Empesertib (BAY-1161909)   中文名称: 恩佩塞替

Mps1 (IC50 = 1 nM)

Empesertib (BAY1161909) 是一种非常有效的 Mps-1 抑制剂，在 HeLa 细胞增殖测定中显示 IC50 低于 400 nM，在 Mps-1 激酶测定中显示 IC50 低于或等于 1 nM（比 1 nM 更有效）浓度为 1 μM/2 mM ATP。[1]

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BAY 1161909和BAY 1217389抑制Mps1激酶活性，IC50值低于10nmol/L，同时显示出优异的选择性。在细胞机制分析中，两种Mps1抑制剂都消除了诺考达唑诱导的SAC活性，并诱导了有丝分裂的过早退出（“有丝分裂突破”），导致多核性和肿瘤细胞死亡。这两种化合物在体外均能有效抑制肿瘤细胞增殖（IC50 nmol/L范围）。[2]

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只有相应的R-异构体39-41/Empesertib（BAY1161909）（表6）具有良好的效力；S-异构体42和较大的α-取代基（43，44）导致效力降低（表7）。与氟代氮杂环丁烷衍生的酰胺39和恶唑烷酮40相比，甲基砜41/Empesertib（BAY1161909）显示出最佳的总体特征，与早期先导化合物9相比，进一步提高了激酶选择性（41/Empesertib (BAY1161909)仅抑制两种激酶JNK2和JNK3，在1μmol/L的浓度下超过50%，在230种激酶的Millipore激酶组中，100 nmol/L没有其他激酶），并被选为我们的第一个临床候选物。事实上，它是2014年5月第一个进入I期临床试验的MPS1抑制剂（NCT02138812）[4]。

Empesertib (BAY1161909)是一种极其有效的 Mps-1 抑制剂。通过大鼠肝微粒体测定，其在大鼠体内的最大口服生物利用度（Fmax）大于70%；同样，通过狗肝微粒体测量，其在狗体内的最大口服生物利用度（Fmax）大于50%；根据人体肝微粒体测定，其人体最大口服生物利用度大于 60%。 [1]

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在体内，Empesertib (BAY1161909)和BAY 1217389在肿瘤异种移植物研究中的单一疗法中取得了中等疗效。然而，根据其独特的作用方式，当与紫杉醇联合使用时，低剂量的Mps1抑制剂通过削弱SAC活性来减少紫杉醇诱导的有丝分裂阻滞。因此，在广泛的异种移植物模型中，包括那些显示获得性或内在紫杉醇耐药性的模型中，联合治疗在各自的MTD上比紫杉醇或Mps1抑制剂单药治疗有显著提高的疗效。两种Mps1抑制剂均表现出良好的耐受性，且不会增加紫杉醇单一疗法的毒性。这些临床前研究结果验证了癌症治疗中废除SAC的创新概念，并证明了临床概念验证研究的合理性，这些研究评估了Mps1抑制剂BAY 1161909和BAY 1217389与抗有丝分裂癌症药物联合使用，以提高其疗效并潜在地克服耐药性[2]。

Kinase assay [2]
通过基于TR-FRET的体外激酶实验评估了Empesertib (BAY1161909)或BAY 1217389对重组人Mps1的抑制作用，实验中使用了一种生物素化肽（biotin-Ahx-PWDPDDADITEILG-NH2）的磷酸化反应。在酶反应开始前，激酶和测试化合物预孵育15分钟，然后加入底物和10 μmol/L的ATP启动反应。更多细节请参见补充材料和方法。

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Kinase selectivity profiling [2]
使用Millipore Kinase或DiscoveRx profiler筛选平台对Empesertib (BAY1161909)和BAY 1217389进行了一系列激酶的反向筛选。Empesertib (BAY1161909)最初在DiscoveRx激酶面板中以1 μmol/L的浓度进行测试，随后对11种激酶进行了KD测定（补充表S1）。BAY 1161909在Millipore激酶面板中以10 μmol/L的浓度进行测试，随后在1和0.1 μmol/L的浓度下重新测试，并对JNK1alpha、JNK2alpha和JNK3进行了IC50测定（补充表S1）。BAY 1217389最初在DiscoveRx激酶面板中以1、0.1和0.01 μmol/L的浓度进行测试（补充表S2）。

