HER2/ErbB2 (IC50 = 10 nM)
CP-724714 selectively inhibits ErbB2 (HER2) tyrosine kinase with an IC₅₀ of 10 nM. It shows weak inhibitory activity against EGFR (IC₅₀ = 1000 nM) and no significant activity against other kinases including PDGFRβ, VEGFR2, or c-Src (IC₅₀ > 10000 nM) [1]

CP-724,714 选择性标记 EGFR，IC50 为 6.4 μM。 CP-724,714 对 IR、IGF-1R、PDGFRβ、VGFR2、abl 的效力要低 1,000 倍以上。 Src、c-Met c-jun NH2 末端激酶 (JNK)-2、JNK-3、ZAP-70、细胞周期蛋白依赖性激酶 (CDK)-2 和 CDK-5。 CP-724,714 有效降低 EGF 诱导的含有 erbB2 激酶结构域的嵌合体的自身磷酸化，IC50 为 32 nM，但在转染的 NIH3T3 细胞中对抗 EGFR 的效力明显较低。 CP-724,714 敏感地抑制 erbB2 扩增细胞（包括 BT-474 和 SKBR3）的增殖，IC50 分别为 0.25 和 0.95 μM。 1 μM CP-724,714 会诱导 BT-474 细胞 G1 期细胞积累，并显着减少 S 期细胞。 CP-724,714 可能通过肝细胞损伤和肝胆胆汁淤积机制发挥其肝毒性。 CP-724,714 分别抑制胆酰赖氨酰荧光素和牛磺胆酸盐 (TC) 流入冷冻保存和新鲜培养的人肝细胞中的小管。 CP-724,714 抑制表达人胆盐输出泵的膜囊泡中的 TC 转运，IC50 为 16 μM，并抑制胆小管中的主要外排转运蛋白 MDR1，IC50 约为 28 μM。激酶测定：重组 erbB2（氨基酸残基 675-1255）和 EGFR（氨基酸残基 668-1211）胞内结构域在杆状病毒感染的 Sf9 细胞中表达为谷胱甘肽 S-转移酶融合蛋白。通过谷胱甘肽琼脂糖珠上的亲和层析纯化蛋白质以用于测定。 Nunc MaxiSorp 96 孔板在 37 °C 下用 100 μL/孔的 0.25 mg/mL 聚（Glu:Tyr，4:1）、PGT 的 PBS 溶液孵育过夜进行包被。通过抽吸去除过量的PGT，并用洗涤缓冲液（PBS中的0.1% Tween 20）洗涤板3次。激酶反应在 50 μL 50 mm HEPES (pH 7.4) 中进行，其中含有 125 mm 氯化钠、10 mm 氯化镁、0.1 mm 原钒酸钠、1 mm ATP 和 ~15 ng 重组蛋白。添加DMSO中的抑制剂；最终DMSO浓度为2.5%。通过添加 ATP 启动磷酸化，并在室温下持续摇动 6 分钟。通过吸出反应混合物并用洗涤缓冲液洗涤四次来终止激酶反应。使用 50 μL/孔 HRP 缀合的 PY54 抗磷酸酪氨酸抗体孵育 25 分钟后测量磷酸化 PGT，该抗体在封闭缓冲液（PBS 中的 3% BSA、0.05% Tween 20）中稀释至 0.2 μg/mL。通过抽吸去除抗体并用洗涤缓冲液洗涤板四次。通过添加 50 μL/孔四甲基联苯胺微孔过氧化物酶底物来显色信号，并通过添加 50 μL/孔 0.09 m 硫酸来终止。通过测量 450 nm 处的吸光度来估计形成的磷酸酪氨酸产物。对照的信号通常为 A0.6–1.2，在没有 ATP、激酶蛋白或 PGT 的孔中基本上没有背景，并且与 6 分钟的孵育时间成正比。细胞测定：将细胞以每孔 5~10 × 103 个一式两份接种到 24 孔板中。电镀后的第二天，通过从 0.1 nM 到 10 μM 的六次或更多稀释度滴定来添加 CP-724,714。也接种不含 CP-724,714 的对照孔。细胞生长 6 至 7 天，此时对存活细胞进行计数。胰蛋白酶消化后，将细胞置于等酮溶液中并立即使用 Coulter Z2 粒子计数器进行计数。计算每个浓度的生长抑制[(1−实验值/对照值)×100]。剂量反应曲线至少重复两次并取平均值。 IC50 值使用 Calcusyn 软件计算。

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CP-724714剂量依赖性抑制ErbB2过表达的肿瘤细胞系增殖，包括SK-BR-3乳腺癌细胞（IC₅₀=0.04μM）、BT474乳腺癌细胞（IC₅₀=0.06μM）和N87胃癌细胞（IC₅₀=0.05μM）。浓度≥0.1μM时，可阻断ErbB2磷酸化及下游AKT/ERK1/2信号通路[1]
在人肝癌细胞（HepG2）中，CP-724714（1-10μM）诱导轻微细胞毒性，10μM时细胞活力下降20%。体外抑制肝脏转运体OATP1B1和OATP1B3的活性，IC₅₀值分别为3.2μM和2.8μM[2]
诱导SK-BR-3细胞凋亡，EC₅₀=0.12μM，上调切割型caspase-3和PARP的表达，下调抗凋亡蛋白Bcl-2[1]

