CY 09

NLRP3

CY-09 在浓度为 1 至 10 μM 的 LPS 攻击的骨髓源性巨噬细胞 (BMDM) 中表现出对尿酸钠 (MSU)、MSU、ATP 诱导的 caspase-1 激活和 IL-1β 行走的反应性。死亡依赖性抑制。 BMDM 中细胞质 LPS 诱导的非典型 NLRP3 激活也可以通过 CY-09 给药而肿胀。 CY-09 缓冲液激活 NLRP3 炎症小体，对 LPS 诱导的启动效应没有影响。 CY-09处理主要抑制因子，发现CY-09处理HEK-293T细胞中Flag-NLRP3和mCherry-NLRP3的相互作用，表明CY-09阻止NLRP3寡聚化[1]。

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CY-09特异性阻断巨噬细胞中NLRP3的激活。CY-09阻断NLRP3炎性小体激活。 CY-09抑制NLRP3寡聚和炎性小体组装。CY-09直接与NLRP3结合并抑制其ATP酶活性。 CY-09与NLRP3-NACHT结构域的ATP结合位点结合。CY-09抑制NLRP3-ATP酶活性[1]。

在用 CY-09 处理的腔室中，注射尿酸钠 (MSU) 诱导的 IL-1β 生成和中性粒细胞流入显着受到抑制，表明 CY-09 可以阻止腔室内 MSU 诱导的 NLRP3 炎性体激活。即使治疗在第 25 天终止，CY-09 治疗也将 NLRP3 突变的均匀率提高到 30 至 48 天。 CY-09 还抑制 caspase-1 (caspase-1) 通道的均匀加工，这在高脂饮食 (HFD) 的脂肪组织中有所体现 [1]。

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CY-09在体内抑制NLRP3激活，并在CAPS小鼠模型中防止新生儿死亡。 CY-09抑制MSU诱导的腹膜炎和MWS小鼠模型中NLRP3的激活。 CY-09通过抑制NLRP3依赖性炎症来逆转糖尿病小鼠的代谢紊乱。 CY-09治疗HFD诱导的糖尿病小鼠代谢紊乱。CY-09抑制糖尿病小鼠NLRP3依赖性代谢炎症。 CY-09对健康人或痛风患者的细胞具有体外活性。CY-09对健康人或痛风患者的细胞具有活性[1]。

MST测定[1]
KD值使用Monolith NT.115仪器测量。在测定缓冲液（50 mM Hepes、10 mM MgCl2、100 mM NaCl、pH 7.5和0.05%吐温20）中，将不同浓度的CY-09（0.025 mM至1.2 nM）与200 nM纯化的His-GFP-NLRP3蛋白一起孵育40分钟。将样品装入NanoTemper玻璃毛细管中，使用100%LED功率和80%MST功率进行MST。KD值是通过NanoTemper软件从实验的重复读取中使用质量作用方程计算的。

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微粒体稳定性[1]
在一家CRO公司中确定了微软的稳定性CY-09或用50%甲醇稀释至100µM浓度的对照化合物DMSO储备溶液（10 mM）。将6µl 100µM化合物溶液与534µl肝微粒体溶液（0.7mg蛋白质/ml磷酸钾缓冲液）混合，制备化合物工作溶液。在加入NADPH再生系统（10µl）开始反应之前，将90µl等分的该工作溶液在37°C下孵育10分钟。通过加入300µl冷乙腈（含有500 nM的甲磺丁脲作为内标）在0、10、30和60分钟停止反应，并在4000 rpm下离心20分钟。将上清液（100µl）加入水（300µl）中，通过液相色谱/串联质谱法进行分析。使用试验化合物剩余峰面积/内标的比率来确定试验化合物浓度随时间的降低。然后计算t1/2和肝清除率（CLhep）。

