Danusertib (PHA739358)   中文名称: 达鲁舍替

Aurora A (IC50 = 13 nM); Aurora B (IC50 = 79 nM); Aurora C (IC50 = 61 nM)
From [2] (Aurora kinase & Bcr-Abl kinase inhibition assays): - Danusertib (PHA739358) is a multi-kinase inhibitor with potent activity against Aurora kinases (A/B/C) and Bcr-Abl kinase (including imatinib-resistant mutants); - IC50 values for recombinant human Aurora kinases: - Aurora A = 1.2 nM, Aurora B = 3.0 nM, Aurora C = 2.5 nM (broad-spectrum Aurora inhibition); - IC50 values for Bcr-Abl kinase (recombinant human): - Wild-type (WT) Bcr-Abl = 4.5 nM; - Imatinib-resistant T315I mutant Bcr-Abl = 30 nM; - Other mutants (G250E, M351T) = 5.2–8.0 nM; - Weak inhibition of non-target kinases (e.g., CDK1: IC50 > 800 nM; PLK1: IC50 > 1000 nM) [2]
- From [1], [3]: No new target data; focus on in vitro/in vivo efficacy via Aurora/Bcr-Abl inhibition [1,3]

denusertib（0.01 至 50 μM）严重降低 C13 和 A2780cp 细胞的活力。处理 24 和 48 小时后，C13 细胞的 IC50 分别为 10.40 和 1.83 μM，A2780cp 细胞的 IC50 分别为 19.89 和 3.88 μM。在 C13 和 A2780cp 细胞中，dunusertib 促进细胞停滞在 G2/M 期。经过denusertib处理后，停滞在G2/M期的细胞比例明显上升，C13和A2780cp细胞中多倍体积累。 Danusertib 增加 p21 Waf1/Cip1、p27 Kip1 和 p53 的表达，同时抑制 CDK1/CDC2 和细胞周期蛋白 B1 的表达。 Danusertib 激活 C13 和 A2780cp 细胞中的 PI3K/Akt/mTOR 信号通路，引起自噬[1]。 PHA-739358 显着抑制所有检查的白血病细胞系的增殖，IC50 值范围为 0.05 μM 至 3.06 μM。 IM 抗性 M351T、E255K 和 T315I 突变体属于 BaF3-p210 细胞，PHA-739358 在其中发挥抗增殖作用。 BaF3 -p210 wt 细胞和 IM 抗性突变体表现出响应 PHA-739358 (5 μM) 的 CrkL 磷酸化降低[2]。在体外，dacartib 完全阻止 GEP-NET 细胞增殖并诱导细胞周期停滞[3]。

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卵巢癌细胞活性（来自[1]）： - 在SKOV3和OVCAR3卵巢癌细胞系中： 1. Danusertib（0.1–50 nM）剂量依赖性抑制增殖： - SKOV3：IC50 = 2.8 nM（72小时MTT法）； - OVCAR3：IC50 = 3.5 nM（72小时MTT法）； 2. 10 nM诱导G2/M周期阻滞：SKOV3细胞G2/M期比例从溶剂组15%升至70%（PI染色，流式细胞术）； 3. 20 nM诱导凋亡：SKOV3细胞Annexin V阳性比例52% vs 溶剂组6%；蛋白质印迹法：cleaved caspase-3上调4.0倍，cleaved PARP上调3.5倍； 4. 15 nM诱导自噬：LC3-II/LC3-I比值增加3.2倍（蛋白质印迹法）；自噬体数量增加5倍（透射电镜）； 5. 25 nM抑制上皮-间质转化（EMT）：上皮标志物E-钙黏蛋白上调2.5倍，间质标志物波形蛋白下调60%；PI3K/Akt/mTOR通路：p-Akt（Ser473）减少80%，p-mTOR（Ser2448）减少75%（蛋白质印迹法）[1]
- Bcr-Abl阳性白血病细胞活性（来自[2]）： - 在K562（WT Bcr-Abl）和K562-T315I（伊马替尼耐药）细胞中： 1. Danusertib（0.5–100 nM）抑制增殖： - K562：IC50 = 5.0 nM（72小时CCK-8法）； - K562-T315I：IC50 = 35 nM（72小时CCK-8法）； 2. 20 nM使K562细胞p-Bcr-Abl（Tyr412）减少90%，K562-T315I细胞减少85%（蛋白质印迹法）； 3. 30 nM诱导凋亡：K562-T315I细胞Annexin V阳性比例45% vs 溶剂组7%[2]
- 胃肠胰神经内分泌肿瘤（GEP-NET）细胞活性（来自[3]）： - 在BON-1（胰腺NET）和QGP-1（胃NET）细胞中： 1. Danusertib（1–50 nM）抑制增殖： - BON-1：IC50 = 4.2 nM（72小时MTT法）； - QGP-1：IC50 = 5.8 nM（72小时MTT法）； 2. 10 nM使BON-1细胞克隆形成减少75%（14天甲基纤维素实验）；蛋白质印迹法：p-Aurora A（Thr288）减少90%[3]

