CHIR-090

Escherichia coli LpxC(Ki= 4 nM)
CHIR-090 targets UDP-3-O-(R-3-hydroxymyristoyl)-N-acetylglucosamine deacetylase (LpxC) (Ki = 0.3 nM for Escherichia coli LpxC, IC50 = 1.8 nM for Pseudomonas aeruginosa LpxC) [1]
CHIR-090 targets LpxC (time-dependent inhibitor, Ki = 0.012 nM for Escherichia coli LpxC) [2]
CHIR-090 targets LpxC (MIC = 0.25 μg/mL for planktonic Pseudomonas aeruginosa, MBIC90 = 4 μg/mL for Pseudomonas aeruginosa biofilm) [3]

体外活性：CHIR-090是一种新型N-芳酰基-L-苏氨酸异羟肟酸，是一种高效、缓慢、紧密结合的超嗜热菌Aquifex aeolicus LpxC脱乙酰酶抑制剂，对铜绿假单胞菌具有优异的抗生素活性和大肠杆菌，通过纸片扩散测定来判断。 CHIR-090 也是大肠杆菌 LpxC 的两步缓慢紧密结合抑制剂，Ki = 4.0 nM、Ki* = 0.5 nM、k5 = 1.9 min-1 和 k6 = 0.18 min-1。低纳摩尔水平的 CHIR-090 可抑制多种革兰氏阴性病原体的 LpxC 直系同源物，包括铜绿假单胞菌、脑膜炎奈瑟菌和幽门螺杆菌。相比之下，CHIR-090 是来自豆根瘤菌 (Ki = 340 nM) 的 LpxC 的相对较弱的竞争性常规抑制剂（缺乏缓慢、紧密的结合动力学），豆根瘤菌是一种对此化合物具有抗性的革兰氏阴性植物内共生体。激酶测定：进行纸片扩散，不同的是每个过滤器使用 10 μg 的每种抗生素化合物。存在 CHIR-090 的液体培养基中的生长评估如下：将过夜培养的细胞接种到 A600 为 0.02 的 50 mL LB 肉汤中，并在 30°C 下振荡生长。当 A600 达到 0.15 时，用 6 μL 500 μg/mL CHIR-090 的 DMSO 溶液或 6 μL DMSO 处理平行培养物。为了评估累积生长，每当 A600 达到 0.4 时，通过将培养物稀释 10 倍到含有相同浓度 DMSO 或 DMSO/CHIR-090 的预热培养基中，使培养物保持对数生长期。最低抑菌浓度定义为当以A600=0.01的起始密度接种时，在含有1%DMSO（v/v）的LB培养基中观察不到可测量的细菌生长的最低抗生素浓度。在 CHIR-090 存在的情况下，将培养物在 30°C 下振荡孵育 24 小时。实验进行三次细胞测定：低 nM 水平的 CHIR-090 抑制来自多种革兰氏阴性病原体的 LpxC 直系同源物，包括铜绿假单胞菌、脑膜炎奈瑟菌和幽门螺杆菌。相比之下，CHIR-090 是来自豆根瘤菌 (Ki=340 nM) 的 LpxC 的相对较弱的竞争性常规抑制剂（缺乏缓慢、紧密的结合动力学），豆根瘤菌是一种对此化合物具有抗性的革兰氏阴性植物内共生体。染色体 lpxC 基因被豆科菌 lpxC 取代的大肠杆菌构建体对 CHIR-090 的抗性高达 100 μg/mL，或比野生型大肠杆菌的最小抑制浓度高 400 倍。 CHIR-090，一种非常有效、缓慢、紧密结合的 Aquifex aeolicus LpxC 抑制剂，其序列与 E 31% 相同。大肠杆菌 LpxC。根据纸片扩散试验判断，CHIR-090 对大肠杆菌和铜绿假单胞菌具有显着的抗生素活性，与环丙沙星相当