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Biochemical assays [3]
通过IMAP®荧光偏振实验测定了生化纯化的全长TTK激酶活性的抑制，如前所述。简而言之，激酶抑制剂和TTK在IMAP反应缓冲液中稀释，该缓冲液由10 mM Tris–HCl（pH 7.5）、10 mM MgCl2、0.01% Tween-20、0.1% NaN3和1 mM DTT组成。在室温下避光预孵育1小时后，加入荧光素标记的MBP衍生底物肽，随后加入ATP启动反应。最终酶浓度为3.9 nM，最终底物浓度为50 nM，最终ATP浓度为5 μM。反应在室温下避光进行2小时。荧光偏振在Envision多模式读数器上测量。数据使用XLfit™5中的四参数逻辑曲线拟合。实验至少重复三次（补充表S2）。

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Purification of TTK kinase domain [3]
TTK根据结构基因组联盟开发的协议进行表达和纯化。使用质粒TTKA-c013/SGC2-B08。TTK在大肠杆菌Rosetta™菌株中表达，培养基为LB，含有50 μg/L卡那霉素和35 μg/L氯霉素，在37 °C摇床培养至OD600为0.6–0.8。之后，加入1 mM IPTG，并在室温下继续孵育4小时。细菌沉淀在−20 °C冷冻。纯化时，细胞重悬于结合缓冲液[50 mM Hepes（pH 7.5）、500 mM NaCl和5%（体积/体积）甘油]。加入10 mM咪唑和无EDTA的蛋白酶抑制剂（每50 mL 1片），并使用Avastin液体均质器裂解细胞，随后离心。上清液与NiNTA Superflow-sepharose珠在4 °C孵育1小时，之后分离珠子并用含50 mM咪唑的结合缓冲液洗涤。蛋白用含250 mM咪唑的结合缓冲液洗脱。第二天，含蛋白的馏分通过Superdex 75柱进行尺寸排阻色谱进一步纯化，运行缓冲液为50 mM Hepes（pH 7.5）、150 mM NaCl和5 mM DTT。峰馏分合并后，在干冰/乙醇中快速冷冻，分装为50 μl，储存于−80 °C。特别用于蛋白质晶体学的峰馏分在4 °C下使用Spin-X UF 30-kDa过滤器浓缩至8–10 mg/ml，然后快速冷冻储存。

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Thermal shift assays [3]
将纯化的TTK激酶结构域解冻并在IMAP缓冲液[10 mM Tris（pH 7.5）、10 mM MgCl2、0.01% Tween-20和0.1% NaN3]中稀释至4.8 μM。随后，将10 μl蛋白与5 μl 40 μM的目标化合物在IMAP缓冲液中混合，置于Greiner 96孔PCR板中。在冰上孵育30分钟后，加入5 μl 1250倍稀释的SyproOrange（在IMAP缓冲液中）。最终浓度为2.4 μM TTK和10 μM化合物。SyproOrange稀释5000倍。孵育后立即用TopSeal A-plus密封板，并转移至Biorad CFX96，温度从20 °C升至90 °C，每5秒增加0.5 °C。报告值在三次独立实验中各测量四次（补充表S2）。通过取熔解曲线一阶导数的最小值确定熔解温度。

