并噻嗪酮是治疗结核病和其他放线菌感染的强效候选药物。由于苯并噻嗪酮的纳摩尔活性，我们预期其具有优异的体内活性。在100mg/kg的剂量下，每天两次，我们观察到了治疗效果，但仅限于PBTZ169。结核分枝杆菌是一种比巴西猪笼草细胞壁更厚、更疏水的微生物，每天一次50mg/kg的BTZ043可显著降低肺和脾脏的细菌负荷。PBTZ169是一种更有效的药物，在小鼠感染模型中，与BTZ043相比，每天一次25mg/kg的剂量显著降低了杆菌的数量。[1]

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PyrBTZ01在急性结核病小鼠模型中没有活性。 鉴于PyrBTZ01获得的ADME/T和PK数据令人鼓舞，我们使用急性结核病小鼠模型进行了体内疗效研究。小鼠通过静脉注射结核分枝杆菌H37Rv感染，然后每天一次通过强饲法用吡咯烷酮Z01（50mg/kg）或异烟肼（25mg/kg）治疗，每周5天，持续4周。实验结束时，测定肺部CFU计数。虽然异烟肼和BTZ043有效，导致CFU数量在4周内减少约3.2个单位，但与未治疗的对照组相比，PyrBTZ01对治疗的小鼠没有任何保护作用，其微生物和病理反应与未治疗动物相同[2]。

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在结核病慢性模型中，BALB/c小鼠低剂量气溶胶感染4周后，评估了BTZ043的体内疗效。在所用浓度下，用BTZ043治疗四周分别将肺部和脾脏的细菌负荷降低了1和2个对数（图1D）。其他结果表明，BTZ的疗效是时间依赖性的，而不是剂量依赖性的。对未感染小鼠的急性（5 g/kg）和慢性（25和250 mg/kg）毒理学研究表明，即使在测试的最高剂量下，一个月后也没有不良的解剖、行为或生理影响（表S5）。

BTZ043，也称为 8-硝基-苯并噻嗪酮 (BTZ)，是十异戊二烯基磷酸核糖差向异构酶 (DprE1) 的有效抑制剂，对结核分枝杆菌 H37Rv 和耻垢分枝杆菌的 MIC 值分别为 2.3 nM 和 9.2 nM。

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BTZ169的MIC测定 [1]
我们使用了基于我们之前描述的CLSI M24-A文件的肉汤微量稀释法。作为外部对照，我们使用了大肠杆菌ATCC 25922和金黄色葡萄球菌ATCC 29213。由于诺卡氏菌的高度敏感性，其浓度范围为0.125μg/mL至0.0002μg/mL。

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药物敏感性试验。[2]
通过在96孔板中连续稀释工作细菌培养物中的化合物2倍（最终体积为100μl），用刃天青还原微孔板测定法（REMA）测量对所有分枝杆菌菌株的体外活性。对于结核分枝杆菌和牛型分枝杆菌卡介苗，将平板在37°C下孵育1周；对于耻垢分枝杆菌菌株，孵育时间为24小时。通过加入无菌的刃天青（10μl，0.025%[wt/vol]），孵育混合物，并使用帝肯Infinite M200酶标仪通过荧光（激发波长560nm；发射波长590nm）测量刃天青的周转率来测定细菌存活率。

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DprE1检测。[2]
C387G和C387S突变DprE1蛋白是使用pET28a-M.结核病DprE1质粒和QuikChange定点突变试剂盒（安捷伦）产生的，引物为5′-GGGCTGGAACATCGCGTCGACTTCCC-3′和3′-CCGACCTTGTAGCGCGCGCGAGGGG-5′（C387G）和5′-GGCTCGGAACATCACGTCGATCTCTCCCC-3′以及3′-CCGCTTGTCGCGCGCTGAGGG-5’（G387S）（突变碱基用下划线标出）。如别处所述，表达和纯化野生型结核分枝杆菌DprE1和突变酶。 DprE1的50%抑制浓度（IC50）如前所述，使用Amplex Red/辣根过氧化物酶偶联测定法，以法尼烷基磷酰-β-d-呋喃核糖（FPR）为底物。在30°C下，在Tecan M200阅读器上以动力学模式进行荧光测量（激发波长，560 nm；发射波长，590 nm）。使用不含抑制剂的阴性对照样品，从测量的速率中减去背景速率（未添加FPR）。使用Prism通过将抑制剂浓度（log[I]）和归一化反应（V）拟合到方程V=100/{10[（logIC50−log[I]h]}来确定IC50，其中h是DprE1的Hill系数。