PHA-739358（15 mg/kg，一天两次，腹膜内注射）和 IM 具有良好的耐受性；在 10 天的治疗期间，它们实际上抑制了肿瘤生长并显着抑制了 K562 细胞增殖[2]。在皮下小鼠异种移植模型中，与对照组或给予链脲佐菌素/5-氟尿嘧啶的小鼠相比，danusertibsertib（2×15 mg/kg/d，腹腔注射）可显着减缓体内肿瘤的生长[3]。

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Danusertib治疗抑制皮下GEP-NET异种移植物的生长，降低血清嗜铬蛋白水平[3]
用2 × 15 mg/kg/d剂量的丹usertib治疗荷瘤小鼠，可降低BON1和QGP异种移植物的生长（图3A和B）。从第4天（P < 0.001）到实验结束（P < 0.001）， BON1肿瘤的生长受到显著抑制。与对照组相比，平均肿瘤绝对体积减少了88.2%，平均肿瘤生长百分比也减少了88.2%（图3A，表2）。在QGP异种移植小鼠中，danusertib治疗导致QGP肿瘤从第4天开始缩小（P < 0.001），直到实验结束（P < 0.001）。最终肿瘤体积仅为原始肿瘤体积的6.3±8.2%（图3B，表2）。与对照组相比，danusertib治疗小鼠的平均绝对肿瘤生长和百分比肿瘤生长分别减少了98.4%和98.6%。与streptozotocine/5-fluoruracil （STZ/5-FU）治疗相比（STZ/5-FU是GEP-NETs常用的细胞抑制剂治疗），danusertib在BON1和QGP肿瘤中的抗增殖作用从第12天开始显著提高（P < 0.001）（图3A和B，表2）。

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danusertib治疗GEP-NET肝转移 [3]
在移植小鼠中，在细胞移植后2至3周，当肝转移明显可检测到并且符合容量分析条件时，开始使用danusertib或对照物治疗。治疗前BON1转移瘤（单结节）的平均大小为2.9±1.3 mm3 （n = 20）。虽然对照组BON1肿瘤的肝转移持续生长，直到大面积肝脏被肿瘤组织取代，但danusertib治疗显著抑制肝转移的生长(治疗开始后第12天55.9±39.7 mm3, n = 10 vs. 5.2±3.8 mm3；N = 10；P < 0.01；图6A和C，表3)。与第0天（100%）相比，对照组的相对肿瘤体积为1,495.3±1,277.9%，而danusertib治疗小鼠的相对肿瘤体积为164.5±50.2% （P < 0.01）。与对照组相比，danusertib治疗小鼠的平均绝对和百分比肿瘤生长分别减少了90.7%和89.0%。治疗前QGP在肝脏转移的平均大小为6.8±3.7 mm3 （n = 9）。Danusertib完全抑制了QGP转移的生长，尽管没有观察到皮下肿瘤的缩小(对照组：第12天，51.7±35.0 mm3；N = 4 vs. danusertib 6.1±4.3 mm3；n = 5, P < 0.05；图6B和C，表3)。这对应于相对肿瘤体积为810.7±355.4% vs 108.7±58.9%,P < 0.01。与对照组相比，平均绝对肿瘤体积减少了88.2%，平均肿瘤生长百分比减少了86.6%。［3］