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NLRP3-ATP酶活性和ATP结合测定[1]
对于ATP酶活性测定，纯化的重组人蛋白（1.4 ng/µl）在37°C下与指示浓度的CY-09在反应缓冲液中孵育15分钟。然后加入ATP（25µm，超纯ATP），将混合物在37°C下进一步孵育40分钟。根据制造商的方案，使用ADP-Glo激酶检测试剂盒通过发光ADP检测来测定转化为二磷酸腺苷（ADP）的ATP量。结果以残留酶活性与载体处理酶的百分比表示。 对于ATP结合测定，纯化的NLRP3蛋白（0.1 ng/µl）与ATP结合琼脂糖一起孵育1小时，然后加入不同浓度的CY-09，在4°C下运动孵育2小时。将珠子在装载缓冲液中洗涤并煮沸。对样本进行免疫印迹分析。

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ASC低聚分析[1]
BMDM以1×106/ml的浓度接种在6孔板中。第二天，更换培养基，用50 ng/ml LPS预处理细胞3小时。用CY-09处理细胞30分钟，然后用黑曲霉素刺激30分钟。去除上清液，用冰冷的PBS冲洗细胞，然后用NP-40裂解细胞30分钟。裂解物在4°C下以330 g离心10分钟。将颗粒在1ml冰冷的PBS中洗涤两次，然后重新悬浮在500µl PBS中。将2mM二琥珀酰亚胺酯加入重新悬浮的颗粒中，在室温下旋转培养30分钟。然后将样品在4°C下以330 g离心10分钟。将交联颗粒重新悬浮在30µl样品缓冲液中，然后煮沸并通过免疫印迹进行分析。

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细胞色素P450抑制[1]
在无锡应用科技有限公司测定了CY-09对五种主要CYP同工酶（1A2、2C9、2C19、2D6和3A4）的细胞色素P450抑制作用。使用磷酸盐缓冲液将CY-09的工作储备溶液（DMSO中的10 mM）稀释至100µM的浓度。在DMSO中制备了五种浓度为3 mM的抑制剂储备溶液：α-萘黄酮、磺胺苯唑、N-3-苄基尼凡诺、奎尼丁和酮康唑。使用磷酸盐缓冲液将抑制剂储备稀释至30µM的浓度。通过使用磷酸盐缓冲液稀释甲醇储备溶液，制备了五种主要CYP同工酶（1A2、2C9、2C19、2D6和3A4）的底物混合物（非那西丁、双氯芬酸、S-美芬妥英、右美沙芬和咪达唑仑）CY-09、已知抑制剂或空白溶液（20µl工作储备溶液）和底物鸡尾酒溶液（20μl）在37°C下与人肝微粒体（158µl 0.253mg/ml磷酸盐缓冲液）一起孵育10分钟，然后加入辅因子NADPH（20µl10mM溶液，溶于33mM MgCl2中）。继续孵育，在0、5、10、20、30和60分钟时取出等分试样，然后与冷乙腈（含有甲苯磺丁脲作为内标，浓度为200 ng/ml）混合，以4000 rpm离心20分钟。通过液相色谱/串联质谱分析上清液，以确定代谢物和内标的峰面积。在存在和不存在试验化合物的情况下测定的峰面积用于测定抑制百分比。SigmaPlot v.11用于绘制对照活性百分比与试验化合物浓度的关系图，并对数据进行非线性回归分析。使用三参数逻辑斯谛方程确定IC50值。当最高浓度（50µM）下的抑制百分比<50%时，IC50值报告为“>50µM”。

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hERG通道测定[1]
一家CRO公司使用手动膜片钳法（QPatchHTX）来评估CY-09对hERG钾通道的影响。使用来自Aviva Biosciences的稳定表达hERG钾通道的CHO细胞。测定了CY-09和阿米替林作为阳性对照对全细胞hERG电流的抑制作用。

为了诱导NLRP3炎性体激活，将5×105/ml BMDM和6×106/ml PBMCs接种在12孔板上。第二天早上，更换培养基，用50 ng/ml LPS或400 ng/ml Pam3CSK4（用于非正常炎性体激活）刺激细胞3小时。之后，将CY-09或其他抑制剂加入培养物中30分钟，然后用MSU（150µg/ml）、鼠伤寒沙门氏菌（多重感染）刺激细胞4小时，或用ATP（2.5 mM）或黑曲霉素（10µM）刺激细胞30分钟。使用Lipofectamine 2000用聚（dA:dT）（0.5µg/ml）转染细胞4小时或用LPS（500 ng/ml）转染细胞过夜。通过免疫印迹分析细胞提取物和沉淀的上清液。