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体外代谢稳定性。[2]
使用小鼠和人肝微粒体测定化合物的固有清除率（CLint）。简而言之，将100μg小鼠（CD-1）或人肝微粒体（均来自Invitrogen）混合在0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中，该缓冲液含有1μl以100μg/ml溶解在DMSO中的化合物，最终体积为50μl。同时，在0.1M磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中制备NADPH再生系统。在37°C下将两种溶液（每种溶液50μl；最终化合物浓度1μg/ml）混合，开始内在清除率评估之前，将溶液在37°C下预孵育10分钟。0、5、10、15、30和60分钟后，将100μl反应混合物转移到100μl乙腈中，并将混合物置于冰上30分钟，以使蛋白质完全沉淀，从而终止反应。然后将样品在12000×g下离心10分钟，将上清液注入高效液相色谱（HPLC）柱，以定量随时间推移残留的母体化合物的量。卡马西平（1μg/ml）用作低内在清除率的对照。

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MIC/MBC测定。[3]
根据设置和要求，使用BACTEC TB系统、微量肉汤稀释法、比例法或刃天青还原法测定抗结核药物的MIC。MIC被定义为阻止99%细胞生长的最低药物浓度，MBC被定义为防止在固体培养基上形成集落的最低浓度。一般来说，BTZ的MIC和MBC几乎相同。

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转录组学。[3]
结核分枝杆菌H37Rv在37˚C下在添加了0.05%吐温80和白蛋白-葡萄糖过氧化氢酶（ADC）的Middlebrook 7H9肉汤中生长到对数中期，并与载体对照一起暴露于30 ng/ml的BTZ043中4小时。使用Mangan等人开发的GTC/Trizol方法提取分枝杆菌RNA，并使用RNeasy柱处理和纯化DNase。圣乔治大学细菌微阵列小组生成的结核分枝杆菌全基因组微阵列被用于分析结核分枝杆菌对BTZ的反应。如前所述，使用结核分枝杆菌基因组DNA作为共同参考进行杂交。BTZ处理和对照培养物的三个生物复制品进行了两次杂交。使用Affymetrix 428阵列扫描仪（MWG）在对应于Cy3和Cy5激发最大值的532 nm和635 nm下顺序扫描杂交载玻片。使用Imagene 5.5计算图像中的比较斑点强度，并将其导入GeneSpring GX 7.2进行进一步分析。阵列数据被归一化为阵列上检测到的所有基因的第50个2百分位，并被过滤以仅包括标记为存在于80%阵列上的基因。使用t检验（Benjamini和Hochberg多重检验校正后的p值<0.05）和倍数变化>1.5，在对照组和BTZ治疗的结核分枝杆菌之间鉴定出显著差异表达的基因。超几何概率（p值<0.001）用于识别从先前发表的数据集中得出的类似药物暴露特征。完全注释的微阵列数据已保存在BµG@Sbase和ArrayExpress中。

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蛋白质组学。[3]
结核分枝杆菌H37Rv在三次重复培养中生长至OD580 0.3-0.4，有或没有20 ng/ml的BTZ043，并在培养48小时后通过离心收获。细菌沉淀在PBS中洗涤两次，重新悬浮在10 mM Tris、250 mM蔗糖缓冲液（pH 7.0）中，并使用迷你打珠器用玻璃珠破碎。将裂解物无菌过滤，用2-D Quant试剂盒测定蛋白质浓度。使用2-D Clean up试剂盒制备60µg每种裂解物用于2-D荧光差异凝胶电泳（2-D DIGE），并将其溶解在30 mM TRIS、7 M尿素、2 M硫代尿素、4%CHAPS、pH 8.5中。根据制造商的说明进行Cy2、Cy3和Cy5的最小标记，并如前所述进行2-D电泳。每个二维凝胶包括一个对照和一个经BTZ043处理的样品，以及一个Cy2标记的内标（实验中所有样品的池），以校正凝胶间的变化。电泳后，在Typhoon 9410凝胶成像仪上扫描凝胶，并用Image Master Platinum 2.0软件分析斑点图像。使用Cy2标记的标准品通过默认归一化算法进行归一化，并选择显示超过2倍强度差的斑点进行识别。随后对2-D DIGE凝胶进行银染，切除相关斑点并通过MALDI-TOF MS进行鉴定。BTZ处理后蛋白质组的比较分析显示了几种蛋白质水平的变化。INH诱导蛋白IniB（Rv0341）和富马酸水解酶（Rv1098c）的丰度持续增加，而两种保守的假设蛋白（Rv0831c、Rv3716c）和输出蛋白Apa（富含丙氨酸和脯氨酸的蛋白，Rv1860）、PepA（丝氨酸蛋白酶，Rv0125）、MPT64（Rv1980c）、抗原85B（Rv1886c）和MPT51（Rv3803c）的丰度降低。这些变化大多反映了转录组学检测到的变化，是细胞壁损伤的标志。