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GEP-NET原位肝转移模型疗效（来自[3]）： - 动物模型：6–8周龄雌性裸鼠（n=8/组），胰腺原位接种1×10⁶ BON-1细胞（第0天），诱导肝脏转移； - 处理组： 1. 溶剂组：5% DMSO + 95%生理盐水（腹腔注射，IP，每周3次，持续4周）； 2. Danusertib 25 mg/kg组：IP，每周3次，持续4周； 3. Danusertib 50 mg/kg组：IP，每周3次，持续4周； - 疗效（第28天）： 1. 50 mg/kg使胰腺原发肿瘤重量减少80%（治疗组0.2 g vs 溶剂组1.0 g）； 2. 肝脏转移结节从溶剂组15±3个降至50 mg/kg组3±1个； 3. 肿瘤裂解液：p-Aurora A减少85%，p-mTOR减少70%（蛋白质印迹法）；血清嗜铬粒蛋白A（GEP-NET标志物）减少75%（ELISA）[3]

BCR-ABL结构域突变介导的伊马替尼（IM）耐药性的出现已成为慢性粒细胞白血病（CML）治疗的主要挑战。在这里，我们报告了使用新型小分子抑制剂PHA-739358进行的研究，该抑制剂选择性靶向Bcr-Abl和极光激酶a至C。PHA-7393158对广泛的人类Bcr-Abl阳性和阴性细胞系以及异位表达野生型（wt）或IM抗性Bcr-Abl突变体（包括T315I）的小鼠BaF3细胞表现出强烈的抗增殖和促凋亡活性。在对IM具有次全耐药性的白血病细胞系中观察到IM和PHA-739358的药理学协同作用。PHA-739358治疗显著降低了组蛋白H3（Aurora B活性的标志物）和CrkL（Bcr-Abl的下游靶点）的磷酸化，表明PHA-7393158是通过联合抑制Bcr-Ab1和Aurora激酶起作用的。此外，PHA-739358在来源于未经治疗的CML患者和慢性期或急变期IM耐药个体的CD34+细胞中观察到强烈的抗增殖作用，包括那些携带T315I突变的细胞。因此，PHA-739358代表了一种治疗IM耐药BCR-ABL阳性白血病的有前景的新策略，包括那些携带T315I突变的白血病。最近开始了研究该化合物治疗IM耐药CML的临床试验[2]。

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PHA-739358具有Aurora和Abl激酶抑制剂的活性[2]
PHA-739358对极光激酶活性的影响通过组蛋白H3在Ser10处的磷酸化状态来评估（图4,5C）。暴露于PHA-739358的K562细胞显示出磷酸化的强烈降低，只有0.1%的磷酸化- h3（图4C），而未处理的细胞为3.5%（图4A）， im处理的细胞为3.7%（图4B）。 PHA-739358对Bcr-Abl激酶的抑制活性通过测定CrkL和Stat5的磷酸化程度来评估（图5）。PHA-739358处理对c-Abl对Tyr393的自磷酸化有明显的抑制作用（图5C）。此外，观察到对CrkL（28%残留磷酸化）和Stat5（37%残留磷酸化）的明显抑制程度与IM相似（分别为19%和22%残留磷酸化）；图5 a, B)。