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SPR [3]
使用Biacore T200通过表面等离子体共振（SPR）测定结合动力学。由于使用全长TTK的初始测试未能获得稳定的表面，因此我们使用了His标记的TTK激酶结构域，如前所述。简而言之，TTK激酶结构域通过His标签捕获和胺偶联固定在Ni-NTA传感器芯片上，偶联水平为4000–6000 RU。抑制剂在结合缓冲液中稀释，最终DMSO浓度为1%（体积/体积）。化合物结合在结合缓冲液（10 mM Tris、10 mM MgCl2、0.01% Tween-20和1 mM DTT，pH 6.8）中测量，DMSO浓度为1%（体积/体积），使用单循环动力学，注射浓度范围为1 – 3.16 – 10 – 31.6 – 100 nM。流速为30 μl/min，每次注射的结合时间为100秒。最后一次注射后的解离至少监测30分钟。未进行再生。从化合物信号中减去缓冲液注射和参考通道信号（双参考）。使用Biacore评估软件将结果数据拟合到简单的1:1 Langmuir结合模型。所有动力学常数均在Biacore T200的工作范围内。为了确定曲线拟合的可靠性，我们应用了标准的Biacore检查。拟合的唯一性（U值）、ka和kd的标准误差以及质量转移常数均按之前所述进行监控。

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生化MPS1抑制试验。在时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）的基础上，用磷酸化特异性抗体测定生物素化底物肽的磷酸化，评估了人类MPS1的抑制作用。在20μM ~ 0.1 nM范围内的11种不同浓度下，在同一微滴板上测试化合物，每种浓度重复一次。稀释系列在测定前单独配制为100倍浓度的DMSO原液。在实验中，将每种测试化合物在DMSO中的原液50nL移液到384孔的黑色小体积微滴板中。加入2微升人重组MPS1水溶液[25 mM HEPES pH 7.7, 10 mM MgCl2, 2mM DTT, 0.05% BSA (w/v)， 0.1 mM活化的原钒酸钠，0.001% Pluronic F-127]，在22℃下孵育15分钟，使测试化合物与酶预结合。然后，加入3μL的ATP溶液（低ATP浓度为16.7μM，高ATP浓度为3.3mM）启动激酶反应；5μL测定体积的终浓度分别为10μM和2mM)和生物素化肽生物素- ahx - pwdpddaditeilg（酰胺型c端）(1.67μM；末浓度=1μM)，在22℃下孵育60min。酶的浓度根据酶组的活性进行调整，并选择适当的浓度以使测定在线性范围内（典型浓度在0.25-0.5nM范围内）。在EDTA水溶液（40mM EDTA, 0.1% (w/v) BSA, 100mM HEPES pH 7.4）中加入5μL的TR-FRET检测试剂溶液[140 nM streptavidin-XLent和1.5nM抗磷酸化(Ser/Thr)-europium抗体]停止反应。所得混合物在22℃下孵育1小时，使磷酸化的生物素化肽与检测试剂之间形成络合物。随后，通过测量从铕螯合物到链亲和素- xlent的共振能量转移来评估磷酸化底物的量。为此，使用TR-FRET阅读器[例如，PHERAstar]测量在350nm激发后在620nm和665nm处的荧光发射。以665nm和620nm发射光谱的比值作为测定磷酸化底物量的指标。数据归一化（无抑制剂的酶反应=0%抑制，所有其他检测成分但无酶反应=100%抑制），并使用四参数拟合计算ic50值。结合动力学研究。表面等离子体共振（SPR）光谱在Biacore T100仪器上进行。重组hMPS1激酶结构域（N515-T806）在大肠杆菌含有凝血酶裂解位点的n端gst融合蛋白中表达，通过谷胱甘肽亲和层析纯化，然后进行凝血酶裂解，随后进行尺寸排除层析，如下所述，用于结晶实验的蛋白生产。通过胺偶联将该蛋白固定在S系列CM5传感器芯片上，密度为1000和5000 RU。在测定缓冲液[25mM HEPES pH7.7, 10mM MgCl2, 2mM DTT, 0.001% （v/v）表面活性剂P20, 2% DMSO]中预先平衡固定蛋白后，将5系列稀释的测试化合物应用于多个注射周期（16个：浓度为3.9,7.8,15.6,31.3,62.5,125,250,500和1000 nM）或单次注射周期（41个：浓度为2,7.8,31.3,125和500 nM）。所得到的传感器图拟合到包含质量输运标准项的简单Langmuir 1:1相互作用模型，从中得到动力学参数[kon， koff，（=1/koff）]。[4]