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电影S1[3]
暴露于BTZ043的BTZ敏感耻垢分枝杆菌菌株（野生型）的延时显微镜。在37˚C的连续流动微流体装置中培养细菌，并使用100X油浸物镜进行可视化。每隔15分钟采集一次图像。将细胞喂入标准7H9培养基14.5小时，然后暴露于0.1µg/ml（25X MIC）的BTZ043中74小时。这种处理导致大多数细菌溶解。然后将化合物洗掉，将剩余的细胞再喂入标准8H9培养基74小时（此处未显示）。在BTZ暴露后保持相密度的少数细胞在BTZ冲洗后没有恢复或恢复生长。当用耐BTZ的耻垢分枝杆菌菌株MN84进行该实验时，没有看到这些影响。

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电影S2[3]
暴露于BTZ043的BTZ敏感结核分枝杆菌菌株（H37Rv）的延时显微镜。在37˚C的连续流动微流体装置中培养细菌，并使用100X油浸物镜进行可视化。每隔2小时采集一次图像。将细胞喂入标准7H9培养基98小时，然后以0.2µg/ml的浓度暴露于BTZ043 240小时。然后冲洗掉化合物，将剩余的细胞喂入水平7H9培养基达265小时。这种处理导致大多数细菌裂解。BTZ暴露后仍保持GFP阳性（a）和相密（b）的少数细胞在BTZ冲洗后没有恢复生长。实验结束时，用碘化丙啶（PI）对剩余的细菌进行染色，PI选择性地对细胞壁完整性受损的细胞进行染色。大多数GFP阳性细菌也是PI阳性，这表明细胞壁渗透屏障已经破裂，这些细胞很可能已经死亡。

BTZ043对结核分枝杆菌 H37Rv 和耻垢分枝杆菌的 MIC 分别为 1 ng/mL (2.3 nM) 和 4 ng/mL (9.2 nM)。还测试了 BTZ043 针对 30 种巴西诺卡氏菌分离株的体外活性。 BTZ043 的 MIC50 和 MIC90 值为 0.125 和 0.25 μg/mL。 N. carnea ATCC 6847 的 MIC 为 0.003μg/mL，N. transvalensis ATCC 6865 的 MIC 为 0.003μg/mL，N. brasiliensis NCTC10300 的 MIC 为 0.03 μg/mL，N. brasiliensis HUJEG-1 的 MIC 为 0.125μg/mL 。结核分枝杆菌 H37Rv 的 MIC 值为 0.000976 μg/mL。 BTZ-043 对大肠杆菌 ATCC 25922 和金黄色葡萄球菌 ATCC 2921 的 MIC 值 >64 μg/mL。

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单细胞诺卡氏菌悬浮液的制备[1]
由于巴西猪笼草以丝状生长，因此按照之前发表的方法制备了单细胞悬浮液。巴西猪笼草HUJEG-1在沙氏琼脂上培养1周，然后在37°C的脑心浸液中在110 rpm的摇床中传代培养72小时。然后通过离心分离细菌团，用盐水洗涤四次。在Evelham-Potter装置中研磨后，将悬浮液以100×g离心两次；上清液为单细胞悬浮液。细菌浓度通过在含有5%羊血的BHI琼脂上平板测定，悬浮液在-70°C下储存在20%甘油中直至使用。

