DIM-C-pPhOCH3

Nur77
Nur77 (Nuclear Receptor Subfamily 4, Group A, Member 1, also known as NGFI-Balpha), an orphan nuclear receptor [1]

体外活性：DIM-C-pPhOCH3 是 Nur77（神经生长因子诱导的 Bα，缩写为 NGFI-Bα 或 Nur77）的激动剂。 Nur77 是一种孤儿核受体，没有已知的内源配体，据报道与正常结肠组织相比，其在结肠肿瘤中过度表达。 DIM-C-pPhOCH3 能够降低 RKO 结肠癌细胞的存活率并诱导细胞凋亡，同时诱导肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 (TRAIL) 蛋白。 DIM-C-pPhOCH3 诱导的细胞凋亡和 TRAIL 被 Nur77 (iNur77) 的小抑制性 RNA 显着抑制；然而，RNA干扰研究表明DIM-C-pPhOCH3也能诱导不依赖于Nur77的细胞凋亡。使用微阵列对 DIM-C-pPhOCH3 诱导的基因表达进行分析，鉴定出几种促凋亡基因，并在存在或不存在 iNur77 的情况下通过逆转录 PCR 进行分析，表明程序性细胞死亡基因 1 的诱导是 Nur77 依赖性的，而胱硫醚酶和激活转录因子 3 不依赖于 Nur77。 DIM-C-pPhOCH3 (25 mg/kg/d) 也抑制携带 RKO 细胞异种移植物的无胸腺裸鼠的肿瘤生长。这些结果表明，DIM-C-pPhOCH3 代表了一类新型抗结肠癌药物，通过受体依赖性和受体非依赖性途径发挥作用。激酶测定：微阵列研究侧重于早期诱导基因，RKO 细胞用 DMSO 或 12.5 μmol/L DIM-C-pPhOCH3 处理 2 和 6 小时。按照逆转录 PCR (RT-PCR) 实验所述分离 RNA，并使用 Codelink 全基因组生物阵列 (300026) 分析基因表达，并为每个时间点和 DMSO 对照确定 3 个重复。使用 GeneSpring 软件 7.2 版（Agilent，Palo Alto，CA）分析微阵列数据。数据分两步标准化。首先，对于每个数组，每个基因的表达值除以该数组中所有值的中位数。其次，对于每个基因，每个阵列中的表达值除以该基因在所有阵列中的中值。具有低质量信号的基因被排除用于统计分析。进行单向方差分析（假设方差相等）来识别差异表达的基因。如果 Benjamini 和 Hochberg 调整的 Ps<0.05，则称该基因存在差异表达。细胞测定：人结肠癌细胞系RKO和SW480由德克萨斯州休斯顿的德克萨斯大学MD安德森癌症中心提供。 HT-29、HCT116 和 HCT-15 获自美国典型培养物保藏中心（马纳萨斯，弗吉尼亚州）。 RKO、SW480 和 HT-29 细胞维持在不含酚红的 DMEM/Hams F-12（Sigma，圣路易斯，密苏里州）中，补充有 0.22% 碳酸氢钠、0.011% 丙酮酸钠和 5% 胎牛血清 (FBS) ）和10ml/L的100×抗生素抗真菌溶液（Sigma）。 HCT116和HCT-15细胞维持在补充有0.22％碳酸氢钠、0.011％丙酮酸钠、0.45％葡萄糖、0.24％HEPES、10％FBS和10ml/L 100×抗生素抗真菌溶液的RPMI 1640(Sigma)中。细胞在 5% CO2 存在下维持在 37°C。

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1. 降低 RKO 结肠癌细胞存活率并诱导凋亡：DIM-C-pPhOCH3 处理可降低 RKO 结肠癌细胞的存活能力，增强细胞凋亡反应，且该凋亡诱导过程伴随肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）蛋白表达的上调 [1]
2. 同时通过 Nur77 依赖和非依赖途径诱导凋亡：Nur77 小干扰 RNA（iNur77）可显著抑制 DIM-C-pPhOCH3 诱导的凋亡及 TRAIL 表达，表明存在 Nur77 依赖的作用成分；但 RNA 干扰研究证实，DIM-C-pPhOCH3 也可通过 Nur77 非依赖机制诱导凋亡 [1]
3. 调控促凋亡基因表达：基因芯片分析发现 DIM-C-pPhOCH3 可诱导多个促凋亡基因的表达。在有无 iNur77 存在的条件下进行逆转录 - 聚合酶链反应（RT-PCR）分析显示，程序性细胞死亡基因 1 的诱导表达依赖于 Nur77，而胱硫醚酶和活化转录因子 3 的诱导表达不依赖于 Nur77 [1]
4. Nur77 在结肠癌模型中过表达：Nur77 在多种结肠癌细胞系中表达，包括 RKO、SW480、HCT-116、HT-29 和 HCT-15；免疫染色结果显示，与正常结肠组织相比，结肠肿瘤组织中 Nur77 呈过表达状态 [1]