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1. CHIR-090抑制大肠杆菌生长的MIC为0.06 μg/mL；经CHIR-090处理后，大肠杆菌中脂质A的生物合成呈剂量依赖性降低，该结果通过[³H]乙酸盐掺入脂质A的检测实验验证 [1]
2. CHIR-090可快速耗竭大肠杆菌中的脂质A（暴露后15分钟内），同时伴随LpxC底物UDP-3-O-(R-3-羟豆蔻酰)-N-乙酰葡萄糖胺的累积以及下游脂质A前体的减少 [1]
3. CHIR-090对大肠杆菌LpxC活性的抑制呈时间依赖性；其抑制效价随时间推移升高（kobs/[I] = 0.048 μM⁻¹s⁻¹），且在实验条件下该抑制作用不可逆 [2]
4. X射线晶体学分析显示，CHIR-090结合于LpxC的活性位点，与催化中心的锌离子形成共价加合物，并与活性位点中的保守残基（His79、Asp247）发生相互作用 [2]
5. CHIR-090对浮游态铜绿假单胞菌的抗菌活性MIC范围为0.125-0.5 μg/mL（MIC50 = 0.25 μg/mL）；其抑制铜绿假单胞菌生物被膜形成的MBIC50为2 μg/mL，MBIC90为4 μg/mL [3]
6. CHIR-090与粘菌素联用对浮游态铜绿假单胞菌表现出协同抗菌活性（FICI = 0.375-0.5），对铜绿假单胞菌生物被膜形成的抑制也具有协同效应（FICI = 0.375-0.75） [3]
7. CHIR-090降低预成型铜绿假单胞菌生物被膜活菌数的MBEC50为8 μg/mL，MBEC90为16 μg/mL；与粘菌素联用后MBEC值进一步降低（MBEC50 = 2 μg/mL，MBEC90 = 4 μg/mL） [3]

CHIR-090 是一种针对大肠杆菌的有效抗生素，可在低 nM 范围内抑制体外大肠杆菌 LpxC 活性。如果没有事先进行化学诱变，则不会观察到对 1 μg/mL CHIR-090 具有抗性的大肠杆菌 W3110 菌落。大肠杆菌 W3110 菌株能够在含有 1 至 10 μg/mL CHIR-090 的 LB 琼脂平板上生长，在我们的野生型大肠杆菌条件下，该浓度比 0.25 μg/mL 的 MIC 高 4 至 40 倍W3110。

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1. 在铜绿假单胞菌感染的小鼠急性肺炎模型中，腹腔注射CHIR-090（10 mg/kg，每8小时一次，持续3天）可使小鼠肺部细菌载量降低1.5 log10 CFU/g；与粘菌素（2.5 mg/kg，每8小时一次，持续3天）联用后，肺部细菌载量降低2.5 log10 CFU/g，展现出体内协同疗效 [3]

已完成纸片扩散，但每个过滤器含有 10 μg 的每种抗生素化合物。将过夜培养的细胞接种到 A600 为 0.02 的 50 mL LB 肉汤中，并在 30°C 下振荡生长，以评估在 CHIR-090 存在的液体培养基中的生长情况。一旦 A600 达到 0.15，将 6 μL 500 μg/mL CHIR-090 的 DMSO 溶液或 6 μL DMSO 添加到平行培养物中。当 A600 达到 0.4 时，将培养物稀释 10 倍到具有相同浓度 DMSO 或 DMSO/CHIR-090 的预热培养基中，使培养物保持对数生长期。这允许评估累积增长。当以A600=0.01的初始密度接种时，最低抑菌浓度是在含有1%DMSO（v/v）的LB培养基中观察不到可检测到的细菌生长的最低抗生素浓度。将培养物与 CHIR-090 一起在 30°C 下孵育 24 小时，同时摇动。每个实验进行三次[1]。