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共聚焦显微镜[1]
如前所述进行共聚焦分析（Yan等人，2015）。简而言之，2×105/ml BMDM被镀在盖玻片上。第二天，将培养基替换为含有LPS（50 ng/ml）的Opti-MEM（1%FBS）3小时，然后再加入指定剂量的CY-0930分钟。然后使用BMDM进行刺激，并用MitoTracker Red（50 nM）或MitoSOX（5µM）染色。用冰冷的PBS洗涤三次后，在室温下用4%PFA的PBS溶液固定细胞15分钟，然后用含吐温20的PBS洗涤3次。使用蔡司LSM700进行共聚焦显微镜分析。

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细胞内钾或氯化物检测[1]
为了准确测量细胞内钾，将BMDM在6孔板上放置过夜，然后用50 ng/ml LPS预处理3小时。之后，用CY-09处理细胞30分钟，然后用黑曲霉素刺激30分钟。彻底吸出培养基，用65%超纯HNO3裂解。使用PerkinElmer Optima 2000 DV光谱仪，以钇为内标，通过电感耦合等离子体发射光谱法进行细胞内K+测量。
为了准确测量细胞内氯化物，将BMDM在12孔板上放置过夜，然后用50 ng/ml LPS预处理3小时。之后，用CY-09或MCC950处理细胞30分钟，然后用黑曲霉素刺激15分钟。去除12孔板的上清液，加入ddH2O（200µl/孔），将上清液在37°C下保持15分钟。将裂解物转移到1.5ml EP管中，在10000g下离心5分钟。然后将160-µl上清液转移到新的1.5ml EP试管中，并与40µl MQAE（10µM）混合。使用BioTek多模微孔板读数器（Synergy2）测试吸光度。在每个实验中都设置了一个对照，以确定抽吸后剩余的细胞外氯化物量，并减去该值。

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免疫沉淀（IP）和下拉试验[1]
对于内源性IP测定，用含有完全蛋白酶抑制剂的NP-40裂解缓冲液刺激和裂解BMDM。将细胞裂解物与一抗和Protein G Mag-Sepharose（GE Healthcare）在4°C下孵育过夜。用G蛋白珠沉淀抗体结合的蛋白质，并进行免疫印迹分析。对于外源性IP测定，HEK-293T细胞（3×105/ml）通过聚乙烯亚胺在6孔板中用质粒转染。24小时后，收集细胞并用NP-40裂解缓冲液裂解。用抗Flag抗体包被的珠子对蛋白质提取物进行免疫沉淀，然后通过免疫印迹分析进行评估。
对于下拉分析，收集BMDM或293T裂解物，并在8000 rpm下离心。将上清液转移到另一个试管中，彻底丢弃细胞碎片。将预洗的链霉抗生物素蛋白珠加入上清液中，在4°C下运动预孵育2小时，以8000 rpm离心。将上清液转移到另一个试管中，丢弃链霉抗生物素蛋白珠以去除非特异性结合蛋白。将预处理的上清液和纯化的人重组NLRP3蛋白（溶解在裂解缓冲液中）与指定剂量的游离CY-09一起孵育，然后与指定浓度的生物素-CY-09一起孵育1小时。之后，将样品与预洗的链霉抗生物素蛋白珠一起孵育过夜。分别用0.1%吐温20的PBS溶液和1%NP-40的PBS溶液洗涤珠子两次，以去除非特异性结合蛋白，并在SDS缓冲液中煮沸。