雄性无胸腺裸鼠（Foxn1nu，7-8周龄）购自Harlan（印第安纳州印第安纳波利斯）。将小鼠安置在层流柜中，并在特定的无病原体条件下进行饲养。通过将体外培养的 RKO 细胞（每 150 μL 5 × 106 个）皮下注射到个体小鼠的胁腹中来建立异种移植物。让肿瘤生长4天直到肿瘤可触及。然后将小鼠随机分为两组，每组六只小鼠，并通过口服玉米油或 25 mg/kg/d DIM-C-pPHOCH3 口服给药，持续 21 天。对小鼠进行称重，并每周用卡尺测量肿瘤大小两次，以计算肿瘤体积：V = LW2 / 2，其中L和W分别是长度和宽度。在给药方案结束时测定最终的身体、器官和肿瘤重量，并获得器官和肿瘤块用于H&E染色和组织病理学分析

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抑制异种移植模型肿瘤生长：对携带 RKO 细胞异种移植瘤的裸鼠，以 25 mg/kg/天的剂量给予 DIM-C-pPhOCH3 处理，结果显示该药物可显著抑制肿瘤生长 [1]

将 RKO 细胞暴露于 12.5 μM DIM-C-pHOCH3 或 DMSO 中 2 小时和 6 小时。对于逆转录 PCR (RT-PCR) 实验，分离 RNA，检查基因表达，并为每个时间点和 DMSO 对照计算三个重复。对微阵列数据进行分析[1]。

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1. 结肠癌细胞存活率及凋亡实验：培养 RKO 结肠癌细胞并给予 DIM-C-pPhOCH3 处理，经过特定孵育时间后，评估细胞存活情况以明确药物对细胞活力的抑制作用；通过相关实验方法检测细胞凋亡反应，并分析 TRAIL 蛋白表达水平以证实凋亡通路的激活 [1]
2. Nur77 RNA 干扰（RNAi）实验：将 Nur77 小干扰 RNA（iNur77）或对照 RNA 转染至 RKO 结肠癌细胞，随后用 DIM-C-pPhOCH3 处理转染后的细胞，分析 iNur77 对 DIM-C-pPhOCH3 诱导的凋亡及 TRAIL 表达的影响，以区分 Nur77 依赖和非依赖途径 [1]
3. 基因芯片及 RT-PCR 基因表达分析：用 DIM-C-pPhOCH3 处理 RKO 结肠癌细胞后提取总 RNA，通过基因芯片分析筛选药物诱导的促凋亡基因；针对筛选出的基因（程序性细胞死亡基因 1、胱硫醚酶、活化转录因子 3），在有无 iNur77 转染的细胞中进行 RT-PCR 验证，明确其诱导表达对 Nur77 的依赖性 [1]
4. 结肠癌细胞及组织中 Nur77 表达检测：培养多种结肠癌细胞系（RKO、SW480、HCT-116、HT-29、HCT-15），检测 Nur77 表达情况；同时对结肠肿瘤组织和正常结肠组织进行免疫染色，对比两者 Nur77 表达水平 [1]

Mice: The mice used are male athymic nude mice (Foxn1^nu, aged 7-8 weeks). The mice are kept in laminar flow cabinets with particular pathogen-free conditions. In vitro cultured RKO cells (5×10⁶ per 150 μL) are injected subcutaneously into each mouse's flank to create a xenograft. Four days are given to tumor growth before they become palpable. After that, mice are divided into two groups of six mice each, and they are given oral gavage doses of either corn oil or 25 mg/kg/d DIM-C-phOCH3 for a period of 21 days. Both the tumor size and the mice's weight are determined[1].

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Xenograft tumor inhibition experiment in athymic nude mice: Athymic nude mice are implanted with RKO colon cancer cells to establish xenograft tumors. Once the tumors reach an appropriate size, the mice are administered DIM-C-pPhOCH3 at a dose of 25 mg/kg per day. The drug is administered continuously for a specified period, and tumor volume or weight is measured regularly during the treatment to evaluate the tumor growth inhibitory effect of the drug [1]

[1]. Nur77 agonists induce proapoptotic genes and responses in colon cancer cells through nuclear receptor-dependent and nuclear receptor-independent pathways. Cancer Res. 2007 Jan 15;67(2):674-83.

1. DIM-C-pPhOCH3 is a methylene-substituted diindolylmethane (C-DIM) compound identified as a Nur77 agonist [1]
2. Nur77 is an orphan nuclear receptor with no known endogenous ligands [1]
3. DIM-C-pPhOCH3 represents a new class of anti-colon cancer drugs that exert therapeutic effects through both nuclear receptor (Nur77)-dependent and nuclear receptor-independent pathways [1]

C24H20N2O

352.43

352.158

C, 81.79; H, 5.72; N, 7.95; O, 4.54

33985-68-1

11371604

White to off-white solid powder

5.838

40.81

2

1

4

27

457

0

COC1=CC=C(C(C2=CNC3=C2C=CC=C3)C4=CNC5=C4C=CC=C5)C=C1

ZCCMKJAXOIFTHH-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C24H20N2O/c1-27-17-12-10-16(11-13-17)24(20-14-25-22-8-4-2-6-18(20)22)21-15-26-23-9-5-3-7-19(21)23/h2-15,24-26H,1H3

3-[1H-indol-3-yl-(4-methoxyphenyl)methyl]-1H-indole

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.09 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.09 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。