CeMMEC1

TAF1(2) ( Kd = 1.8 μM ); TAF1 ( IC50 = 0.9 μM )
TAF1 (second bromodomain, TAF1(2)) - dissociation constant (Kd) = 1.8 μM (determined by isothermal titration calorimetry); IC50 = 0.9 μM (determined by FRET displacement of tetraacetylated H4 peptide) [1]
CREBBP (bromodomain) [1]
EP300 (bromodomain) [1]
BRD9 (bromodomain) [1]

CeMMEC1 是一种 BRD4 抑制剂，对 TAF1 具有高亲和力，其 IC50 为 0.9 μM，Kd 为 1.8 μM (2)，此外，它还对 BRD9、EP300 和 CREBBP 溴结构域具有很强的亲和力。CeMMEC1 在 1、10 和 20 μM 的剂量下可减少 S 期 THP1 细胞的数量。此外，CeMMEC1 可诱导细胞凋亡。当 CeMMEC1 与 (S)-JQ1 联合使用时，单独使用 CeMMEC1 可显著降低细胞活力[1]。

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CeMMEC1 (10 μM) 在 AlphaLISA 检测中不与 BRD4 的第一个或第二个溴结构域结合；在BromoScan分析中，它对CREBBP、EP300、BRD9和TAF1(2)的溴结构域表现出高亲和力[1]。
CeMMEC1剂量依赖性地降低野生型KBM7细胞中MYC mRNA的表达水平，使其达到与(S)-JQ1相当的水平（图2c；未提供具体数值）[1]。
在THP1人急性单核细胞白血病细胞中，CeMMEC1在48小时后导致S期细胞数量明显且呈剂量依赖性减少（表明G1期阻滞），并在72小时后诱导细胞凋亡（Annexin V染色）。在相同浓度下，其效力低于 (S)-JQ1，但高于 CeMMEC2（未给出具体百分比）[1]。
在 REDS3 细胞中敲低 TAF1 可增加 RFP 阳性细胞核的数量，而敲低 CREBBP、EP300 或 BRD9 则不会，这证实了 TAF1 是 CeMMEC1 激活报告基因效应的主要介质[1]。
在 10 μM 浓度下，CeMMEC1 对 97 种代表性激酶的抑制率均未超过 60%，表明其具有溴结构域特异性[1]。

表观遗传结合域试剂盒 B 用于 TAF1 结合实验。该实验利用 HTRF 结合链霉亲和素偶联受体和 Eu³⁺ 偶联 GST 抗体供体，将乙酰化生物素肽从 GST 标签的 TAF1 蛋白上置换下来，以此来检测结合情况。使用 Echo 525 液体处理工作站，将化合物 (CeMMEC1) 分装到 ProxiPlate-384 Plus 检测板中。结合实验体系包含 5 nM TAF1-GST、50 nM 肽 (SGRGK (ac)GGK (ac)GGAK (ac)RHRK (生物素)-酸)、6.25 nM 链霉亲和素-XL665、1:200 抗 GST-Eu³⁺ 隐蔽抗体和 0.1% DMSO，最终反应体积为 20 μL。使用 Multidrop 组合装置，将检测试剂加样至微孔板中，并在室温下静置 3 小时。使用配备 HTRF 模块和双发射方案的 PHERAstar 微孔板读数仪测量荧光强度（A = 320 nm 激发，665 nm 发射；B = 320 nm 激发，620 nm 发射）。通过处理原始数据获得 HTRF 比值（通道 A/B × 10,000），并用于绘制 IC50 曲线[1]。

