Glutathione (GSH) – Diethylmaleate depletes cellular GSH by conjugation [1].
MAPK pathway components (ERK, p38, JNK) – activation via phosphorylation (Thr202/Tyr204 for ERK; Thr180/Tyr182 for p38; Thr183/Tyr185 for JNK) [1].

DEM可诱导转化细胞中GSH（L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸）代谢上调，并下调癌症相关通路、趋化因子信号通路、细胞因子-细胞因子受体通路以及黏着斑。DEM似乎能改变转化细胞的微环境，从而抑制肿瘤细胞的生长。DEM对转化细胞具有浓度依赖性的细胞毒性。0.25 mM的DEM可使细胞活力降低至75%。DEM与GSHe共同作用可抑制DEM诱导的细胞毒性。DEM暴露可使转化细胞中活性氧（ROS）的生成量增加数个数量级。这可从CMH2DCFDA荧光强度的剂量和时间依赖性增加中得到证实。此外，DEM激活MAPK通路，DEM诱导的ERK激活被发现是由于Thr 202/204位点的磷酸化所致。

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细胞实验：将DEM配制成100% DMSO储备液，然后用DMEM稀释至所需浓度，使培养孔中DMSO含量低于0.1%。简而言之，将细胞（1 × 10⁴ 个细胞/孔）接种于96孔板中，并使其过夜贴壁。随后，将这些细胞暴露于不同测试浓度（0.05-1 mM）的DEM中，或与等摩尔浓度（0.25 mM）的DEM+GSHe共同暴露24小时。使用酶标仪在570 nm处测定光密度值（OD）来确定细胞活力。

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马来酸二乙酯 (0.25 mM) 以浓度依赖性方式（0.05-1 mM）将转化后的C3H10T1/2细胞的活力在24小时后降低至约75%；与等摩尔浓度的GShE (0.25 mM) 共同暴露可抑制这种细胞毒性[1]。
马来酸二乙酯 (0.1-0.5 mM，18小时) 以浓度和时间依赖性方式降低细胞内GSH含量；在0.25 mM浓度下处理24小时，GSH含量下降近50%； 0.5 mM 处理 18 小时可显著降低 GSH [1]。
马来酸二乙酯 以剂量和时间依赖的方式增加转化细胞中 ROS 的生成（通过 H2DCFDA 荧光测量）[1]。
马来酸二乙酯 (0.25 mM，18 小时) 可诱导转化细胞的细胞周期停滞于 G0/G1 期； 0.25 mM 的浓度使 TUNEL 阳性细胞核数量增加 6-8 倍，0.5 mM 的浓度使 TUNEL 阳性细胞核数量增加 15-18 倍 [1]。
马来酸二乙酯 (0.25 mM) 激活了 MAPK 通路：在 tC3H10T1/2 细胞中，ERK 在 Thr202/Tyr204 位点的磷酸化（15 分钟后可检测到）、p38 在 Thr180/Tyr182 位点的磷酸化（30 分钟后）以及 JNK 在 Thr183/Tyr185 位点的磷酸化（12-18 小时后）。用 ERK 抑制剂 PD98059 (50 μM) 或 p38 抑制剂 SB203580 (30 μM) 预孵育可抑制 DEM 诱导的细胞毒性高达 95%； JNK抑制剂SP600125（20 μM）部分有效（细胞活力提高至85%）。ERK1/2和p38的激活彼此独立[1]。
马来酸二乙酯（0.25 mM）使tC3H10T1/2细胞在软琼脂中的集落形成频率降低了27%，并降低了集落中的DNA含量[1]。
马来酸二乙酯（0.25 mM，18 h）上调了参与谷胱甘肽代谢的基因：GSTA1（9.19倍）、GSTA2（10.03倍）、GSTA3（7.17倍）、GCLC（3.61倍）、GCLM（3.56倍）、GSS（2.66倍）、ODC1（2.05倍）。下调通路包括癌症通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用（18 个基因，p=0.0008）、黏着斑（18 个基因，p=0.0176）、趋化因子信号传导（12 个基因，p=0.0015）等。下调基因包括 FGF18、CXCL12、PDGFB、TGFB2、CAMK2A 等[1]。

