ELN484228   中文名称: N-(4-氟苯基)苯磺酰胺

Intrinsically disordered protein ELN484228 targets α-synuclein [1]

体外活性：ELN484228 是一种苯基磺酰胺化合物，是 α-突触核蛋白的细胞渗透性阻断剂，α-突触核蛋白是帕金森病的关键蛋白。它是通过计算和实验技术的结合来识别的。 ELN484228 在 α-突触核蛋白介导的功能障碍的细胞模型中具有显着的生物活性，包括挽救 α-突触核蛋白诱导的囊泡运输中断以及多巴胺能神经元损失和神经突收缩，最有可能是通过减少针对囊泡部位的 α-突触核蛋白的量动员，例如神经元中的突触或小胶质细胞中的珠子吞噬位点。这些结果表明，通过 ELN484228 等小分子靶向 α-突触核蛋白代表了开发帕金森病及相关病症的治疗方法的一种有前途的方法。激酶测定：在 37°C 摇动 (300 rpm) 下，在含有 50 µM 蛋白质的溶液中，在不存在和存在十倍高浓度的化合物 ELN484228 的情况下，在 25 mM Tris 缓冲液 pH 7.4、100 mM NaCl 中，一式三份地测定 αSyn 的聚集添加0.01% NaN3。每天取出等分试样，并在每个等分试样中添加 20 µM ThT 后记录硫代黄素 T (ThT) 荧光信号。然后使用 Cary-Eclipse 分光荧光计 (Varian, Palo Alto CA) 在 446 nm 的激发波长下记录 460 至 600 nm 的荧光发射光谱。通过将预先形成的原纤维与该化合物一起温育并通过比较添加ELN484228之前和之后的ThT荧光信号来测定添加ELN484228对ThT荧光的猝灭，但没有发现信号的显着变化。在与上述相同的实验条件下，在低浓度 SDS (200 µM) 存在的情况下，也对 ELN484228 存在下的 αSyn 聚集进行了表征。 ThT 荧光信号的时间依赖性符合先前描述的成核-伸长模型。 TEM 图像是使用 Philips CEM100 透射电子显微镜获得的。将样品涂在 Formvar 碳涂层的镍网上并用 2% (w/v) 醋酸双氧铀染色。细胞测定：小胶质细胞取自 1-3 天新生小鼠的大脑皮层。支持信息文本中提供了小胶质细胞培养方法的完整描述。从胚胎第 18 天的产前大鼠海马中分离出海马神经元，并在不含抗生素和血清的 NbActiv4 培养基（均来自 BrainBits，伊利诺斯州斯普林菲尔德）中于 37°C、5% CO2、9% O2 的气氛和涂有涂层的玻璃盖玻片上培养与聚赖氨酸。每 3 至 4 天更换一半的培养基。细胞在体外21-28天后用于实验。