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AlphaLISA 免疫测定法用于检测 BRD4 溴结构域：生物素化的组蛋白肽底物被链霉亲和素-供体磁珠捕获；GST 标签的溴结构域与抗 GST-受体磁珠结合。680 nm 激发光触发单线态氧转移，仅当供体和受体之间的距离在 200 nm 以内时才会产生 615 nm 的光发射。阻断组蛋白对接的化合物（10 μM）会降低发射强度。使用 BRD4(BD1) 和 BRD4(BD2) 抑制剂筛选试剂盒，按照制造商的方案进行检测。对于全长 GST-BRD4，使用乙酰化底物的混合物。IC50 值通过两倍系列稀释（12 个浓度点，50 μM 至 0.02 μM）测定 [1]。
BromoScan 分析：CeMMEC1 (10 μM) 与代表性溴结构域蛋白的结合，以乙酰化底物结合抑制百分比来衡量 [1]。
TAF1(2) 的等温滴定量热法 (ITC)：在 293.15 K 下，使用 VP-ITC 微量热仪进行实验，搅拌速度为 286 rpm。蛋白质溶液 (295 μM) 置于注射器中，化合物溶液 (25 μM) 置于反应池 (2 ml) 中。初始注射 2 μl，随后进行 34 次注射，每次 8 μl（每次注射持续 16 秒，间隔 240 秒）。使用 MicroCal ORIGIN 软件，采用单结合位点模型分析数据；排除第一个数据点。Kd = 1.8 μM [1]。
基于 FRET 的 TAF1 结合分析（EPlgeneous Binding Domain kit B）：使用 Eu³⁺ 标记的 GST 抗体供体和链霉亲和素标记的受体，通过 HTRF 测量乙酰化生物素肽从 GST 标签的 TAF1 上的置换。最终体积为 20 μl，包含 5 nM TAF1-GST、50 nM 肽（SGRGK(ac)GGK(ac)GLGK(ac)GGAK(ac)RHKR(生物素)-酸）、6.25 nM 链霉亲和素-XL665、1:200 抗-GST-Eu³⁺ 隐蔽物和 0.1% DMSO。室温孵育 3 小时；使用 PHERAstar 微孔板读数仪测量荧光（激发波长 320 nm，发射波长 665 nm 和 620 nm）。 HTRF 比值 (665/620 × 10,000) 用于生成 IC50 曲线 (0.9 μM) [1]。
TAF1(2) 溴结构域（氨基酸残基 1501-1634）的蛋白表达和纯化：克隆至 pNIC28-Bsa4 载体，在含有卡那霉素和氯霉素的 Terrific 培养基中培养的大肠杆菌 BL21(DE3)-R3-pRARE2 细胞中表达。用 0.2 mM IPTG 在 18 °C 下诱导 16 小时。用 20 mM Hepes（pH 7.5）、500 mM NaCl、10 mM 咪唑、5% 甘油和 0.2 mM TCEP 裂解细胞；离心去除细胞碎片。将上清液上样至镍柱，用咪唑梯度洗脱；用 TEV 蛋白酶去除标签。未标记的蛋白质通过尺寸排阻色谱法（HiLoad 16/60 Superdex 75）进一步纯化。GST标记的TAF1(2)使用谷胱甘肽琼脂糖柱纯化，并用50 mM Tris pH 8、10 mM还原型谷胱甘肽洗脱；最后在Superdex 200上进行凝胶过滤。通过LC/MSD TOF确认质量和纯度[1]。

MYC癌基因等靶基因的转录激活依赖于含有溴结构域的BET家族蛋白，这些蛋白能够检测组蛋白赖氨酸的乙酰化。BET结构域的药理学抑制剂为多种恶性肿瘤的治疗提供了潜在优势。我们开展了一项高多样性化合物筛选，旨在寻找能够改变人细胞中通用报告基因BRD4依赖性异染色质化的药物。除了靶向BRD4的新化合物和已知化合物外，我们还发现了一些无需直接结合即可模拟BRD4抑制的小分子。其中一种物质是TAF1第二个溴结构域的强效抑制剂。通过使用这种抑制剂，我们能够确定 TAF1 与 BRD4 协同作用，调控癌细胞的生长，这使得 TAF1 成为 MYC 驱动型癌症中理想的表观遗传靶点。