经DEM处理的动物精子活力和附睾精子数量显著降低。DEM暴露也影响生育力，这可从受孕率和产仔数中看出。DEM产生的氧化应激会导致谷胱甘肽耗竭，进而影响雄性小鼠的生殖能力，并在转录水平上调节抗氧化防御系统的各个组成部分。

细胞活力检测（MTT法）：将转化后的C3H10T1/2或BALB/c 3T3细胞以1×10⁴个细胞/孔的密度接种于96孔板中，过夜培养使其贴壁，然后用0.05–1 mM的DEM处理，或同时用等摩尔浓度（0.25 mM）的DEM+GShE处理24小时。使用酶标仪在570 nm处测定吸光度值（OD值）来检测细胞活力[1]。
GSH测定（DTNB法）：将细胞以2×10⁶个/瓶的密度接种，用DEM（0.1、0.25、0.5 mM）或DEM+GShE处理6、12、18、24小时。细胞在提取缓冲液（0.1% Triton-X，0.6% 磺基水杨酸，0.1 M 磷酸钾缓冲液，pH 7.5）中裂解，超声处理，离心。将上清液与 DTNB 和谷胱甘肽还原酶混合，加入 NADPH，记录 412 nm 处的吸光度 [1]。
使用 CMFDA 染料测定 GSH：将细胞以 2×10⁴/孔的密度接种于黑色底 96 孔板中，暴露于 DEM 或 DEM+GShE 18 小时，用 1 μM CMFDA 染色 30 分钟，在激发波长 488 nm/发射波长 510–540 nm 处测量荧光强度；也使用Hoechst核染色进行成像[1]。
ROS测定（H2DCFDA）：将细胞以2×10⁴/孔的密度接种于黑色底96孔板中，分别用DEM或DEM+GShE处理0、1、2、4、6小时，然后用5 μM H2DCFDA孵育30分钟，在激发波长485 nm/发射波长530 nm处测量荧光强度[1]。
细胞周期分析：将细胞以1×10⁶/孔的密度接种于6孔板中，分别用DEM或DEM+GShE处理18小时，收集细胞，乙醇固定，用RNase（250 μg，1小时，37℃）孵育，用碘化丙啶（50 μg）染色，并通过流式细胞仪（BD FACS Canto II）进行分析[1]。
TUNEL检测：将细胞接种于盖玻片上（0.5×10⁶），暴露于 DEM 或 DEM+GShE 18 小时，用 Hoechst 染色，在荧光显微镜下计数 TUNEL 阳性细胞核（5 个随机区域，占 100 个细胞核的百分比）[1]。
MAPK 的 Western blot：将细胞以 2×10⁶/孔的密度接种于 6 孔板中，预先用激酶抑制剂（PD98059 50 μM、SB203580 30 μM、SP600125 20 μM）孵育 2 小时，然后暴露于 DEM (0.25 mM) ± GShE 1、6、12、18 小时。用含蛋白酶抑制剂混合物的 Cell Lytic-M 裂解细胞，进行蛋白定量（Bradford 法），取 50 μg 蛋白进行 10% SDS-PAGE 电泳，转移至 PVDF 膜，用一抗（p-ERK，ERK；p-p38，p38；p-JNK，JNK；1:1000）孵育，再用 HRP 标记的二抗（1:10000）孵育，最后通过化学发光法检测 [1]。
软琼脂克隆形成实验：将细胞（5000 个/孔）悬浮于 0.33% 琼脂糖的完全培养基中，置于 24 孔板中，底部铺有 0.5% 琼脂糖，每 5 天更换一次培养基，培养 15 天。用 5% 吉姆萨染液染色并计数克隆（>50 个细胞）。使用基质溶解液裂解后，用 CyQuant GR 染料（激发波长 485 nm/发射波长 520 nm）测定菌落中的 DNA 含量 [1]。
微阵列：将 tC3H10T1/2 细胞暴露于 DEM (0.25 mM) 18 小时，提取总 RNA，使用 Agilent 低输入 RNA 线性扩增试剂盒将 cRNA 用 Cy3 标记，与全基因组小鼠 8×60K 芯片杂交（65 °C 下杂交 16 小时），使用 Agilent 微阵列扫描仪扫描，并使用 GeneSpring GX v11.5 软件进行分析 [1]。
qRT-PCR 验证：将 tC3H10T1/2 和 tBALB/c 细胞暴露于 DEM (0.25 mM) 或 DEM+GShE 18 小时，提取 RNA。 cDNA 合成，SYBR Green qPCR，引物针对 GSTA1、GSTA3、GCLM、GSS、FGF18、CXCL12、PDGFB、TGFB2、CAMK2A，以 GAPDH 为内参进行标准化。倍数变化通过 2^‑ΔΔCT 计算 [1]。