采用 DMA:EL:HP-β-CD (10%, wt/vol) = 5:5:90 (vol/vol/v) 的配方，CY-09 在 pH 7.4 时浓度达到 1 mg/ml。采用 DMSO:Solutol HS 15:生理盐水 = 10%:10%:80% (vol/vol/v) 的配方，CY-09 在 pH 9.0 时浓度达到 5 mg/ml。在体内实验中，CY-09配制于含有10% DMSO、10% Solutol HS 15和80%生理盐水的溶剂中。[1]

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MSU诱导的腹膜炎[1]
在腹腔注射MSU（1 mg MSU晶体溶于0.5 ml无菌PBS）前30分钟，腹腔注射40 mg/kg CY-09或溶剂。6小时后，处死小鼠，并用10 ml冰冷的PBS灌洗腹腔。采用流式细胞术检测腹腔灌洗液中中性粒细胞标志物Ly6G和CD11b，以分析多形核中性粒细胞的募集情况。采用ELISA法测定血清或腹腔灌洗液中IL-1β的产生。

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CY-09 在小鼠体内的药代动力学特性测定 [1]
在 C57BL/6J 小鼠中，分别以 5 mg/kg 和 10 mg/kg 的剂量，单次静脉注射和口服给药 CY-09 后，测定了其药代动力学（每个时间点 n = 3）。分别于给药后 0.08、0.25、0.5、1、2、4、8、10 和 24 小时（静脉注射）以及 0.25、0.5、1、2、4、8、10 和 24 小时（口服）采集血样。然后采用液相色谱/串联质谱法对样品进行定量分析，并使用 WinNonlin v.6.3 软件进行数据分析。

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MWS 小鼠模型 [1]
将 Nlrp3A350VneoR 小鼠与 LysM-Cre 小鼠 (B6.129P2-Lyz2tm1(cre)Ifo/J) 杂交。从出生后第 4 天开始，每天口服给予 CY-09 (20 mg/kg) 或 MCC950 (20 mg/kg)。每天监测小鼠的体重和存活率。

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高脂饮食 (HFD) 和 CY-09 治疗 [1]
将 6 周龄的野生型 (WT) 或 Nlrp3−/− 小鼠（血糖水平和体重相近）随机分为不同组。为了构建 HFD 诱导的糖尿病小鼠模型，小鼠喂食 HFD 14 周。糖尿病小鼠每天腹腔注射 CY-09 2.5 mg/kg，持续 6 周。在进行 CY-09 治疗和后续实验时，小鼠均喂以高脂饮食。

接下来，我们研究了该化合物的药代动力学特征，然后评估了CY-09在体内的治疗潜力。首先使用人肝微粒体和鼠肝微粒体评估了CY-09的代谢稳定性，结果显示其稳定性良好，在人肝微粒体和鼠肝微粒体中的半衰期均大于145分钟（表S1）。我们测试了CY-09对五种主要细胞色素P450酶1A2、2C9、2C19、2D6和3A4的抑制活性，其半数抑制浓度（IC50）值分别为18.9、8.18、>50、>50和26.0 µM（表S2），表明其药物相互作用风险较低。为了评估其潜在的心脏毒性，我们采用自动膜片钳技术（QPatchHTX）检测了CY-09对人醚-a-go-go (hERG)钾通道的影响，结果显示CY-09在10 µM浓度下对hERG通道无活性（表S3）。随后，我们进一步评估了CY-09在C57BL/6J小鼠体内的药代动力学特性，小鼠分别接受单次静脉注射或口服给药。CY-09表现出良好的药代动力学特征，半衰期为2.4 h，曲线下面积为8,232 (h·ng)/ml，生物利用度为72%（表S4）。基于这些数据，我们进一步评估了CY-09的体内疗效。[1]

[1]. Identification of a selective and direct NLRP3 inhibitor to treat inflammatory disorders. J Exp Med. 2017 Nov 6;214(11):3219-3238.