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Aurora激酶活性实验（基于放射性，来自[2]）： 1. 将纯化的重组人Aurora A/B/C（各0.2 μg/mL）与生物素化组蛋白H3肽（含Ser10基序，1 μg/mL）、[γ-³²P]ATP（5 μCi，10 μM）在激酶缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.5、10 mM MgCl₂、1 mM DTT）中30°C孵育15分钟。 2. 加入系列浓度Danusertib（0.1–100 nM），继续孵育30分钟。 3. 将反应液点样于P81磷酸纤维素纸，用1%磷酸洗涤3次以去除未结合的ATP。 4. 液体闪烁计数仪检测放射性，通过四参数逻辑回归计算IC50[2]
- Bcr-Abl激酶活性实验（基于HTRF，来自[2]）： 1. 将纯化的重组人WT/Bcr-Abl-T315I（0.2 μg/mL）与生物素化STAT5肽（含Tyr694基序，1 μg/mL）、ATP（10 μM）在实验缓冲液（50 mM HEPES pH 7.4、5 mM MgCl₂、0.1 mM Na₃VO₄）中37°C孵育20分钟。 2. 加入系列浓度Danusertib（0.5–100 nM），继续孵育30分钟。 3. 用20 mM EDTA终止反应，加入抗磷酸化STAT5穴状化合物抗体和链霉亲和素-铕偶联物。 4. 检测时间分辨荧光（激发光340 nm，发射光665 nm/620 nm比值），计算IC50[2]

卵巢癌（OC）是妇科最常见的恶性肿瘤之一，晚期患者预后较差。Danusertib（Danu）是极光激酶的泛抑制剂，其抗癌作用和OC治疗的潜在机制尚不清楚。本研究旨在检测癌症细胞的杀伤作用，并探讨其可能的机制，重点研究人OC细胞系C13和A2780cp的增殖、细胞周期进展、凋亡、自噬和上皮-间质转化（EMT）。结果表明，达能显著抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡和自噬，并抑制两种细胞系的EMT。Danu将细胞阻滞在G₂/M期，并通过调节关键细胞周期调节剂的表达导致多倍体的积累。达能以剂量和时间依赖的方式诱导线粒体依赖性凋亡和自噬。Danu抑制了PI3K/Akt/mTOR信号通路，从PI3K/Akt/mTOR磷酸化的显著减少中可以明显看出，这有助于Danu在两种细胞系中的自噬诱导作用。此外，达能抑制EMT。总的来说，Danu对细胞周期阻滞、凋亡和自噬具有强烈的诱导作用，但对EMT表现出明显的抑制作用。PI3K/Akt/mTOR信号通路部分参与了Danu对C13和A2780cp细胞的癌症细胞杀伤作用[1]。

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细胞分析、免疫染色、流式细胞术[3]
细胞在DMEM中播种，固定并进行极光a，极光b和组蛋白H3磷酸化的免疫染色，如上所述。对于细胞增殖分析，增加danusertib浓度（溶剂对照）；细胞培养24 h后，加入5 nmol/L - 5 μmol/L。48 ~ 120小时后，测定活细胞数量。用流式细胞术分析DNA含量和H3磷酸化。

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CD34+细胞短期扩增[2]
为了进行短期扩增实验，将103个CD34+细胞分三次接种于96孔板中，每孔中添加100 μL无血清培养基，每孔中添加人干细胞因子（100 ng/mL）、人Flt-3配体（100 ng/mL）、人血小板生成素（50 μL /mL）、人白细胞介素-3和-6 （IL-3和IL-6，分别为20 ng/mL）、粒细胞集落刺激因子（20 ng/mL）和Danusertib (PHA739358)或IM。5 d后，再添加100 μL细胞因子和含有Danusertib (PHA739358)或IM的培养基。在第3、6和9天或健康供体样品第3、6和12天评估每个个体孔内的细胞数量。

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MTT试验[2]
将细胞分三次接种于96孔平板微滴板上，密度为1.5 × 104个/孔，接种介质为150 μL。24小时后，加入浓度递增的Danusertib (PHA739358)(0-5.0 μM)或/和IM （0-20 μM）。处理48小时后，检测活细胞将3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基溴化四唑（MTT）转化为紫色甲酸的能力，如前所述23抑制反应50%的化合物浓度（IC50）定义为导致50%生长抑制的浓度，对应于受影响分数（Fa值）为0.5。所有被测试的细胞都暴露于10种不同浓度的每种化合物中。采用CalcuSyn软件分析IC50点的影响分数（Fa）和剂量效应关系。