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大鼠肝细胞体外代谢稳定性研究。[4]
采用两步灌注法分离雄性Wistar大鼠肝细胞。灌注后，小心地从大鼠身上取出肝脏，打开肝包膜，轻轻摇出肝细胞，放入冰冷的Williams培养基E （WME）培养皿中。将得到的细胞悬液通过无菌纱布过滤到50mL Falcon管中，在50×gfor下离心3min。将细胞颗粒在30mL WME中重悬，在100×g下通过Percoll梯度离心两次。再次用WME洗涤肝细胞，并在含5% FCS的培养基中重悬。台盼蓝法测定细胞活力。为了进行代谢稳定性试验，将肝细胞在含有5% FCS的WME中以1.0 × 106个生命细胞/mL的密度分布到玻璃瓶中。将待测化合物添加至终浓度为1μM。培养中的有机溶剂限制在≤0.01% DMSO和≤1%乙腈。孵育期间，肝细胞悬液以580 rpm连续振荡，在2、8、16、30、45和90 min取等量，立即加入等体积的冷乙腈。样品在-20°C下冷冻过夜，然后在3000rpm下离心15分钟。上清用Agilent 1200高效液相色谱系统进行MS/MS检测。试验化合物的半衰期由浓度-时间图确定。根据半衰期，计算本征清除率和体外预测清除率，并根据“充分搅拌”肝脏模型计算EH=(CLb/LBF)·100%的肝脏提取率。3结合标准化肝血流量（LBF）和体内、体外肝细胞数量，计算体外血清除率（CLb，体外）和肝提取比（EH，体外）。肝血流量：大鼠、狗、人分别为4.2、2.1、1.32L/h/kg；比肝重：大鼠、狗、人分别为32、39、21 g/kg体重；活体肝细胞，1.1×108cells/g肝；体外肝细胞，1.0×106/mL。

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肝微粒体体外代谢稳定性研究。[4]
在100mM磷酸盐缓冲液pH7.4 （NaH2PO4·H2O + Na2HPO4·2H2O）中，以1μM浓度的肝微粒体悬液孵育，蛋白浓度0.5 mg/mL, 37℃，测定化合物的体外代谢稳定性。在pH 7.4的磷酸盐缓冲液中加入含有8 mM葡萄糖-6-磷酸、0.5 mM NADP和1 IU/mL葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的辅因子，激活微粒体。随后不久，将试验化合物以1mL的终体积加入孵育中，开始代谢测定。孵育期间，以580转/分的速度连续摇匀微粒体悬液，并在2、8、16、30、45和60分钟取等分。按照上述肝细胞法进一步处理和分析。

在 96 孔多滴定板上，将培养的肿瘤细胞以 5000 个细胞/孔（MCF7、DU145、HeLa-MaTu-ADR）、3000 个细胞/孔（NCI-H460、HeLa-MaTu、HeLa）或 1000 个细胞/孔的密度铺板。细胞/孔（B16F10），添加有 10% 胎牛血清的五种生长培养基各 200 μl。”将测试物质添加到其他板中的新鲜培养基（200 μl）中，该培养基已更换为不同的培养基浓度（0 μM，以及0.01-30 μM范围内）。将细胞在测试物质存在下孵育4天。24小时后，将一块板（零点板）上的细胞结晶紫染色，通过结晶紫染色评估细胞增殖情况，固定细胞时，每点加入11%戊二醛溶液20μl，室温静置15分钟，固定细胞15用水洗涤3次，然后在室温下干燥平板，细胞染色包括添加100μl/测量点的0.1％结晶紫溶液(pH 3.0)。对染色细胞进行三轮水洗后，将板在室温下干燥。为了溶解染料，添加 100 μl/测量点的 10% 乙酸溶液。