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THP-1巨噬细胞测定[1]
将人单核细胞系THP-1维持在补充有10%胎牛血清（FCS；Gibco BRL）和1 mM丙酮酸钠的RPMI 1640培养基中。为了将细胞转化为巨噬细胞，细胞在没有丙酮酸钠的情况下进行了四次传代培养。然后在血细胞计数器中测定细胞密度，并将细胞悬浮液按要求在补充了10%FCS和6.25 ng/mL佛波醇-12-肉豆蔻酸13-乙酸酯的完全RPMI 1640中稀释，以获得4 x 105个细胞/mL的密度。将1 mL等分的细胞悬浮液接种到24孔微孔板的每个孔中，每48小时用RPMI 1640洗涤细胞培养物两次，持续时间不超过4天。

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BTZ细胞内活性的测定[1]
所使用的技术之前已经发表过。简而言之，使用3:1的感染复数（MOI）来确定抗菌药物对诺卡氏菌细胞内生长的影响。感染单层两小时后，丢弃培养基，用pH 7.4的温PBS洗涤单层两次。在含有10%FCS的RPMI 1640中，以MIC的0.25X、1X、4X和16X添加PBTZ，并在37°C、5%CO2中孵育6小时。我们不能使用利福平作为细胞内活性对照，因为巴西猪笼草是一种天然耐药细菌。相反，我们使用了DA-7218，这是一种恶唑烷酮药物，以前对巴西猪笼草草具有良好的细胞内和体内活性。丢弃培养基，加入1 mL冷蒸馏水并孵育15分钟。为了释放细胞内细菌，通过上下移液数次破坏单层，并将悬浮液收集在1.5 mL Eppendorf管中。诺卡氏菌生长在BHI琼脂上定量。

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结核分枝杆菌H37Ra细胞对十异戊二烯基磷酰-β-d-核糖的差向异构化。[2]
收获6ml结核分枝杆菌H37Ra培养物的等分试样，其在600nm下的光密度（OD600）为1.31，并用缓冲液A（50mM MOPS[吗啉丙磺酸][pH 7.9]、10mM MgCl2、5mM 2-巯基乙醇）洗涤。将细胞（约30mg）在冰上与50μl缓冲液A、16nmol NADH和16μg PyrBTZ01或PyrBTZ02或2μg BTZ043在5μl二甲亚砜（DMSO）中孵育15分钟，最终体积为80μl。反应开始时加入15000dpm的5-磷酸-[14C]核糖1-二磷酸（P[14C]RPP），其由[14C]葡萄糖制备（比活性，290mCi/mmol），如别处所述。在37°C下孵育2小时后，用1.5 ml CHCl3/CH3OH（2:1）停止反应，并进行两相Folch洗涤。将有机相干燥并溶解在40μl CHCl3/CH3OH/H2O/NH4OH（65:25:3.6:0.5[vol/vol]）中；在CHCl3/CH3OH/NH4OH/1M乙酸铵/H2O（180:140:9:9:23[vol/vol]）中，通过硅胶板薄层色谱法分离25%的样品，并通过放射自显影法（Biomax MR-1胶片；柯达）进行可视化。使用ImageJ软件（NIH）量化条带的强度。

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细胞毒性研究。[2]
如前所述，测量化合物对两种人肝细胞系（HepG2和Huh7）、一种人肺上皮细胞系（A549）和一种人单核细胞系（THP-1）的细胞毒性。简而言之，在96孔微孔板中用化合物的连续稀释液（2倍稀释液；100至0.1μg/ml）孵育细胞（4000个细胞/孔）。在37°C下孵育3天后，通过在37°°C下加入刃天青4小时并使用帝肯Infinite M200酶标仪测量间苯二酚代谢物的荧光（激发波长为560 nm；发射波长为590 nm）来测定细胞存活率。对数据进行背景校正（无细胞对照），并表示为未处理细胞（仅细胞）值的百分比。