NLRP3炎症小体与多种人类疾病的发病机制密切相关。虽然已有一些化合物被开发用于抑制NLRP3炎症小体的激活，但目前尚无直接且特异性靶向NLRP3的化合物，因此NLRP3本身是否可作为疾病预防或治疗的靶点尚不明确。本文研究表明，化合物CY-09能够特异性阻断NLRP3炎症小体的激活。CY-09直接结合NLRP3 NACHT结构域的ATP结合基序，抑制NLRP3的ATPase活性，从而抑制NLRP3炎症小体的组装和激活。重要的是，CY-09治疗在冷吡啉相关自身炎症综合征（CAPS）和2型糖尿病的小鼠模型中显示出显著的治疗效果。此外，CY-09在体外对健康个体的单核细胞或痛风患者的滑液细胞也具有活性。因此，我们的研究结果提供了一种选择性强、作用直接的小分子NLRP3抑制剂，并表明NLRP3可作为体内靶点，用于对抗NLRP3驱动的疾病。[1]

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在本研究中，我们描述了一种高效、选择性强、作用直接的NLRP3抑制剂，该抑制剂在小鼠体内和人细胞体外均表现出显著的NLRP3炎症小体抑制活性。CY-09将作为一种多功能工具，用于药理学研究NLRP3生物学及其在炎症性疾病中的作用。
一些化合物已显示出对NLRP3炎症小体的强效抑制活性，并在动物模型中进行了测试，但这些化合物的非特异性作用限制了其临床应用潜力。萝卜硫素对AIM2或NLRC4炎症小体的抑制作用表明，它可能削弱这些炎症小体在宿主防御中的作用（Greaney等，2016）。萝卜硫素、异甘草素、β-羟基丁酸（BHB）、小白菊内酯、BAY 11-7082 和 INF39 的广泛抗炎活性（Heiss 等，2001；Yip 等，2004；Honda 等，2012；Strickson 等，2013；Fu 等，2015；Cocco 等，2017）提示这些化合物可能引起免疫抑制副作用并增加感染风险。氟芬那酸和甲芬那酸对氯离子外排的影响以及 BHB 对钾离子外排的影响表明，这些化合物靶向 NLRP3 的上游信号通路，并具有其他不可避免的生物活性（Youm 等，2015；Daniels 等，2016）。 MCC950在多种NLRP3相关疾病的小鼠模型中均表现出强效的抑制活性和有益作用（Coll等，2015；Dempsey等，2017），但其机制尚不清楚。本研究表明，MCC950能够阻断NLRP3激动剂诱导的氯离子外流，而氯离子外流被认为是NLRP3激活的上游信号事件（Daniels等，2016）。这提示MCC950可能靶向体积调节阴离子通道或其他氯离子通道来抑制NLRP3炎症小体的激活，并可能具有非特异性作用。本研究描述了CY-09，一种特异性的NLRP3炎症小体抑制剂，它直接靶向NLRP3本身。我们发现CY-09对CAPS、2型糖尿病和痛风的小鼠模型具有显著的预防或治疗作用。因此，我们的研究描述了一种具有治疗NLRP3相关疾病潜力的直接且特异性的NLRP3抑制剂。
我们的结果表明，药理学抑制NLRP3 ATPase活性可有效治疗NLRP3相关疾病。既往研究报道，MNS、帕特诺苷、BAY 11-7082和INF39可抑制NLRP3的ATPase活性，并在体外显示出对NLRP3炎症小体的抑制活性。然而，这些化合物并非特异性NLRP3抑制剂，且具有多种生物活性，例如对酪氨酸激酶或NF-κB信号通路的抑制活性（Yip et al., 2004; Wang et al., 2006; Strickson et al., 2013; Cocco et al., 2017）。此外，MNS、帕特诺苷和BAY 11-7082尚未在NLRP3驱动疾病的动物模型中进行体内测试。CY-09直接与NLRP3的NACHT结构域结合并抑制其ATPase活性，而ATPase活性对于NLRP3寡聚化和炎症小体组装至关重要（Duncan等，2007）。此外，NACHT结构域中Walker A基序的突变（该基序是ATP与NLRP3结合所必需的）（MacDonald等，2013）会削弱CY-09与NLRP3的结合能力。此外，我们的结果清楚地表明，CY-09与ATP竞争性结合NLRP3，并抑制其ATPase活性以及随后的NLRP3寡聚化和炎症小体组装。重要的是，我们的研究结果表明，CY-09 对 NLRP3 ATPase 活性的抑制作用显著降低了 2 型糖尿病 (T2D) 和 CAPS 小鼠模型中的 NLRP3 炎症小体激活和症状。因此，我们的研究结果提示，ATPase 活性可作为筛选 NLRP3 驱动疾病候选药物的靶点。目前 NLRP3 相关疾病的临床治疗方法是使用靶向 IL-1β 的药物，但使用高特异性的小分子抑制剂（例如 CY-09）直接靶向 NLRP3 本身可能具有一定的优势。在 CAPS 小鼠模型中，CY-09 能有效预防死亡，但单独阻断 IL-1β 却无法达到此效果（Brydges 等，2009）。可能的原因是，炎症小体激活引起的 IL-18 生成或细胞焦亡也可能参与了病理过程。此外，IL-1β 也可由其他炎症小体产生，或以非炎症小体依赖的方式产生（Davis 等，2011；Netea 等，2015），因此，抑制 NLRP3 本身可能比阻断 IL-1β 的免疫抑制副作用更小。事实上，我们的结果表明，CY-09 对 AIM2 或 NLRC4 炎症小体没有影响，提示 CY-09 可能不会损害这些炎症小体在宿主防御中的作用。此外，小分子化合物通常比生物制剂更具成本效益（Fautrel，2012）。
2 型糖尿病的特征是胰岛素抵抗和高血糖，并可引起多种并发症，包括神经和肾脏损伤。然而，目前可用的药物无法有效纠正胰岛素抵抗的根本原因，大多数患者需要终身药物治疗（Nathan et al., 2009; Qaseem et al., 2012）。我们的研究表明，CY-09抑制NLRP3依赖性代谢炎症可有效逆转糖尿病小鼠的代谢紊乱。CY-09治疗对糖尿病小鼠的代谢炎症、高血糖和胰岛素抵抗均有显著的改善作用。因此，本研究提示，纠正NLRP3依赖性代谢炎症可能是治疗2型糖尿病的有效方法。考虑到NLRP3依赖性炎症在痛风、阿尔茨海默病和动脉粥样硬化进展中的作用，CY-09或其衍生物可用于开发针对这些疾病的新型NLRP3靶向疗法。[1]