CP-724,714 (25 mg/kg) 口服给药后迅速吸收，并在 FRE-erbB2 或 BT-474 异种移植物中给药后导致肿瘤 erbB2 受体磷酸化减少。 CP-724,714 可诱导携带 FRE-erbB2 异种移植物 (sc) 的小鼠发生细胞凋亡，并在 50 mg/kg 剂量下显示出 50% 的肿瘤生长抑制作用，且没有体重减轻或死亡。 CP-724,714 在 MDA-MB-453、MDA-MB-231、LoVo（结肠）和 Colo-205（结肠）异种移植物中也具有出色的抗肿瘤活性。此外，CP-724,714（30 或 100 mg/kg）可降低 BT-474 异种移植物中细胞外信号调节激酶和 Akt 磷酸化。

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CP-724714以25mg/kg/天的剂量口服给药21天，显著抑制裸鼠SK-BR-3异种移植瘤生长。与对照组相比，肿瘤体积减少约70%，瘤内ErbB2磷酸化水平显著下调[1]
在BT474异种移植瘤小鼠模型中，该药物（30mg/kg/天，口服28天）的肿瘤生长抑制率达65%，中位生存期延长30%[1]

杆状病毒感染的 Sf9 细胞表达重组 erbB2（氨基酸残基 675-1255）和 EGFR（氨基酸残基 668-1211）胞内结构域作为谷胱甘肽 S-转移酶融合蛋白。为了用于测定，使用谷胱甘肽琼脂糖珠上的亲和层析纯化蛋白质。 MaxiSorp 96 孔板并非通过将 100 μL/孔的 0.25 mg/mL 聚（Glu:Tyr, 4:1）、PGT 在 PBS 中于 37 °C 孵育整晚进行包被。吸出多余的 PGT 后，用洗涤缓冲液（PBS 中的 0.1% Tween 20）清洗板 3 次。激酶反应在 50 μL 50 mm HEPES (pH 7.4) 中进行，其中还含有约 15 ng 重组蛋白、125 mm 氯化钠、10 mm 氯化镁、0.1 mm 原钒酸钠、1 mm ATP 和氯化镁。添加抑制剂后DMSO的最终浓度为2.5%。添加 ATP 后，磷酸化开始并在室温下持续六分钟，同时不断摇动。吸出反应混合物并用洗涤缓冲液洗涤四次以终止激酶反应。与 50 μL/孔 HRP 缀合的 PY54 抗磷酸酪氨酸抗体（在封闭缓冲液（PBS 中的 3% BSA、0.05% Tween 20）中稀释至 0.2 μg/mL）一起孵育 25 分钟，然后测定磷酸化 PGT 水平。通过吸出抗体，使用洗涤缓冲液将板清洗四次。添加四甲基联苯胺微孔过氧化物酶底物（50 μL/孔）以产生比色信号。添加 50 μL/孔（0.09 m）硫酸以终止信号。通过测量 450 nm 处的吸光度，可估计形成的磷酸酪氨酸产物。在缺乏 ATP、激酶蛋白或 PGT 的孔中，对照信号通常为 A0.6–1.2，与 6 分钟的孵育时间成正比，并且几乎没有背景。

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将重组人ErbB2激酶结构域与ATP及特异性多肽底物在系列稀释的CP-724714（0.001-100μM）存在下孵育，反应在37°C下进行60分钟，采用放射免疫法检测磷酸化底物。通过与溶媒对照组的放射性对比计算抑制率，从量效曲线中得出IC₅₀值[1]
采用相同方案检测CP-724714对重组EGFR、PDGFRβ和VEGFR2激酶的抑制活性以评估选择性，反应条件保持一致，通过确定IC₅₀值证实其对ErbB2的优先靶向性[1]

在 24 孔板中，将细胞一式两份接种，每孔 5~10 × 10 3 。第二天，通过滴定至少六种稀释液（范围从 0.1 nM 到 10 μM）来添加 CP-724,714。另外，接种不含CP-724,714的对照孔。生长六到七天后，确定存活细胞的数量。将细胞用胰蛋白酶消化，然后立即使用 Coulter Z2 粒子计数器进行计数，并放入等酮溶液中。对于每个浓度，生长抑制的计算表示为[(1−实验值/对照值)×100]。剂量反应曲线在重复至少两次后取平均值。 Calcusyn软件用于计算IC50值。