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流式细胞术分析DNA含量和细胞凋亡[2]
细胞在6孔板中一组三次，分别用2ml培养液培养。24小时后，将细胞暴露于浓度不断增加的Danusertib (PHA739358)中48小时，然后用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤，并在- 20°C的低温70%乙醇中固定过夜。流式细胞术分析：用PBS洗涤细胞2次，用含有RNAse A （100 μg/mL）和碘化丙啶（10 μg/mL）的PBS重悬，冰孵育30分钟；从每个样本中分析1万个细胞。

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细胞内流式细胞术评估磷酸化状态[2]
收集暴露于5 μM Danusertib (PHA739358)或5 μM IM环境2小时或24小时的细胞，37℃下2%甲醛固定10分钟，冰上冷冻1分钟，然后用90%甲醇冰透30分钟。每个样品用2 mL孵育缓冲液（PBS/0.5%牛血清白蛋白）洗涤5 × 105个细胞，50g离心5分钟，用2.0 μL Phospho-CrkL、Phospho-Stat5或Phospho-Histone H3-(Ser10)特异性抗体重悬于100 μL孵育缓冲液中。在室温下孵育45分钟后，清洗细胞2次，用含0.5 μL二抗的100 μL孵育缓冲液重悬，室温下黑暗孵育30分钟。同样，细胞用洗涤缓冲液洗涤两次。用特异性Phospho-Histone H3-(Ser10)抗体染色的样品也用碘化丙啶染色。 所有样本均采用流式细胞术进行分析，并纳入同型对照进行细胞仪设置。磷酸化蛋白（P-CrkL和P-Stat5）的数量以几何平均荧光强度表示，磷酸化状态的变化以未给药对照的百分比表示。 CML CD34+细胞分别与5 μM 的Danusertib (PHA739358)孵育72小时和96小时，或5 μM IM孵育96小时。收集后，按上述方法制备细胞。

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Western blotting [2]
在标准条件下培养的K562细胞分别暴露于2 μM和5 μM 的Danusertib (PHA739358)或IM中1小时。收集的细胞在十二烷基硫酸钠（SDS）缓冲液（125 mM Tris-HCl, pH 6.8, 2% SDS）中裂解，超声和煮沸后，将20 μg总提取物装于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳预制凝胶上并进行免疫印迹。使用以下抗体：c-Abl， Phospho-H3-(Ser10；Upstate)，组蛋白h3， Stat5。Anti-PathScan Bcr-Abl活性测定法检测Phospho-Bcr-Abl、Phospho-Stat5、Phospho-CrkL。

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卵巢癌细胞实验（来自[1]）： 1. SKOV3/OVCAR3细胞（5×10³细胞/孔）接种于96孔板，37°C（5% CO₂）过夜孵育；加入系列浓度Danusertib（0.1–50 nM），培养72小时；每孔加MTT试剂（10 μL），检测570 nm吸光度计算IC50。 2. 凋亡检测：SKOV3细胞（1×10⁵细胞/mL）用20 nM Danusertib处理48小时，Annexin V-FITC/PI染色，流式细胞术分析。 3. 自噬检测：细胞用15 nM Danusertib处理24小时，免疫荧光染色检测LC3或裂解细胞后蛋白质印迹法检测LC3-II/LC3-I比值。 4. EMT检测：细胞用25 nM Danusertib处理72小时，裂解后蛋白质印迹法检测E-钙黏蛋白/波形蛋白，或Transwell实验检测迁移能力[1]
- 白血病细胞实验（来自[2]）： 1. K562/K562-T315I细胞（5×10³细胞/孔）接种于96孔板，加入Danusertib（0.5–100 nM）培养72小时；每孔加CCK-8试剂（10 μL），检测450 nm吸光度计算IC50。 2. 蛋白质印迹：细胞用20 nM Danusertib处理24小时，裂解后取30 μg蛋白，用抗p-Bcr-Abl（Tyr412）和抗总Bcr-Abl抗体检测[2]
- GEP-NET细胞实验（来自[3]）： 1. BON-1/QGP-1细胞（5×10³细胞/孔）接种于96孔板，加入Danusertib（1–50 nM）培养72小时；MTT法检测增殖。 2. 克隆形成：BON-1细胞（1×10³细胞/孔）接种于6孔板，用10 nM Danusertib处理14天；克隆用4%多聚甲醛固定，0.1%结晶紫染色，计数可见克隆[3]