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BTZ的细胞内活性。[3]
将264.7个原始巨噬细胞（1.5 x 108个细胞）以1:1的MOI感染在300 ml RPMI 1640中的H37Rv-GFP，该RPMI 1640含有10%热灭活胎牛血清，在37°C下摇动（100 rpm）2小时。通过以1100rpm离心5分钟进行两次洗涤后，用1小时阿米卡星（20µM）处理杀死感染细胞悬浮液中剩余的细胞外杆菌。在最后的离心步骤后，用Wellmate将细胞分配到384孔Evotec板中，该板预先镀有10µl稀释在细胞培养基中的相应3种化合物。对于每种化合物，测试了一系列16倍的稀释液，一式四份。然后将感染细胞在化合物存在下在37°C、5%CO2下孵育5天。然后，巨噬细胞用SYTO 60染色，然后封板和图像采集。使用20X水物镜（NA 0.70）在自动荧光共聚焦显微镜OperaTM上记录共聚焦图像。使用488nm激光结合535/50nm检测滤光片检测分枝杆菌GFP，用635nm激光结合690/40nm检测滤光片（红色通道，Syto 60激发）鉴定用Syto 60标记的细胞。每个板孔记录四个独立的字段，然后使用专用的内部图像分析软件处理每个图像，以确定五个参数（细胞数、细胞表面、感染细胞数、绿色物体表面、与细菌载量相对应的感染细胞中的绿色表面）。简而言之，该算法首先使用别处描述的一系列处理步骤对红色通道上的细胞进行分割。对高于特定阈值的像素的绿色通道应用类似的分类来识别绿色物体。然后，感染细胞数量被定义为具有至少给定数量的像素（通常为3个）的细胞，这些像素在绿色通道中的强度高于阈值。绿色物体的表面与分枝杆菌的数量相关，其与总细胞数的比率称为细菌载量。高含量筛选的典型结果如图S1所示，其中可以看出，与阴性对照（DMSO）细胞或用相同浓度的氨基衍生物BTZ045处理的细胞相比，5天后，用BTZ043处理的巨噬细胞数量丰富，表达GFP的杆菌很少。

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DPA生产的体外检测。[3]
对于这些测定，酶活性膜、细胞壁富集组分和放射性标记底物（p[14C]Rpp）的制备以及反应混合物、培养条件和反应产物的分析基本上如前所述。在一些实验中，使用来自表达Rv3790和Rv3791的重组大肠杆菌菌株的无细胞提取物的约300µg蛋白质来催化反应。为此，以下大肠杆菌菌株用作Rv3790和4 Rv3791:1，C41（DE3）/pET28a的阴性对照或来源；2、C41（DE3）/pET28a-Rv3790-Rv3791；3、BL21（DE3）/pET28a；4、BL21（DE3）/pET28a-Rv3791；5、BL21（DE3）/pET15b；6、BL21（DE3）/pET15b-Rv3790，7，BL21（DE3）pLysS/pET32b；8，BL21（DE3）/pET32b-Rv3790，如图3的图例所示。

\n\n药物[1]
\nBTZ043 和 PBTZ169 悬浮于 0.25% 羟丙基甲基纤维素中。\n

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\n\nBTZ 的血浆定量[1]
\n为了定量小鼠血浆中的药物浓度，我们通过灌胃法给 8-12 周龄的雌性 BALB/c 小鼠服用 BTZ043， PBTZ169 或 SXT，剂量均为 100 mg/kg。分别于 0、20、40、60、120、240、360、480 和 600 分钟采集眶周静脉丛血样。采用本实验室开发的高效液相色谱法分析 BTZ043、BTZ 169 和 SXT 的浓度。\n

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\n\n小鼠疗效[1]
\n8 至 12 周龄的雌性 BALB/c 小鼠感染巴西尼氏线虫 HUJEG-1 株。实验性真菌瘤的制备方法为：将 20 mg（湿重）巴西尼氏线虫悬液注射到小鼠左后足垫，具体方法如前所述[14]。四周后开始治疗。每组 15 只小鼠进行测试。一组动物灌胃给予生理盐水作为阴性对照。其余动物分别接受 PBTZ169、BTZ043 或 SXT 治疗，剂量为 100 mg/kg，每日两次，灌胃给药，持续 10 周。后者作为实验治疗的阳性对照。休息 2 周后，继续给药 6 周。由一位不知晓分组情况的阅片者使用先前发表的评分标准评估药物对真菌瘤病变发展的影响。采用方差分析确定各组与灌胃生理盐水对照组之间的潜在差异。\n

