DIM-C-pPhOCH3

Nur77
Nur77 (Nuclear Receptor Subfamily 4, Group A, Member 1, also known as NGFI-Balpha), an orphan nuclear receptor [1]

体外活性：DIM-C-pPhOCH3 是 Nur77（神经生长因子诱导的 Bα，缩写为 NGFI-Bα 或 Nur77）的激动剂。 Nur77 是一种孤儿核受体，没有已知的内源配体，据报道与正常结肠组织相比，其在结肠肿瘤中过度表达。 DIM-C-pPhOCH3 能够降低 RKO 结肠癌细胞的存活率并诱导细胞凋亡，同时诱导肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 (TRAIL) 蛋白。 DIM-C-pPhOCH3 诱导的细胞凋亡和 TRAIL 被 Nur77 (iNur77) 的小抑制性 RNA 显着抑制；然而，RNA干扰研究表明DIM-C-pPhOCH3也能诱导不依赖于Nur77的细胞凋亡。使用微阵列对 DIM-C-pPhOCH3 诱导的基因表达进行分析，鉴定出几种促凋亡基因，并在存在或不存在 iNur77 的情况下通过逆转录 PCR 进行分析，表明程序性细胞死亡基因 1 的诱导是 Nur77 依赖性的，而胱硫醚酶和激活转录因子 3 不依赖于 Nur77。 DIM-C-pPhOCH3 (25 mg/kg/d) 也抑制携带 RKO 细胞异种移植物的无胸腺裸鼠的肿瘤生长。这些结果表明，DIM-C-pPhOCH3 代表了一类新型抗结肠癌药物，通过受体依赖性和受体非依赖性途径发挥作用。激酶测定：微阵列研究侧重于早期诱导基因，RKO 细胞用 DMSO 或 12.5 μmol/L DIM-C-pPhOCH3 处理 2 和 6 小时。按照逆转录 PCR (RT-PCR) 实验所述分离 RNA，并使用 Codelink 全基因组生物阵列 (300026) 分析基因表达，并为每个时间点和 DMSO 对照确定 3 个重复。使用 GeneSpring 软件 7.2 版（Agilent，Palo Alto，CA）分析微阵列数据。数据分两步标准化。首先，对于每个数组，每个基因的表达值除以该数组中所有值的中位数。其次，对于每个基因，每个阵列中的表达值除以该基因在所有阵列中的中值。具有低质量信号的基因被排除用于统计分析。进行单向方差分析（假设方差相等）来识别差异表达的基因。如果 Benjamini 和 Hochberg 调整的 Ps<0.05，则称该基因存在差异表达。细胞测定：人结肠癌细胞系RKO和SW480由德克萨斯州休斯顿的德克萨斯大学MD安德森癌症中心提供。 HT-29、HCT116 和 HCT-15 获自美国典型培养物保藏中心（马纳萨斯，弗吉尼亚州）。 RKO、SW480 和 HT-29 细胞维持在不含酚红的 DMEM/Hams F-12（Sigma，圣路易斯，密苏里州）中，补充有 0.22% 碳酸氢钠、0.011% 丙酮酸钠和 5% 胎牛血清 (FBS) ）和10ml/L的100×抗生素抗真菌溶液（Sigma）。 HCT116和HCT-15细胞维持在补充有0.22％碳酸氢钠、0.011％丙酮酸钠、0.45％葡萄糖、0.24％HEPES、10％FBS和10ml/L 100×抗生素抗真菌溶液的RPMI 1640(Sigma)中。细胞在 5% CO2 存在下维持在 37°C。

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1. 降低 RKO 结肠癌细胞存活率并诱导凋亡：DIM-C-pPhOCH3 处理可降低 RKO 结肠癌细胞的存活能力，增强细胞凋亡反应，且该凋亡诱导过程伴随肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）蛋白表达的上调 [1]
2. 同时通过 Nur77 依赖和非依赖途径诱导凋亡：Nur77 小干扰 RNA（iNur77）可显著抑制 DIM-C-pPhOCH3 诱导的凋亡及 TRAIL 表达，表明存在 Nur77 依赖的作用成分；但 RNA 干扰研究证实，DIM-C-pPhOCH3 也可通过 Nur77 非依赖机制诱导凋亡 [1]
3. 调控促凋亡基因表达：基因芯片分析发现 DIM-C-pPhOCH3 可诱导多个促凋亡基因的表达。在有无 iNur77 存在的条件下进行逆转录 - 聚合酶链反应（RT-PCR）分析显示，程序性细胞死亡基因 1 的诱导表达依赖于 Nur77，而胱硫醚酶和活化转录因子 3 的诱导表达不依赖于 Nur77 [1]
4. Nur77 在结肠癌模型中过表达：Nur77 在多种结肠癌细胞系中表达，包括 RKO、SW480、HCT-116、HT-29 和 HCT-15；免疫染色结果显示，与正常结肠组织相比，结肠肿瘤组织中 Nur77 呈过表达状态 [1]