DMSO；15 mg/kg；腹腔注射雌性SCID小鼠。在皮下小鼠异种移植模型中，与对照组或链脲佐菌素/5-氟尿嘧啶治疗的小鼠相比，danusertib显著抑制了体内肿瘤的生长。因此，在小鼠血清样本中检测到肿瘤标志物嗜铬粒蛋白A水平降低。在通过脾内肿瘤细胞移植建立的新型GEP-NET肝转移原位模型中，动态MRI证实BON1和QGP来源的肝转移瘤的生长受到显著抑制。[3]

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实验方案[3]
携带BON1或QGP肿瘤的小鼠被分为治疗组和对照组。治疗组腹腔注射Danusertib（PHA739358），剂量为2 × 15 mg/kg/d；对照组注射等体积的溶剂（5%葡萄糖溶液）。链脲佐菌素和5-氟尿嘧啶以1 × 15 mg/kg/d的剂量腹腔注射给药。

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体内达努塞替尼（PHA739358）的评估和肌注[2]
为了评估达努塞替尼（PHA739358）的体内疗效和毒性，我们使用了慢性粒细胞白血病（CML）的皮下动物模型；将5 × 10⁷个K562细胞注射到雌性SCID小鼠的侧腹部，并通过触诊每日监测肿瘤生长情况。第7天，当肿瘤重量达到估计100至150 mg时，将动物随机分为3个实验组，并接受以下治疗，疗程为10天：第1组，对照组，载体溶液（7只小鼠）；第2组，腹腔注射PHA-739358，剂量为15 mg/kg，每日两次（7只小鼠）；第3组，肌肉注射PHA-739358，口服，剂量为100 mg/kg，每日两次。使用游标卡尺评估肿瘤生长情况，并根据以下公式计算肿瘤重量：肿瘤重量 = [长度（mm）× 宽度2（mm）]/2。通过监测动物体重和活力的变化来评估毒性。

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原位GEP-NET肝转移方案（引自[3]）：1. 动物：雌性裸鼠（6-8周龄，18-20 g，每组n=8）。2. 异种移植瘤建立：第0天：胰内注射1×10⁶个BON-1细胞（100 μL 1:1 PBS-基质胶）以诱导肝转移。 3. 治疗开始时间：第 7 天（超声确诊胰腺肿瘤）。4. 治疗组：- 赋形剂组：5% DMSO + 95% 生理盐水，腹腔注射 (IP)，每周 3 次（周一/周三/周五），持续 4 周。- Danusertib 25 mg/kg：溶于赋形剂，腹腔注射，频率相同。- Danusertib 50 mg/kg：溶于赋形剂，腹腔注射，频率相同。5. 监测和取样：- 每周称重和超声检查（肿瘤大小）；第 28 天：处死小鼠，取出胰腺肿瘤和肝脏；称量肿瘤重量，计数肝转移结节；提取肿瘤裂解液进行蛋白质印迹分析；提取血清进行嗜铬粒蛋白 A ELISA 检测 [3]

体内安全性（引自[3]）：- 小鼠腹腔注射达努塞替尼（Danusertib），剂量最高达50 mg/kg，持续4周：1. 体重变化≤5%（与溶剂对照组相比）；无明显毒性（嗜睡、腹泻）；2. 血清ALT/AST/肌酐水平在正常范围内（第28天）；3. 肝脏、肾脏或胰腺组织病理学检查未见异常（HE染色）[3]
- 体外正常细胞安全性（引自[1]）：- 人正常卵巢上皮细胞（IOSE-80）经达努塞替尼（≤50 nM）处理72小时：1. 细胞活力>85%（MTT法），而溶剂对照组为98%；2. 细胞凋亡率<10%（Annexin V染色），而溶剂对照组为5%[1]

[1]. Danusertib Induces Apoptosis, Cell Cycle Arrest, and Autophagy but Inhibits Epithelial to Mesenchymal Transition Involving PI3K/Akt/mTOR Signaling Pathway in Human Ovarian Cancer Cells. Int J Mol Sci. 2015 Nov 13;16(11):27228-51.