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\n\n小鼠药代动力学研究[2]
\nPyrBTZ01 (50 mg/kg) 以 5 mg/ml 的浓度溶于 0.5% 羧甲基纤维素 (CMC) 水溶液中，每个时间点使用三只 BALB/c 小鼠进行灌胃给药。在每个时间点（0、15、30、60、120、240 和 480 分钟），通过心脏穿刺处死小鼠并采集血液。将血液样本在 4°C 下以 2200 × g 离心 10 分钟分离血浆，并用液氮速冻，储存于 -80°C 冰箱中，用于后续的质谱 (MS) 分析。使用不同浓度 PyrBTZ01 在小鼠血清中的外标曲线进行定量分析。超高效液相色谱 (UPLC) 分离采用安捷伦 1290 Infinity 液相色谱 (LC) 系统，该系统包括带有集成脱气机的 1290 Infinity LC 系统二元泵、高性能自动进样器和恒温柱室。将样品（2 μl）注入 Zorbax Extend-C18 分析柱（2.1 mm × 50 mm；粒径 1.8 μm），柱温 40°C，流动相 A 为 H₂O/0.1% HCOOH，流动相 B 为 CH₃CN/0.1% HCOOH，流动相 B 的比例在 5 分钟内从 2% 线性增加至 100%，流速为 0.4 ml/min。所有样品均进行重复分析。UPLC 系统与 6530 型高精度四极杆飞行时间 (Q-TOF) 液质联用系统联用。采用电喷雾电离 (ESI) 质谱法，在正离子模式下采集 m/z 100 至 1000 的质量范围，采集速率为 2 个谱图/秒。实验参数设置如下：碎片电压 190 V；毛细管电压 3500 V；气体温度为 300°C；鞘气温度为 350°C。使用 ESI-L 溶液对仪器进行外部校准。数据使用 MassHunter 定量分析合规性软件进行处理。对 m/z 432.0835（4.24 分钟洗脱）处的离子提取离子色谱图 (EIC) 进行积分，并使用小鼠血清中 PyrBTZ01 的外部校准曲线进行定量。\n

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\n\n体内疗效研究。[2]
\n雄性 BALB/c 小鼠（5 至 6 周龄）通过尾侧静脉注射 5 × 10⁶ CFU 的结核分枝杆菌 H37Rv 进行感染（每组 10 只小鼠）。感染后第8天开始治疗，每周5天灌胃给予PyrBTZ01（50 mg/kg）或异烟肼（25 mg/kg），持续4周。一组未经治疗的小鼠作为对照组。处死小鼠后，取出肺组织并匀浆，然后稀释后接种于杜氏琼脂平板上。若小鼠在实验结束前死亡，则立即进行肺组织菌落形成单位（CFU）计数。平板在37℃培养24天，测定肺组织中的CFU数量。

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\n\nBTZ在慢性模型中的疗效。[3]
\n在标准小鼠感染模型中测定动物疗效。BALB/c小鼠通过气溶胶感染低菌量（约200 CFU）的结核分枝杆菌H37Rv。感染后4周开始治疗。小鼠通过灌胃法给予每公斤体重 37.5 或 300 mg 的 BTZ，溶于 0.25% 的羧甲基纤维素制剂中，每日一次，每周六次，持续四周。对照组和治疗组小鼠均被处死，取肺组织进行药代动力学分析。[3] 灌胃给药后，BTZ043 在小鼠血清中的半衰期 > 2 小时，达峰时间 > 0.5 小时，血药浓度峰值 (Cmax) = 2 µg/ml，曲线下面积 (AUC) = 4.6 (h*µg/ml)。

配制成羧甲基纤维素制剂 (0.25%)；7.5，或 300 mg/kg；每日一次口服

BALB/c 小鼠通过气溶胶感染低菌载量（~200 CFU）的结核分枝杆菌 H37Rv。

药物血浆浓度[1]
BTZ043 此前已发表过小鼠血浆浓度数据。在 100 mg/kg 的剂量下，其血浆浓度达到 4.06 μg/mL（Tmax 为 40 分钟），与我们观察到的血浆浓度非常相似（图 2）。PBTZ169 的 Cmax 为 1.74 μg/mL，Tmax 为 40 分钟（图 3）。图 3 中还展示了 SXT 在 100 mg/kg 剂量下的血浆浓度，其在给药后 40 分钟达到最大浓度 553.88 μg/mL。t½ 为 1.66 小时，AUC 为 1507.69 mg/L·h。