C19H12F3NO3S2

423.43

423.021

C, 53.90; H, 2.86; F, 13.46; N, 3.31; O, 11.34; S, 15.14

1073612-91-5

44561595

Light yellow to yellow solid powder

4.9

115

1

8

4

28

672

0

S1C(N(C(/C/1=C\C1C=CC(C(=O)O)=CC=1)=O)CC1C=CC=C(C(F)(F)F)C=1)=S

DJTINRHPPGAPLD-DHDCSXOGSA-N

InChI=1S/C19H12F3NO3S2/c20-19(21,22)14-3-1-2-12(8-14)10-23-16(24)15(28-18(23)27)9-11-4-6-13(7-5-11)17(25)26/h1-9H,10H2,(H,25,26)/b15-9-

4-[[4-Oxo-2-thioxo-3-[[3-(trifluoromethyl)phenyl]methyl]-5-thiazolidinylidene]methyl]benzoic acid

CY 09; CY-09; 1073612-91-5; CY 09; 4-[[4-Oxo-2-thioxo-3-[3-(trifluoromethyl)benzyl]thiazolidin-5-ylidene]methyl]benzoic Acid; 4-[[4-oxo-2-sulfanylidene-3-[[3-(trifluoromethyl)phenyl]methyl]-1,3-thiazolidin-5-ylidene]methyl]benzoic acid; MFCD31619349; CY09; DJTINRHPPGAPLD-UHFFFAOYSA-N; (Z)-4-((4-Oxo-2-thioxo-3-(3- (trifluoromethyl)benzyl)thiazolidin-5- ylidene)methyl)benzoic acid; CY09

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ≥ 150 mg/mL (~354.25 mM)
H2O : ~1.1 mg/mL (~2.60 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.90 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.90 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。