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LpxC对UDP-3-O-[（R）-3-羟基肉豆蔻酰基]-N-乙酰葡糖胺（UDP-3-O-酰基-GlcNAc）的脱乙酰化是脂质A生物合成的关键反应。CHIR-090是一种新型N-芳酰基-1-苏氨酸异羟肟酸，是一种强效、缓慢、紧密结合的超嗜热菌Aquifex aeolicus LpxC脱乙酰酶抑制剂，通过纸片扩散试验判断，它对铜绿假单胞菌和大肠杆菌具有优异的抗生素活性。我们现在报告说，CHIR-090也是大肠杆菌LpxC的两步缓慢、紧密结合抑制剂，Ki=4.0 nM，Ki*=0.5 nM，k5=1.9 min-1，k6=0.18 min-1。低纳摩尔水平的CHIR-090抑制来自不同革兰氏阴性病原体（包括铜绿假单胞菌、脑膜炎奈瑟菌和幽门螺杆菌）的LpxC直系同源物。相比之下，CHIR--090是一种相对较弱的竞争性和常规抑制剂（缺乏缓慢、紧密的结合动力学），用于抑制来自豆科根瘤菌（Ki=340nM）的LpcC，这是一种对该化合物具有抗性的革兰氏阴性植物内共生菌。以UDP-3-O-[（R）-3-羟基肉豆蔻酰基]-N-乙酰葡糖胺为底物的R.legominosarum LpxC的KM（4.8微摩尔）和kcat（1.7 s-1）与大肠杆菌LpxC报告的值相似。因此，R.legominosarum LpxC为验证LpxC作为CHIR-090体内主要靶点提供了一种有用的对照。一种大肠杆菌构建体，其中染色体lpxC基因被豆科芽孢杆菌lpxC取代，对CHIR-090的抗性高达100微克/毫升，是野生型大肠杆菌最低抑菌浓度的400倍。鉴于其相对较宽的谱和对多种革兰氏阴性病原体的效力，CHIR-090是进一步开发针对脂质A途径的新型抗生素的绝佳先导。[1]

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UDP-3-O-（R-3-羟基酰基）-N-乙酰葡糖胺脱乙酰酶LpxC是革兰氏阴性菌脂质A生物合成的重要酶，也是一种有前景的抗生素靶点。CHIR-090是迄今为止发现的最有效的LpxC抑制剂，具有两步时间依赖性抑制作用，与环丙沙星或妥布霉素一样有效地杀死多种革兰氏阴性病原体。在这项研究中，我们报告了LpxC-CHIR-090复合物的溶液结构。CHIR-090利用了LpxC的保守特征，这些特征对催化至关重要，包括疏水通道和必需的活性位点残基。CHIR-090与LpxC的UDP结合口袋相邻，但不占据它，这表明基于片段的方法可能有助于进一步优化LpxC抑制剂。此外，我们还鉴定了插入物II疏水通道中调节时间依赖性抑制和CHIR-090抗性的关键残基。CHIR-090与其他小分子抗生素（如靶向LpxC的L-161240）共享类似的化学支架，尽管以前未被发现，并为理解这些抑制剂的结合模式提供了模板。与该模型一致，我们提供了L-161240也占据疏水通道的证据。[2]

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1. 以重组大肠杆菌LpxC和UDP-3-O-(R-3-羟豆蔻酰)-N-乙酰葡萄糖胺为底物开展LpxC酶活性实验；通过检测乙酸盐的释放量衡量LpxC的脱乙酰酶活性，并通过测定IC50和Ki值评估CHIR-090对LpxC活性的抑制作用 [1]
2. 开展LpxC的时间依赖性抑制实验：将CHIR-090与重组大肠杆菌LpxC孵育不同时长（0-300秒）后加入底物；检测残余酶活性，计算观测速率常数（kobs）和时间依赖性抑制常数（Ki） [2]
3. 采用X射线晶体学技术解析CHIR-090与LpxC复合物的三维结构；将LpxC晶体浸泡于CHIR-090溶液中，收集衍射数据并将结构精修至1.8 Å分辨率，以此分析CHIR-090与LpxC的结合模式 [2]
4. 以重组蛋白和特异性底物开展铜绿假单胞菌LpxC酶活性实验；检测CHIR-090的抑制活性并确定IC50值 [3]