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Multinuclearity化验。[2]
将U-2 OS 细胞以每孔2500个细胞的密度在384孔微滴板中接种于20 μL细胞培养基中，37℃孵育过夜。以终浓度为100 nmol/L，分三次加入Empesertib (BAY1161909)或BAY 1217389。细胞在37℃条件下分别处理0、24、48和72小时。之后，用4% (v/v) PFA固定细胞，0.5% (v/v) Triton X-100渗透细胞，并用0.5% (v/v) BSA在PBS中阻断细胞。抗体标记法检测α-微管蛋白结构。用山羊IgG阻断后，在阻断液中加入二抗。用PBS洗涤细胞，并用Hoechst 33342标记细胞核。最后，将细胞洗净，用PBS覆盖，并在4°C下保存，直到获取图像。使用PerkinElmer Opera高含量分析阅读器获取图像。

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细胞分析。[4]<
人类肿瘤细胞系从ATCC或德国微生物和细胞培养物收集中获得。细胞系的鉴定在德国微生物和细胞培养物收集处进行。细胞在建议的生长条件下在37°C的加湿培养箱中繁殖。如前所述进行HeLa和HT29细胞增殖试验。

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纺锤体组装检查点（SAC）试验（基于细胞的机制试验）[4]<
SAC试验按照我们公布的方案进行。活细胞成像联合治疗研究。对于荧光活细胞成像，实验按照我们公布的方案进行。

大鼠、犬和人
\n1-2 mg/mL
\n灌胃、静脉注射

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\n\n药代动力学研究[2]
\n在雄性Wistar大鼠和雌性CD1或NMRI nu/nu小鼠中进行了药代动力学研究。对于大鼠和小鼠的静脉注射研究，Empesertib (BAY1161909)溶解于1% DMSO、99%血浆中；对于大鼠的口服研究，溶解于50%聚乙二醇(PEG) 400、10%乙醇、40%水中；对于小鼠的口服研究，溶解于75% PEG 400、5%乙醇、25%溶剂中。 BAY 1217389 溶于 50% PEG 400、10% 乙醇和 40% 水中，用于大鼠和小鼠的静脉注射和口服给药。在药代动力学研究中，分别于静脉注射后 2、5、15、30、45 分钟、1、2、4、6、8 和 24 小时，以及口服给药后 8、15、30、45 分钟、1、2、4、6、8 和 24 小时采集血浆样本，并用冰冷的乙腈（1:5）沉淀。采用液相色谱-串联质谱法 (LC/MS-MS) 分析上清液。根据血浆浓度数据估算药代动力学参数，例如，使用对数线性梯形法则估算 AUC。最大血浆浓度 (Cmax) 和达峰时间 (Tmax) 直接取自浓度-时间曲线。\n