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1. 改善α-突触核蛋白介导的囊泡动力学损伤：将具有四环素诱导型α-突触核蛋白过表达的 H4 神经胶质瘤细胞，在有无 1 µg/ml 四环素（诱导α-突触核蛋白表达）以及 ELN484228 或对照化合物 ELN484217 的条件下培养 24 小时。加入 4 μ 微珠孵育 90 分钟后，通过显微镜观察计算吞噬指数。对三次独立实验（每个样本做三次重复）的合并平均值进行 t 检验统计分析，结果显示，四环素诱导组中，经 ELN484228 处理与未处理的样本在吞噬作用上存在显著差异（n = 3 ± 标准误，与无化合物处理的四环素诱导样本相比，p≤0.001）[1]
2. 减少α-突触核蛋白向吞噬小体的转运：将 H4 细胞用 100 µM ELN484228 和 1 µg/ml 四环素处理 24 小时后，加入 4 μ 微珠刺激 90 分钟。细胞固定后，用 5C12 抗体（红色）染色检测α-突触核蛋白，并用 488-鬼笔环肽（绿色）和 Hoechts 染料（蓝色）进行复染。结果显示 ELN484228 可减少α-突触核蛋白向吞噬小体的转运 [1]
3. 降低大鼠海马神经元突触部位的α-突触核蛋白水平：将在无血清条件下培养至约 21 天体外培养天数（DIV）的大鼠海马神经元，用 1 µM ELN484228 或 0.01% DMSO 溶媒处理 24 小时。通过共聚焦显微镜成像检测α-突触核蛋白（红色，5C12 抗体标记）和突触前膜标志物突触素（绿色）。使用 Metamorph 成像分析软件进行定量分析，通过测量积分强度确定突触部位α-突触核蛋白水平，通过测量像素面积确定突触素水平。每个条件分析 1000 个突触末端（针对α-突触核蛋白）或 18 个光学视野（针对突触素），样本来源于 2-3 次独立培养（数值以平均值 ± 标准误表示），结果证实 ELN484228 可降低突触部位的α-突触核蛋白水平 [1]
4. 减轻 A53T 突变型α-突触核蛋白诱导的多巴胺能神经元丢失和神经突退缩：将大鼠胚胎中脑原代培养物分为三组，分别为未转导组（对照组）、转导 A53T 型α-突触核蛋白腺病毒组，以及转导 A53T 型α-突触核蛋白腺病毒 + 10 µM ELN484228 处理组。对细胞进行 MAP2 和 TH 免疫细胞化学染色，通过评估同时表达 MAP2 和 TH 的细胞百分比来分析多巴胺能神经元的选择性死亡情况，并使用 NIS-Elements 软件测量同时表达 MAP2 和 TH 的神经突长度。结果显示，ELN484228 可减轻多巴胺能神经元丢失（p≤0.05）和神经突退缩（与无化合物处理的 A53T 型α-突触核蛋白病毒组相比，p≤0.001；采用单因素方差分析及 Newman-Keuls 事后检验）。神经元存活率分析中 n = 3；神经突长度分析中 n = 160-206（数据以平均值 ± 标准误表示）[1]
5. 保护小胶质细胞免受α-突触核蛋白介导的功能损伤：从出生后 1-3 天的 hSNCA^E46K 转基因（过表达α-突触核蛋白）小鼠或非转基因同窝小鼠幼崽中分离小胶质细胞，用 100 µM ELN484228 或对照化合物 ELN484217 孵育 24 小时后，加入 10 µm 微珠孵育 90 分钟。通过显微镜观察计算吞噬指数，结果显示 ELN484228 对小胶质细胞功能具有显著的保护作用（n = 3 ± 标准误，p≤0.001）[1]

支持信息文本中提供了转基因动物产生的完整描述。简而言之，含有人类 SNCA 基因序列（加利福尼亚州卡尔斯巴德的 Life Technologies）的细菌人工染色体（BAC）克隆 RP11-458H10 被修饰，通过 BAC 重组工程方法产生 Rep1 突变和 E46K 突变。含有 hSNCA 转基因 (~168 Kb) 的圆形 BAC 构建体用于以 1–3 µg/µl 的浓度对 B6SJL F2 小鼠品系（The Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME）进行原核显微注射，然后植入假怀孕雌性体内（Xenogen Biosciences，新泽西州克兰伯里）。创始人动物与 B6D2F1 小鼠一起饲养，并在此背景下维持杂合子，并以非转基因同窝小鼠作为对照。 BAC-Tg3 (SNCAE46K) 品系动物的繁殖数量足以满足 3、8-9、12-14、18-20 月龄 (MO) 特征队列的需要，并且从创始人算起已经有 3-8 代。所有小鼠均饲养在无病原体、气候受控的环境中，并随意给予食物和水。所有动物研究均由 Elan Pharmaceuticals 机构动物护理和使用委员会根据美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南进行审查和批准。

片段探针图谱分析鉴定单体α-突触核蛋白中的小分子结合口袋：首先分析α-突触核蛋白的 NMR 衍生集合结构中的 100 个构象，包括回转半径（Rg）、溶剂可及表面积（SASA）与非键合接触数量之间的相关性；随后以特定小分子作为片段探针，进行片段探针图谱计算，以鉴定α-突触核蛋白构象中的潜在结合口袋。最终鉴定出 8 个被小分子簇填充的口袋，α-突触核蛋白的残基根据氨基酸序列进行着色标记 [1]