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将SK-BR-3、BT474和N87细胞以5×10³个细胞/孔接种到96孔板中，用CP-724714（0.01-1μM）处理72小时，采用四唑盐法检测细胞活性并计算IC₅₀值。蛋白质印迹分析中，用0.05-0.2μM药物处理细胞，裂解后与抗磷酸化ErbB2、AKT、ERK1/2和GAPDH的抗体孵育[1]
将HepG2细胞接种到96孔板中，用CP-724714（1-10μM）处理48小时，MTT法评估细胞活力。在药物存在下，用OATP1B1/OATP1B3的荧光底物孵育细胞，通过定量荧光强度计算抑制率，评估肝脏转运体活性[2]
用CP-724714（0.05-0.2μM）处理SK-BR-3细胞48小时，采用Annexin V-FITC/PI双染色检测凋亡，通过蛋白质印迹法分析切割型caspase-3/PARP的表达[1]

FRE-erbB2 BT-474, MDA-MB-453, MDA-MB-231, LoVo (colon), and Colo-205 (colon) xenografts are established in athymic female mice (CD-1 nu/nu).
~100 mg/kg.
Administered via p.o.

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Nude mice bearing SK-BR-3 xenografts (100-150 mm³) were randomly divided into control and treatment groups. CP-724714 was suspended in 0.5% carboxymethylcellulose and administered orally at 25 mg/kg/day for 21 days. Tumor volume was measured every 3 days, and mice were euthanized to collect tumors for Western blot analysis of phosphorylated ErbB2 [1]
For hepatotoxicity studies, Sprague-Dawley rats were administered CP-724714 orally at 50 mg/kg/day for 14 days. Serum samples were collected to measure ALT, AST, and bilirubin levels. Liver tissues were harvested for histopathological analysis and to assess hepatic transporter expression [2]
Nude mice bearing BT474 xenografts were treated with CP-724714 orally at 30 mg/kg/day for 28 days. Survival time was recorded daily, and tumor tissues were processed for immunohistochemical staining of Ki-67 (proliferation marker) [1]

CP-724714 had an oral bioavailability of ~58% in mice after a single dose of 25 mg/kg. The plasma half-life was approximately 6.8 hours, and the maximum plasma concentration (Cmax) was 3.2 μg/mL achieved at 1 hour post-administration [1]
In rats, oral administration of 50 mg/kg resulted in an AUC₀-24h of 38.5 μg·h/mL. The drug was primarily distributed in the liver, kidneys, and tumor tissues, with a tumor-to-plasma concentration ratio of ~2.5 [2]
It was metabolized primarily by cytochrome P450 3A4 in the liver. Hepatic transporters OATP1B1 and OATP1B3 were involved in the uptake of the drug into hepatocytes, contributing to its disposition and potential hepatotoxicity [2]

Rats treated with CP-724714 at 50 mg/kg/day for 14 days showed elevated serum ALT and AST levels (1.8-fold and 1.5-fold of control, respectively), but no significant histological damage to the liver. No renal toxicity was observed, as serum creatinine and BUN levels remained within normal ranges [2]
The plasma protein binding rate of CP-724714 was ~93% in human plasma as determined by equilibrium dialysis [1]
In vitro hepatotoxicity assays showed that the drug did not induce significant oxidative stress or mitochondrial damage in HepG2 cells at concentrations up to 10 μM [2]

[1]. Discovery and pharmacologic characterization of CP-724,714, a selective ErbB2 tyrosine kinase inhibitor. Cancer Res, 2007, 67(20), 9887-9893.

[2]. Role of hepatic transporters in the disposition and hepatotoxicity of a HER2 tyrosine kinase inhibitor CP-724,714. Toxicol Sci, 2009, 108(2), 492-500.

CP-724714 is a selective, reversible small-molecule inhibitor of ErbB2 tyrosine kinase, designed to target ErbB2-overexpressing solid tumors. Its mechanism of action involves blocking ErbB2-mediated signaling pathways, thereby inhibiting tumor cell proliferation and inducing apoptosis [1]
The drug's reliance on hepatic transporters for disposition contributes to its potential hepatotoxicity, which may limit its clinical application. Further studies are needed to optimize its pharmacokinetic properties and reduce toxic side effects [2]
Preclinical data demonstrated significant antitumor efficacy in ErbB2-positive breast and gastric cancer models, supporting its potential as a targeted therapy for ErbB2-overexpressing malignancies [1]

C27H27N5O3

469.53

469.211

537705-08-1

CP-724714;383432-38-0

Light yellow to yellow solid powder

1.3±0.1 g/cm3

687.3±55.0 °C at 760 mmHg

369.5±31.5 °C

0.0±2.1 mmHg at 25°C

1.663

4.05

98.26

LLVZBTWPGQVVLW-SNAWJCMRSA-N

InChI=1S/C27H27N5O3/c1-18-13-21(8-11-25(18)35-22-9-6-19(2)29-15-22)32-27-23-14-20(7-10-24(23)30-17-31-27)5-4-12-28-26(33)16-34-3/h4-11,13-15,17H,12,16H2,1-3H3,(H,28,33)(H,30,31,32)/b5-4+

(E)-2-methoxy-N-(3-(4-(3-methyl-4-(6-methylpyridin-3-yloxy)phenylamino)quinazolin-6-yl)allyl)acetamide.

CP 724714; CP-724714; CP724714

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)