溶于玉米油；6mmol/kg；腹腔注射 Sprague-Dawley 大鼠

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浓度为 0.25 mM 的马来酸二乙酯 (DEM) 对非转化细胞无细胞毒性，但可将转化细胞的存活率降低至 75% [1]。
与等摩尔浓度的谷胱甘肽酯 (GShE) (0.25 mM) 共同暴露可阻断 DEM 诱导的细胞毒性、谷胱甘肽 (GSH) 耗竭、活性氧 (ROS) 增加、细胞周期阻滞、TUNEL 阳性、MAPK 激活和基因表达变化 [1]。
本研究未提供体内毒性数据；作者引用了其他报告（未摘录），这些报告指出 DEM 可延缓肿瘤诱导并降低体内肿瘤发生率 [1]。

Chem Biol Interact.2014 Aug 5;219:37-47;Biochem Pharmacol.1992 Feb 4;43(3):451-6.

马来酸二乙酯是由马来酸的两个羧基与乙醇缩合而成的马来酸酯。它在室温下为无色液体（熔点-10℃），在1个大气压下的沸点为220℃。它常用作有机合成中Diels-Alder环加成反应的亲二体试剂。它还具有消耗谷胱甘肽的作用。它既是马来酸酯又是乙酯。其官能团与乙醇相关。
另见：2-丁烯酸(2Z)-，二-C8-15-烷基酯（注：已移至此处）。

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马来酸二乙酯是一种马来酸酯衍生物，它通过谷胱甘肽S-转移酶的结合作用消耗细胞内的谷胱甘肽(GSH)。它不是GSH生物合成酶的抑制剂。本研究中，DEM 的浓度范围为 0.05–1 mM，其中 0.25 mM 被选作大多数实验的中等 GSH 耗竭剂量。DEM 的作用可通过与谷胱甘肽单乙酯 (GShE) 共同处理而逆转，证实了 GSH 耗竭的特异性 [1]。转化细胞（tC3H10T1/2 和 tBALB/c）的基础 GSH 水平比非转化细胞高 1.6 至 1.8 倍 [1]。DEM 暴露导致 2260 个基因上调和 2920 个基因下调 (p<0.05)，其中 52.91% 的基因变化超过 2 倍，27.9% 超过 3 倍，12.39% 超过 4 倍，6.8% 超过 5 倍。微阵列数据已存入 GEO，登录号为 GSE44650 [1]。
DEM 下调的通路包括细胞因子-细胞因子受体相互作用、粘着斑、癌症通路、趋化因子信号传导、轴突导向、间隙连接、TGF-β 信号传导等（详见表 4 和补充表 S1）[1]。

C8H12O4

172.18

172.073

141-05-9

5271566

Colorless to light yellow liquid

1.1±0.1 g/cm3

214.0±0.0 °C at 760 mmHg

−10 °C(lit.)

93.3±0.0 °C

0.2±0.4 mmHg at 25°C

1.443

1.68

52.6

0

4

6

12

164

0

CCOC(=O)/C=C\C(=O)OCC

IEPRKVQEAMIZSS-WAYWQWQTSA-N

InChI=1S/C8H12O4/c1-3-11-7(9)5-6-8(10)12-4-2/h5-6H,3-4H2,1-2H3/b6-5-

2-Butenedioic acid (2Z)-, diethyl ester

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 9.09 mg/mL (52.79 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 +5% Tween-80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 90.9 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80+，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。