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PyrBTZs 和 BTZ043 具有相似的吸收-分布-代谢-排泄/毒性 (ADME/T) 特性。[2]
PyrBTZ01 和 PyrBTZ02 与 BTZ043 平行测试了其对四种人细胞系（肝癌 HepG2、肝癌 Huh7、肺上皮细胞 A549 和单核细胞 THP-1）的细胞毒性（50% 毒性剂量 [TD50]）（表 3）。两种化合物的细胞毒性均低于 BTZ043，其中 PyrBTZ02 的细胞毒性最低。BTZ043 由于其极低的 MIC 值而具有最高的选择性指数 (SI)，其次是 PyrBTZ02 和 PyrBTZ01（表 3）。如先前报道的 BTZ043 和 PBTZ169 一样，PyrBTZ01 和 PyrBTZ02 在 SOS 染色体试验中均未表现出致突变性。
接下来，我们使用小鼠和人肝微粒体，平行评估了 PyrBTZ01 和 PyrBTZ02 与 BTZ043、PBTZ169 和卡马西平（低 CLint 对照化合物）的体外代谢稳定性（固有清除率 [CLint]）。在小鼠和人肝微粒体存在下，PyrBTZ01 和 PyrBTZ02 的 CLint 值均处于中间水平（表 4），且与 BTZ043 和 PBTZ169 的 CLint 值相似，表明小鼠体内化合物暴露量合理。
为了证实这一点，我们对BALB/c小鼠进行了PyrBTZ01的体内药代动力学(PK)研究，小鼠单次口服50 mg/kg剂量。比较PyrBTZ01及其类似物BTZ043在25 mg/kg剂量下的PK曲线（图4）显示，PyrBTZ01和BTZ043的半衰期相似，约为100分钟。PyrBTZ01的最大浓度(Cmax)（约3,500 ng/ml）高于BTZ043（1,923 ng/ml），这很可能是由于前者给药剂量较高所致，而非吸收率更高。

随后，我们采用高内涵筛选方法，在离体模型中检测了BTZ化合物的摄取、细胞内杀菌活性和潜在细胞毒性，以监测感染表达GFP的结核分枝杆菌的巨噬细胞。与氨基衍生物BTZ045或阴性对照[二甲基亚砜(DMSO)]处理的巨噬细胞相比，BTZ043处理的巨噬细胞受到保护（图S2）。BTZ043的MIC₅₀<10 ng/ml，表明该化合物对细胞内细菌的活性强于异烟肼(INH)（100 ng/ml）和利福平(>1 μg/ml)（图1C）。相比之下，氨基代谢物BTZ045的MIC>1 μg/ml，这与体外实验结果一致（表S1）。作为抗菌作用的直接相关因素，当所有化合物的剂量远高于最低抑菌浓度 (MIC) 时，均观察到大量巨噬细胞存活。在最高测试浓度 (10 μg/ml) 下，BTZ043 的细胞毒性高于异烟肼 (INH)（图 1C），但其选择性指数仍然高达 100 以上。其他体外毒理学测试未发现特别不利的影响（表 S4）。[3]

[1]. PLoS Negl Trop Dis.2015 Oct 16;9(10):e0004022

[2]. Antimicrob Agents Chemother.2015 Aug;59(8):4446-52.

[3]. Science. 2009 May 8;324(5928):801-4.