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\n动物疗效研究 [2]
\n肿瘤异种移植研究中，使用 50 日龄、平均体重 20 至 22 克的雌性无胸腺 NMRI nu/nu 小鼠（Taconic 公司），小鼠在适应环境 14 天后进行饲养。小鼠全天 24 小时自由摄食饮水。将处于指数生长期的细胞培养物中的人肿瘤细胞重悬于 100% Matrigel 中，分别用于 A2780cis、NCI-H1299 和 SUM-149 模型，最终浓度分别为 2 × 10⁷、3 × 10⁷ 或 5 × 10⁷ 个细胞/mL。将0.1 mL的2 × 10⁶个A2780cis细胞、3 × 10⁶个NCI-H1299细胞或5 × 10⁶个SUM-149细胞皮下植入无胸腺小鼠的腹股沟区域。从裸鼠体内连续传代培养的患者肿瘤外植体MAXF 1384或LU384中获取肿瘤碎片，将其切成直径4至5 mm的小块，皮下移植到无胸腺小鼠的侧腹部。每周测量2至3次肿瘤面积（最长径与其垂直径的乘积），并使用游标卡尺测量肿瘤面积，同时测定小鼠体重。肿瘤生长抑制率以治疗/对照比值（T/C）表示，该比值根据研究结束时的肿瘤面积计算得出。动物体重被用作治疗相关毒性的指标。体重下降超过20%被视为毒性反应。根据肿瘤模型的生长情况，当肿瘤大小达到约 20 至 40 mm² 时，将动物随机分为治疗组和对照组（每组 8-10 只小鼠），并分别经口给予赋形剂（70% PEG 400、5% 乙醇和 25% Solutol）、Empesertib (BAY1161909)、BAY 1217389 和/或紫杉醇治疗，具体药物和用药方案见表格和图例。在联合治疗组中，Mps1 抑制剂和紫杉醇在同一天给药，给药时间间隔不超过 1 小时。每只动物的治疗剂量根据其体重而定。体内作用机制研究[2]
为了分析体内多倍体和多核诱导情况，将携带A2780cis肿瘤的雌性NMRI裸鼠（见上文）分别接受以下治疗：紫杉醇（静脉注射一次，24 mg/kg）、Empesertib (BAY1161909)（口服，每日两次，连续2天，每次2.5 mg/kg），以及紫杉醇（静脉注射一次，24 mg/kg）联合Empesertib (BAY1161909)（口服，每日两次，连续2天，每次1 mg/kg）。所有组的治疗均在肿瘤细胞接种后第14天，肿瘤大小达到60 mm²时开始。在治疗第 1 天首次施用 Empesertib (BAY1161909) 后 4 小时和 8 小时，以及在治疗第 2 天首次施用 BAY 1161909 后 4 小时、8 小时和 24 小时，分别制备肿瘤样本。每个时间点，每个治疗组分析 3 只动物。肿瘤经石蜡包埋和苏木精-伊红染色后用于组织学检查。\n

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\n\n大鼠和犬体内药代动力学。 [4]所有动物实验均按照德国动物福利法进行，并经当地主管部门批准。在体内药代动力学实验中，将受试化合物以0.1至0.5 mg/kg的剂量静脉注射或以0.2至1.0 mg/kg的剂量灌胃给予雄性Wistar大鼠或雌性比格犬，所有化合物均配制成溶液，并使用PEG400等增溶剂，剂量均控制在耐受范围内。静脉给药时，受试化合物以推注（大鼠）或15分钟输注（犬）的方式给药。给药后在不同时间点采集血样，通常持续24小时。根据预期的半衰期，在更晚的时间点（例如48小时、7小时）采集额外的血样。血液收集于肝素锂抗凝管中，并以3000 rpm离心15分钟。取100μL上清液（血浆），加入400μL冷乙腈沉淀。样品于-20℃冷冻过夜，随后解冻，并在4℃、3000rpm下离心20-8分钟。取上清液，使用配备MS/MS检测器的Agilent 1200高效液相色谱系统进行分析。采用非房室模型分析，并使用药代动力学计算软件计算AUC和CL等药代动力学参数。\n