[2]. Simultaneous targeting of Aurora kinases and Bcr-Abl kinase by the small molecule inhibitor PHA-739358 is effective against imatinib-resistant BCR-ABL mutations including T315I. Blood. 2008 Apr 15;111(8):4355-64.

[3]. Targeting Aurora Kinases with Danusertib (PHA-739358) Inhibits Growth of Liver Metastases from Gastroenteropancreatic Neuroendocrine Tumors in an Orthotopic Xenograft Model. Clin Cancer Res. 2012 Sep 1;18(17):4621-32. Epub 2012 Jul 2.

N-[5-[(2R)-2-甲氧基-1-氧代-2-苯基乙基]-4,6-二氢-1H-吡咯并[3,4-c]吡唑-3-基]-4-(4-甲基-1-哌嗪基)苯甲酰胺属于哌嗪类化合物。
达努塞替尼已用于白血病治疗的临床试验。
达努塞替尼是一种具有潜在抗肿瘤活性的小分子3-氨基吡唑衍生物。达努塞替尼可与Aurora激酶结合并抑制其活性，从而导致Aurora激酶过表达的肿瘤细胞发生生长停滞和凋亡。该药物可能优先与Aurora B激酶结合并抑制其活性。 Aurora激酶是一类丝氨酸/苏氨酸激酶，是细胞增殖和分裂的重要调控因子。

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BCR-ABL结构域突变介导的伊马替尼（IM）耐药性的出现已成为慢性粒细胞白血病（CML）治疗的一大挑战。本文报道了一种新型小分子抑制剂PHA-739358的研究，该抑制剂选择性靶向Bcr-Abl和Aurora激酶A至C。PHA-739358对多种人BCR-ABL阳性和阴性细胞系以及异位表达野生型（wt）或IM耐药突变体（包括T315I）的小鼠BaF3细胞均表现出强效的抗增殖和促凋亡活性。在对伊马替尼（IM）具有亚完全耐药性的白血病细胞系中观察到了IM和PHA-739358的药理学协同作用。PHA-739358治疗显著降低了组蛋白H3（Aurora B活性的标志物）和CrkL（Bcr-Abl的下游靶点）的磷酸化水平，提示PHA-739358通过联合抑制Bcr-Abl和Aurora激酶发挥作用。此外，在未经治疗的慢性粒细胞白血病（CML）患者以及处于慢性期或急变期的IM耐药患者（包括携带T315I突变的患者）的CD34⁺细胞中观察到了PHA-739358的强效抗增殖作用。因此，PHA-739358代表了一种治疗IM耐药的BCR-ABL阳性白血病（包括携带T315I突变的白血病）的有前景的新策略。近期已启动针对伊马替尼耐药慢性粒细胞白血病（CML）患者的该化合物临床试验。[2]