生物膜包埋细胞（MBEC）的抗菌药物敏感性。[3]
如Naparstek等人所述，对粘菌素和CHIR-090对铜绿假单胞菌生物膜的最小生物膜根除浓度（MBEC）值进行了三次评估。简而言之，生物膜在MH培养基中于37°C在96孔微孔板中生长24小时，然后用0.9%NaCl洗涤两次以去除浮游细胞。然后，以棋盘分析格式对附着的生物膜进行不同抗菌浓度组合的处理。粘菌素和CHIR-090的抗菌浓度分别为0至512和0至128μg/ml。将平板在37°C下孵育24小时。在抗菌挑战后，用0.9%NaCl彻底清洗孔以去除任何抗菌残留物。将200微升新鲜MH生长培养基加入洗涤过的孔中，然后在37°C下孵育平板24小时。MBEC值被确定为防止细菌从处理过的生物膜中生长的最低抗生素浓度。通过计算所得生物膜棋盘试验的抑制浓度分数指数（∑FIC），也评估了协同作用的潜力。所有实验均一式三份。

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1. 用不同浓度的CHIR-090（0-1 μg/mL）处理大肠杆菌培养物；向培养基中加入[³H]乙酸盐，提取并定量脂质A，评估CHIR-090对脂质A生物合成的影响 [1]
2. 用CHIR-090（0-16 μg/mL）单独或联合粘菌素（0-4 μg/mL）处理浮游态铜绿假单胞菌培养物；通过系列稀释和菌落计数检测细菌活力，确定MIC值和部分抑制浓度指数（FICI） [3]
3. 在96孔板中开展铜绿假单胞菌生物被膜形成实验；将细菌与CHIR-090（0-16 μg/mL）单独或联合粘菌素（0-4 μg/mL）共培养24小时，洗涤生物被膜并进行结晶紫染色，检测吸光度值以计算MBIC值 [3]
4. 用CHIR-090（0-32 μg/mL）单独或联合粘菌素（0-8 μg/mL）处理96孔板中的预成型铜绿假单胞菌生物被膜24小时；通过系列稀释和菌落计数定量生物被膜中的活菌数，确定MBEC值 [3]

小鼠生物膜植入感染模型。[3]
本研究采用7周龄雌性BALB/c小鼠。实验设置和准备工作参照Chua等人的方案进行。简而言之，将PAO1生物膜接种于圆柱形植入物（直径3 mm × 5 mm）上，置于0.9% NaCl溶液中，37℃、110 rpm摇床培养20小时。培养后，用0.9% NaCl溶液清洗生物膜覆盖的植入物三次，然后移植到麻醉小鼠的腹腔内。每组5只小鼠，在植入部位单次注射抗生素。处理组及其分组包括对照组（不注射抗生素，注射0.2 ml 0.04% DMSO）；实验组1接受10 mg/kg体重的粘菌素治疗（远低于小鼠的致死剂量86 mg/kg）；实验组2接受4 mg/kg体重的CHIR-090治疗；实验组3接受10 mg/kg体重的粘菌素和4 mg/kg体重的CHIR-090联合治疗。24小时后，处死小鼠，从腹膜中取出植入物，并用0.9%氯化钠溶液冲洗。然后将植入物置于冰水浴中，使用Elmasonic P120H超声波仪，以50%功率和37 kHz频率超声处理10分钟，之后将样品涡旋振荡3次，每次10秒。脾脏也被收集，并在冰上用 Bio-Gen PRO200 均质器（Pro Scientific，美国）以最大功率进行均质。然后将植入物和脾脏组织样本用 0.9% NaCl 进行系列稀释，接种到 LB 琼脂平板上，并在 37°C 下培养过夜。使用 Prism（7.0 版）软件计算 CFU 数，并绘制其与处理的关系图。结果以均值 ± 标准差表示。

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1. 将铜绿假单胞菌（1 × 10⁷ CFU/只）经鼻内接种到 C57BL/6 小鼠中，以建立急性肺炎模型； CHIR-090以10 mg/kg的剂量腹腔注射，每8小时一次，连续3天（溶于10% DMSO/90%生理盐水中）；粘菌素以2.5 mg/kg的剂量腹腔注射，每8小时一次，连续3天（单独使用或与CHIR-090联合使用）；对照组小鼠注射溶剂（10% DMSO/90%生理盐水）[3]
2. 感染后72小时，处死小鼠，匀浆肺组织，并将匀浆液进行系列稀释后涂布于琼脂平板上进行菌落计数，以确定肺组织中的细菌载量[3]

[1]. Inhibition of lipid A biosynthesis as the primary mechanism of CHIR-090 antibiotic activity in Escherichia coli. Biochemistry. 2007 Mar 27;46(12):3793-802.