背景：足菌肿是一种被忽视的慢性致畸性感染性疾病，由真菌和放线菌引起。在墨西哥，巴西诺卡氏菌是主要的致病菌。由于目前的药物治疗方案存在诸多不足，因此亟需寻找替代疗法。苯并噻嗪酮类药物（BTZ）是一类新型候选药物，可抑制癸烯基磷酸核糖差向异构酶（DprE1），该酶是棒状杆菌细胞壁生物合成的关键酶。
方法/主要发现：本研究测试了新一代 BTZ 类药物 PBTZ169 对 30 株巴西诺卡氏菌分离株的体外活性。PBTZ169 的 MIC50 和 MIC90 值分别为 0.0075 和 0.03 μg/mL。由于诺卡氏菌是一种潜在的细胞内细菌，因此用巴西诺卡氏菌HUJEG-1感染THP-1巨噬细胞单层，然后用PBTZ169处理，结果发现浓度为体外浓度的0.25倍时，菌落形成单位（CFU）数量减少。在感染雌性BALB/c小鼠右后腿食垫后，评估了其体内活性。6周后，开始用PBTZ169治疗，并将其活性与第一代化合物BTZ043进行比较。两种BTZ化合物均以100 mg/kg的剂量，每日两次灌胃给药，并以100 mg/kg的磺胺甲噁唑/甲氧苄啶（SXT）作为阳性对照。治疗22周后，仅PBTZ169和SXT显示出统计学意义上的显著活性。结论：这些结果表明，DprE1抑制剂可能有助于治疗诺卡氏菌感染，因此可能对其他放线菌病原体也有效。我们必须测试这些化合物与其他抗菌药物（如利奈唑胺、替地唑胺或复方新诺明）联合用药的效果，这些药物具有良好至优异的体内活性，同时我们还需要测试能够达到更高血浆浓度的新型DprE1抑制剂。[1] 8-硝基苯并噻嗪酮类化合物（BTZs），例如BTZ043和PBTZ169，可抑制十异戊二烯磷酸-β-D-核糖2'-氧化酶（DprE1），并在体外对结核分枝杆菌表现出纳摩尔级的杀菌活性。结构-活性关系 (SAR) 研究表明，BTZ 骨架的 8-硝基对其作用机制至关重要，该机制涉及与 DprE1 活性位点中的 Cys387 形成半巯基键。迄今为止，8-硝基的取代已导致抗分枝杆菌活性的大幅丧失。本文报道了吡咯-苯并噻嗪酮类化合物 PyrBTZ01 和 PyrBTZ02 的合成和表征，这两种非硝基苯并噻嗪酮类化合物保留了显著的抗分枝杆菌活性，对结核分枝杆菌的最低抑菌浓度 (MIC) 为 0.16 μg/ml。这些化合物对 DprE1 的抑制浓度 (IC50) 值小于 8 μM，并表现出良好的体外吸收-分布-代谢-排泄/毒性 (ADME/T) 和体内药代动力学特征。最有前景的化合物 PyrBTZ01 在急性结核病小鼠模型中未显示出疗效，这表明 BTZ 通过抑制 DprE1 发挥杀菌作用需要共价键形成和化合物效力的共同作用。[2]

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对抗结核病 (TB) 大流行需要新的药物。本文描述了 1,3-苯并噻嗪-4-酮 (BTZ) 的合成和表征，这是一类新型抗分枝杆菌药物，可在体外、离体和结核病小鼠模型中杀灭结核分枝杆菌。利用遗传学和生物化学方法，我们鉴定出十异戊二烯磷酸-β-D-核糖 2'-差向异构酶是 BTZ 的主要靶点。抑制这种酶活性可消除十异戊二烯磷酸阿拉伯糖的形成，而十异戊二烯磷酸阿拉伯糖是合成细胞壁阿拉伯聚糖的关键前体，从而导致细胞裂解和细菌死亡。最先进的化合物BTZ043有望纳入药物敏感性结核病和广泛耐药结核病的联合治疗方案中。[3]

C17H16F3N3O5S

431.39

431.076

C, 47.33; H, 3.74; F, 13.21; N, 9.74; O, 18.54; S, 7.43

1161233-85-7

BTZ043 Racemate;957217-65-1; 1161233-85-7 (S-isomer)

42609849

Light yellow to yellow Solid powder

1.7±0.1 g/cm3

547.6±60.0 °C at 760 mmHg

285.0±32.9 °C

0.0±1.5 mmHg at 25°C

1.666

2

125.72

0

9

1

29

720

1

S1C2C(=C([H])C(C(F)(F)F)=C([H])C=2C(N=C1N1C([H])([H])C([H])([H])C2(C([H])([H])C1([H])[H])OC([H])([H])[C@]([H])(C([H])([H])[H])O2)=O)[N+](=O)[O-]

GTUIRORNXIOHQR-VIFPVBQESA-N

InChI=1S/C17H16F3N3O5S/c1-9-8-27-16(28-9)2-4-22(5-3-16)15-21-14(24)11-6-10(17(18,19)20)7-12(23(25)26)13(11)29-15/h6-7,9H,2-5,8H2,1H3/t9-/m0/s1

(S)-2-(2-methyl-1,4-dioxa-8-azaspiro[4.5]decan-8-yl)-8-nitro-6-(trifluoromethyl)-4H-benzo[e][1,3]thiazin-4-one

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : 13.3~22 mg/mL ( 30.83~50.99 mM)

配方 1 中的溶解度: 2.5 mg/mL (5.80 mM) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液；超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: 2.5 mg/mL (5.80 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.80 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 10% DMSO+40% PEG300+5% Tween-80+45% Saline: 2.5 mg/mL (5.80 mM)

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。