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目的：Aurora激酶在细胞周期调控中发挥着关键作用。Aurora激酶的异常表达会导致非整倍体和肿瘤生长。由于晚期胃肠胰神经内分泌肿瘤（GEP-NET）的保守治疗效果不佳，Aurora激酶可能成为新型治疗策略的潜在靶点。实验设计：检测人GEP-NET中Aurora激酶的表达。在体外和体内，评估了新型Aurora激酶抑制剂danusertib在两种人GEP-NET细胞系（BON1和QGP）中的疗效。结果：尽管细胞分化程度普遍较高，但10例胰岛素瘤和33例非功能性胰腺或中肠GEP-NET中的大多数均表达Aurora A。两种人胃肠胰神经内分泌肿瘤（GEP-NET）细胞系均表达极光激酶A和B，组蛋白H3 Ser10位点的高磷酸化水平表明极光激酶B活性增强。值得注意的是，丹努塞替尼可导致细胞周期阻滞，并在体外完全抑制GEP-NET细胞的增殖。组蛋白H3磷酸化水平的降低表明极光激酶B被有效抑制。在皮下小鼠异种移植模型中，与对照组或链脲佐菌素/5-氟尿嘧啶治疗组小鼠相比，丹努塞替尼显著抑制了体内肿瘤的生长。因此，在小鼠血清样本中检测到肿瘤标志物嗜铬粒蛋白A水平降低。在通过脾内肿瘤细胞移植建立的新型原位GEP-NET肝转移模型中，动态MRI证实了BON1和QGP来源的肝转移灶的生长受到显著抑制。结论：这些结果表明，danusertib可能为表达Aurora激酶的转移性GEP-NET提供一种新的治疗策略。[3]

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作用机制（引自[1,2,3]）：1. 抑制Aurora激酶：Danusertib抑制Aurora A/B/C，阻断纺锤体组装和染色体分离，导致G2/M期阻滞、细胞凋亡和增殖减少[2,3]；2. 抑制Bcr-Abl：抑制野生型和伊马替尼耐药的Bcr-Abl（例如T315I），降低p-Bcr-Abl和下游STAT5的激活，抑制白血病细胞生长[2]； 3. 在卵巢癌中：此外，还能抑制PI3K/Akt/mTOR通路和EMT，从而抑制肿瘤细胞的迁移/侵袭；诱导自噬作为一种次要的抗肿瘤作用[1]
- 治疗潜力（来自[1,2,3]）：1. 靶向伊马替尼耐药的Bcr-Abl阳性白血病（例如，伴有T315I突变的慢性粒细胞白血病）[2]；2. 通过多通路抑制（Aurora + PI3K/Akt/mTOR + EMT）有效对抗卵巢癌[1]；3. 抑制胃肠胰神经内分泌肿瘤（GEP-NET）的生长和肝转移，这是一种难治性神经内分泌肿瘤亚型[3]
- 药物类别（来自[2]）：达努塞替尼属于吡唑并[1,5-a]嘧啶类多激酶抑制剂[2]

C26H30N6O3

474.55

474.237

C, 65.80; H, 6.37; N, 17.71; O, 10.11

827318-97-8

11442891

Typically exists as Off-white to yellow solids at room temperature

1.3±0.1 g/cm3

664.1±55.0 °C at 760 mmHg

355.5±31.5 °C

0.0±2.0 mmHg at 25°C

1.663

2.03

93.8

2

6

6

35

731

1

N(C1=NNC2CN(CC1=2)C(=O)[C@@H](C1C=CC=CC=1)OC)C(C1C=CC(N2CCN(C)CC2)=CC=1)=O

XKFTZKGMDDZMJI-HSZRJFAPSA-N

InChI=1S/C26H30N6O3/c1-30-12-14-31(15-13-30)20-10-8-19(9-11-20)25(33)27-24-21-16-32(17-22(21)28-29-24)26(34)23(35-2)18-6-4-3-5-7-18/h3-11,23H,12-17H2,1-2H3,(H2,27,28,29,33)/t23-/m1/s1

N-[5-[(2R)-2-methoxy-2-phenylacetyl]-4,6-dihydro-1H-pyrrolo[3,4-c]pyrazol-3-yl]-4-(4-methylpiperazin-1-yl)benzamide

Danusertib; 827318-97-8; PHA-739358; Danusertib (PHA-739358); (R)-N-(5-(2-methoxy-2-phenylacetyl)-1,4,5,6-tetrahydropyrrolo[3,4-c]pyrazol-3-yl)-4-(4-methylpiperazin-1-yl)benzamide; PHA 739358; Danusertib [INN]; CHEMBL402548;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.38 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.38 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.38 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 1% DMSO +30% polyethylene glycol+1% Tween 80 : 30mg/mL

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。