雄性无胸腺裸鼠（Foxn1nu，7-8周龄）购自Harlan（印第安纳州印第安纳波利斯）。将小鼠安置在层流柜中，并在特定的无病原体条件下进行饲养。通过将体外培养的 RKO 细胞（每 150 μL 5 × 106 个）皮下注射到个体小鼠的胁腹中来建立异种移植物。让肿瘤生长4天直到肿瘤可触及。然后将小鼠随机分为两组，每组六只小鼠，并通过口服玉米油或 25 mg/kg/d DIM-C-pPHOCH3 口服给药，持续 21 天。对小鼠进行称重，并每周用卡尺测量肿瘤大小两次，以计算肿瘤体积：V = LW2 / 2，其中L和W分别是长度和宽度。在给药方案结束时测定最终的身体、器官和肿瘤重量，并获得器官和肿瘤块用于H&E染色和组织病理学分析

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抑制异种移植模型肿瘤生长：对携带 RKO 细胞异种移植瘤的裸鼠，以 25 mg/kg/天的剂量给予 DIM-C-pPhOCH3 处理，结果显示该药物可显著抑制肿瘤生长 [1]

将 RKO 细胞暴露于 12.5 μM DIM-C-pHOCH3 或 DMSO 中 2 小时和 6 小时。对于逆转录 PCR (RT-PCR) 实验，分离 RNA，检查基因表达，并为每个时间点和 DMSO 对照计算三个重复。对微阵列数据进行分析[1]。

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1. 结肠癌细胞存活率及凋亡实验：培养 RKO 结肠癌细胞并给予 DIM-C-pPhOCH3 处理，经过特定孵育时间后，评估细胞存活情况以明确药物对细胞活力的抑制作用；通过相关实验方法检测细胞凋亡反应，并分析 TRAIL 蛋白表达水平以证实凋亡通路的激活 [1]
2. Nur77 RNA 干扰（RNAi）实验：将 Nur77 小干扰 RNA（iNur77）或对照 RNA 转染至 RKO 结肠癌细胞，随后用 DIM-C-pPhOCH3 处理转染后的细胞，分析 iNur77 对 DIM-C-pPhOCH3 诱导的凋亡及 TRAIL 表达的影响，以区分 Nur77 依赖和非依赖途径 [1]
3. 基因芯片及 RT-PCR 基因表达分析：用 DIM-C-pPhOCH3 处理 RKO 结肠癌细胞后提取总 RNA，通过基因芯片分析筛选药物诱导的促凋亡基因；针对筛选出的基因（程序性细胞死亡基因 1、胱硫醚酶、活化转录因子 3），在有无 iNur77 转染的细胞中进行 RT-PCR 验证，明确其诱导表达对 Nur77 的依赖性 [1]
4. 结肠癌细胞及组织中 Nur77 表达检测：培养多种结肠癌细胞系（RKO、SW480、HCT-116、HT-29、HCT-15），检测 Nur77 表达情况；同时对结肠肿瘤组织和正常结肠组织进行免疫染色，对比两者 Nur77 表达水平 [1]

小鼠：本实验采用雄性无胸腺裸鼠（Foxn1^nu，7-8周龄）。小鼠饲养于层流罩内，并保持无特定病原体（SPF）条件。将体外培养的RKO细胞（5×10⁶/150 μL）皮下注射到每只小鼠的侧腹部，建立异种移植瘤模型。待肿瘤生长4天后，即可触及。之后，将小鼠分为两组，每组6只，分别灌胃给予玉米油或25 mg/kg/d的DIM-C-phOCH3，持续21天。测定肿瘤大小和小鼠体重[1]。

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无胸腺裸鼠异种移植瘤抑制实验：将RKO结肠癌细胞植入无胸腺裸鼠体内，建立异种移植瘤模型。当肿瘤达到合适大小后，小鼠每天接受 25 mg/kg 剂量的 DIM-C-pPhOCH3 给药。该药物需持续给药一段时间，并在治疗期间定期测量肿瘤体积或重量，以评估该药物的肿瘤生长抑制效果 [1]

[1]. Nur77 agonists induce proapoptotic genes and responses in colon cancer cells through nuclear receptor-dependent and nuclear receptor-independent pathways. Cancer Res. 2007 Jan 15;67(2):674-83.

1. DIM-C-pPhOCH3 是一种亚甲基取代的二吲哚甲烷 (C-DIM) 化合物，已被鉴定为 Nur77 激动剂 [1]
2. Nur77 是一种孤儿核受体，没有已知的内源性配体 [1]
3. DIM-C-pPhOCH3 代表了一类新型抗结肠癌药物，可通过核受体 (Nur77) 依赖性和非核受体依赖性途径发挥治疗作用 [1]

C24H20N2O

352.43

352.158

C, 81.79; H, 5.72; N, 7.95; O, 4.54

33985-68-1

11371604

White to off-white solid powder

5.838

40.81

2

1

4

27

457

0

COC1=CC=C(C(C2=CNC3=C2C=CC=C3)C4=CNC5=C4C=CC=C5)C=C1

ZCCMKJAXOIFTHH-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C24H20N2O/c1-27-17-12-10-16(11-13-17)24(20-14-25-22-8-4-2-6-18(20)22)21-15-26-23-9-5-3-7-19(21)23/h2-15,24-26H,1H3

3-[1H-indol-3-yl-(4-methoxyphenyl)methyl]-1H-indole

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.09 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.09 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。