1. H4 神经胶质瘤细胞吞噬活性实验：接种并培养具有四环素诱导型α-突触核蛋白过表达的 H4 神经胶质瘤细胞，将细胞分为无四环素诱导组（无α-突触核蛋白过表达）、四环素诱导组（1 µg/ml，诱导α-突触核蛋白过表达），每组又分为有无 ELN484228 处理或对照化合物 ELN484217 处理亚组。培养 24 小时后，向细胞中加入 4 μ 微珠并孵育 90 分钟，随后通过显微镜观察并计算吞噬指数，以评估α-突触核蛋白介导的囊泡功能损伤情况。每个样本做三次重复，实验独立进行三次，对每次实验的吞噬指数取平均值后进行最终的统计分析 [1]
2. H4 细胞α-突触核蛋白转运实验：将 H4 细胞同时用 100 µM ELN484228 和 1 µg/ml 四环素处理并培养 24 小时，以诱导α-突触核蛋白表达并让药物发挥作用。之后加入 4 μ 微珠刺激细胞 90 分钟，刺激结束后固定细胞，用 5C12 抗体（红色）染色检测α-突触核蛋白，用 488-鬼笔环肽（绿色）染色细胞骨架，用 Hoechts 染料（蓝色）染色细胞核。通过共聚焦显微镜观察α-突触核蛋白的定位情况，重点关注其向吞噬小体（用虚线圆圈标记微珠位置）的转运 [1]
3. 大鼠海马神经元突触α-突触核蛋白水平检测实验：将大鼠海马神经元在无血清培养基中培养至约 21 DIV，分为两组，一组用 1 µM ELN484228 处理，另一组用 0.01% DMSO 作为溶媒对照处理。处理 24 小时后固定细胞，用 5C12 抗体（检测α-突触核蛋白，红色）和突触素抗体（突触前膜标志物，绿色）进行免疫染色，获取共聚焦显微镜图像后，使用 Metamorph 成像分析软件进行定量分析，通过测量积分强度确定突触部位α-突触核蛋白水平，通过测量像素面积确定突触素水平。每个条件分析 1000 个突触末端（针对α-突触核蛋白）或 18 个光学视野（针对突触素），样本来源于 2-3 次独立培养 [1]
4. 大鼠胚胎中脑原代培养物多巴胺能神经元保护实验：制备大鼠胚胎中脑原代培养物，分为三组：未转导组（对照组）、转导 A53T 型α-突触核蛋白腺病毒组、转导 A53T 型α-突触核蛋白腺病毒 + 10 µM ELN484228 处理组。孵育后对细胞进行 MAP2（神经元标志物）和 TH（多巴胺能神经元标志物）免疫细胞化学染色，计算同时表达 MAP2 和 TH 的细胞百分比以评估多巴胺能神经元存活率，使用 NIS-Elements 软件测量同时表达 MAP2 和 TH 的神经突长度。采用单因素方差分析及 Newman-Keuls 事后检验进行统计分析，神经元存活率分析中 n = 3，神经突长度分析中 n = 160-206 [1]
5. 转基因小鼠来源小胶质细胞吞噬活性实验：从出生后 1-3 天的 hSNCA^E46K 转基因小鼠（过表达α-突触核蛋白）或非转基因同窝小鼠幼崽中分离小胶质细胞，接种后用 100 µM ELN484228 或对照化合物 ELN484217 孵育 24 小时，随后加入 10 µm 微珠孵育 90 分钟。通过显微镜观察并计算吞噬指数，以评估 ELN484228 对小胶质细胞功能的保护作用，实验做三次重复（n = 3 ± 标准误）[1]

Mouse

[1]. Targeting the intrinsically disordered structural ensemble of α-synuclein by small molecules as a potential therapeutic strategy for Parkinson's disease. PLoS One. 2014 Feb 14;9(2):e87133.

1. ELN484228 is a drug-like phenyl-sulfonamide compound identified through a combination of computational and experimental techniques, targeting α-synuclein, a key protein involved in Parkinson's disease [1]
2. The biological activity of ELN484228 is most likely mediated by reducing the amount of α-synuclein targeted to sites of vesicle mobilization, such as synapses in neurons or the site of bead engulfment in microglial cells [1]
3. Misfolding of intrinsically disordered proteins like α-synuclein is associated with neurodegenerative diseases such as Parkinson's disease, and targeting the monomeric state of these proteins with small molecules is a potential therapeutic strategy [1]

C12H10FNO2S

251.28

251.042

312-63-0

295229

White to off-white solid powder

1.374g/cm3

379.1ºC at 760 mmHg

183ºC

1.618

3.78

54.55

1

4

3

17

325

0

AZORQGXJAXEIGC-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C12H10FNO2S/c13-10-6-8-11(9-7-10)14-17(15,16)12-4-2-1-3-5-12/h1-9,14H

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (9.95 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (9.95 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (9.95 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。