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REDS3 细胞检测（报告基因）：将 REDS3 细胞（KBM7 衍生细胞，RFP 整合于异染色质位点）接种于透明平底 96 孔或 384 孔板中，并用化合物处理 24 小时。使用 Operetta 高内涵筛选系统（20 倍物镜，非共聚焦模式）进行活细胞成像。使用 Harmony 软件检测并定量 RFP 阳性细胞核（KBM7 细胞核直径约为 13 μm）。 CeMMEC1 诱导 RFP 阳性细胞呈剂量依赖性增加（补充图 3d,e）[1]。
细胞周期分析：用 CeMMEC1 处理 THP1 细胞 48 小时，用 70% 乙醇固定 24 小时，用 PBS/0.1% Tween 洗涤，用 RNase 孵育 20 分钟，用 5 μg/ml 碘化丙啶染色 10 分钟，并通过 FACS（BD FACSCalibur）进行分析。观察到S期细胞减少[1]。
细胞凋亡检测：用CeMMEC1处理THP1细胞72小时，用Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒染色，并使用Harmony软件对细胞核和细胞质进行定量分析[1]。
MYC表达的qPCR：用TRIzol提取RNA，用High Capacity cDNA试剂盒进行反转录。使用Power SYBR Green Master mix和MYC引物（正向引物：GAAGGTGATCGACAGTCTFACCT，反向引物：CTTCTCTCCGTCCTCGAGTTCT）进行qPCR。以肌动蛋白或GAPDH为内参进行标准化，采用ΔΔCT法进行相对定量。 CeMMEC1在KBM7细胞中呈剂量依赖性地降低了MYC mRNA的表达[1]。
基因敲低实验：用针对TAF1、CREBBP、EP300和BRD9的shRNA转染REDS3细胞。通过Western blot验证基因敲低（抗体：Taf1 sc-735，BRD9 ab49313）。通过活细胞成像定量RFP阳性细胞核（每组≥1500个细胞）。TAF1敲低增加了RFP阳性细胞的数量，而CREBBP、EP300或BRD9敲低则没有增加RFP阳性细胞的数量[1]。

BY NA

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[1]. Mapping the chemical chromatin reactivation landscape identifies BRD4-TAF1 cross-talk. Nat Chem Biol. 2016 Jul;12(7):504-10.

CeMMEC1是一种N-甲基异喹啉酮衍生物。合成了28个类似物（13-40），并测试了它们对RFP的激活作用以及与BRD4(1)、CREBBP和TAF1(2)的结合能力。二氢苯并二氮杂环庚酮核心上的取代会影响活性，这与分子对接模型（补充图6a）一致[1]。
使用ATAD2溴结构域（PDB 4qst）的模板，将CeMMEC1分子对接至TAF1(2)晶体结构（PDB 3uv4），预测了内酰胺羰基与N1604之间以及通过保守水分子与Y1561之间形成氢键[1]。
CeMMEC1的结构与(S)-JQ1和其他BRD4抑制剂不同；它被鉴定为一种功能性 BRD4 抑制剂，它不直接与 BRD4 结合，而是通过 TAF1 发挥作用 [1]。
联合治疗：同时抑制 BRD4（使用 (S)‑JQ1）和 TAF1（使用 CeMMEC1 或其类似物）在降低 H23 肺癌细胞的细胞活力和增加 REDS3 报告基因中 RFP 阳性细胞方面显示出协同作用（图 4e,f）[1]。

C19H16N2O4

336.341344833374

336.11

C, 67.85; H, 4.80; N, 8.33; O, 19.03

440662-09-9

440662-09-9

24152379

White to off-white solid powder

1.4±0.1 g/cm3

590.1±50.0 °C at 760 mmHg

310.7±30.1 °C

0.0±1.7 mmHg at 25°C

1.673

2.69

67.9

1

4

2

25

576

0

O1CCOC2C=CC(=CC1=2)NC(C1=CN(C)C(C2C=CC=CC1=2)=O)=O

PEOQAZBGLOADFJ-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C19H16N2O4/c1-21-11-15(13-4-2-3-5-14(13)19(21)23)18(22)20-12-6-7-16-17(10-12)25-9-8-24-16/h2-7,10-11H,8-9H2,1H3,(H,20,22)

N-(2,3-dihydro-1,4-benzodioxin-6-yl)-2-methyl-1-oxoisoquinoline-4-carboxamide

Ce MMEC1; Ce-MMEC1; CeMMEC1

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.43 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入900 μL 玉米油中，混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。