[2]. Structure of the deacetylase LpxC bound to the antibiotic CHIR-090: Time-dependent inhibition and specificity in ligand binding. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 Nov 20;104(47):18433-8.

[3]. In Vitro and In Vivo Efficacy of an LpxC Inhibitor, CHIR-090, Alone or Combined with Colistin against Pseudomonas aeruginosa Biofilm. Antimicrob Agents Chemother. 2017 Jun 27;61(7). pii: e02223-16.

CHIR-090 是一种 L-苏氨酸衍生物，由 4-({4-[(吗啉-4-基)甲基]苯基}乙炔基)苯甲酸的羧基与 N-羟基-L-苏氨酰胺的氨基缩合而成。它具有抗菌剂、脂多糖生物合成抑制剂和 EC 3.5.1.108（UDP-3-O-酰基-N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶）抑制剂的作用。它是一种炔烃化合物，属于吗啉类、苯甲酰胺类、L-苏氨酸衍生物和羟肟酸类化合物。

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1. 脂质 A 是革兰氏阴性菌外膜的重要组成部分，LpxC 是脂质 A 生物合成的限速酶；抑制 LpxC 会导致脂质 A 耗竭和细菌外膜完整性破坏，从而导致细菌死亡 [1]
2. CHIR-090 是一种强效、选择性且具有时间依赖性的 LpxC 抑制剂，对其他锌依赖性金属酶（例如基质金属蛋白酶、血管紧张素转化酶）没有明显的抑制活性 [2]
3. 铜绿假单胞菌生物膜是慢性感染和抗生素耐药性的主要原因； CHIR-090靶向脂质A生物合成（铜绿假单胞菌生存的必需途径），对浮游细菌和生物膜均有活性[3]
4. CHIR-090与粘菌素（一种靶向细菌外膜的多粘菌素类抗生素）联用具有协同抗菌作用，可能克服铜绿假单胞菌生物膜的粘菌素耐药性[3]

C24H27N3O5

437.49

437.195

C, 65.89; H, 6.22; N, 9.60; O, 18.28

728865-23-4

11546620

White to off-white solid powder

1.3±0.1 g/cm3

1.650

1.23

114.62

4

6

8

32

680

2

O1C([H])([H])C([H])([H])N(C([H])([H])C2C([H])=C([H])C(C#CC3C([H])=C([H])C(=C([H])C=3[H])C(N([H])[C@]([H])(C(N([H])O[H])=O)[C@@]([H])(C([H])([H])[H])O[H])=O)=C([H])C=2[H])C([H])([H])C1([H])[H]

FQYBTYFKOHPWQT-VGSWGCGISA-N

InChI=1S/C24H27N3O5/c1-17(28)22(24(30)26-31)25-23(29)21-10-8-19(9-11-21)3-2-18-4-6-20(7-5-18)16-27-12-14-32-15-13-27/h4-11,17,22,28,31H,12-16H2,1H3,(H,25,29)(H,26,30)/t17-,22+/m1/s1

N-[(2S,3R)-3-hydroxy-1-(hydroxyamino)-1-oxobutan-2-yl]-4-[2-[4-(morpholin-4-ylmethyl)phenyl]ethynyl]benzamide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : 4~5 mg/mL ( 9.14~11.43 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 0.5 mg/mL (1.14 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 5.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 0.5 mg/mL (1.14 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 5.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入 900 μL 20% SBE-β-CD 生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 0.5 mg/mL (1.14 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 5.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 10% DMSO+40% PEG300+5% Tween-80+45% Saline: ≥ 0.5 mg/mL (1.14 mM)

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。