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\n\n动物[4]
\n肿瘤异种移植研究中，使用50日龄、平均体重20-22g的雌性无胸腺NMRI nu/nu小鼠（Taconic），小鼠在适应环境14天后进行实验。小鼠全天24小时自由摄食饮水。取自指数生长期的细胞培养物的人NCI-H1299肿瘤细胞，重悬于100% Matrigel基质胶中，最终浓度为3×10⁷个细胞/mL，并以0.1mL的细胞悬液皮下注射至无胸腺NMRI裸鼠的腹股沟区域。从裸鼠体内连续传代培养获得的患者肿瘤外植体MAXF 1384的肿瘤碎片，被切割成直径4-5mm的小块，并皮下移植至无胸腺NMRI裸鼠的侧腹部。每周2-3次测量肿瘤面积（最长径与其垂直径的乘积，使用游标卡尺测量）和体重。肿瘤生长抑制率以治疗/对照比值（T/C）表示，该比值根据研究结束时的肿瘤面积计算得出。动物体重被用作治疗相关毒性的指标。体重下降超过20%被认为具有毒性。当肿瘤大小达到约 20–40 mm² 时，将动物随机分为治疗组和对照组（每组 8–10 只小鼠），并分别给予 S9 组和对照组，每日两次口服（po）给药，连续给药 2 天，停药 5 天。给药方案包括：载体（70% PEG 400、5% EtOH、25% Solutol）、41 组（Empesertib (BAY1161909)）、79 组（BAY 1217389），和/或每周一次静脉注射（iv）紫杉醇，具体给药方案如图 8 所示。在联合治疗组中，MPS1 抑制剂和紫杉醇在同一天给药，给药时间间隔不超过 1 小时。每只动物的治疗剂量根据其体重而定。动物根据德国动物福利指南实施安乐死。数据以肿瘤面积均值 ± 标准差表示。统计分析包括单因素方差分析，并使用 SigmaStat 软件通过成对比较程序将差异与对照组进行比较。

体内药代动力学参数[2]
在小鼠和大鼠中测定了药代动力学参数。向雄性CD1小鼠和雄性Wistar大鼠静脉注射0.5 mg/kg的BAY 1161909后，该化合物的血药清除率较低。两种动物的稳态分布容积（Vss）均较高，且终末半衰期较长。向雌性NMRI小鼠和雄性Wistar大鼠口服1 mg/kg和0.5 mg/kg后，4小时达到血浆峰浓度。小鼠和大鼠的口服生物利用度中等（表1）。分别向雌性CD1小鼠和雄性Wistar大鼠静脉注射1.0 mg/kg和0.5 mg/kg的BAY 1217389。在所测试的动物中，血药清除率均较低。稳态分布容积（Vss）较高，且终末半衰期较长。将 BAY 1217389 分别口服给予雌性 NMRI 小鼠（1 mg/kg）和雄性 Wistar 大鼠（0.5 mg/kg）。血浆峰浓度出现在给药后 1.5 至 7 小时之间。大鼠的口服生物利用度较高，小鼠的口服生物利用度中等（表 1）。我们的数据表明，我们已鉴定出两种具有良好药代动力学特征的新型 Mps1 激酶抑制剂，支持其进一步开发用于临床应用。

[1]. PRODRUG DERIVATIVES OF SUBSTITUTED TRIAZOLOPYRIDINES. WO2014198647A2.

[2]. Novel Mps1 Kinase Inhibitors with Potent Antitumor Activity. Mol Cancer Ther. 2016 Apr;15(4):583-92.

[3]. Target Residence Time-Guided Optimization on TTK Kinase Results in Inhibitors with Potent Anti-Proliferative Activity. J Mol Biol. 2017 Jul 7;429(14):2211-2230.

[4]. Treating Cancer by Spindle Assembly Checkpoint Abrogation: Discovery of Two Clinical Candidates, BAY 1161909 and BAY 1217389, Targeting MPS1 Kinase. J Med Chem. 2020 Aug 13;63(15):8025-8042.

恩佩塞替尼是一种口服生物利用度高的选择性丝氨酸/苏氨酸单极纺锤体1 (Mps1) 激酶抑制剂，具有潜在的抗肿瘤活性。给药后，恩佩塞替尼与Mps1结合并抑制其活性。这会导致纺锤体组装检查点 (SAC) 失活、有丝分裂加速、染色体排列错乱、染色体分离错误、有丝分裂检查点复合物不稳定以及非整倍体增加。最终导致Mps1过表达的癌细胞发生细胞死亡。 Mps1是一种在增殖的正常组织中表达的激酶，在多种人类肿瘤中异常过表达。它在有丝分裂过程中被激活，对纺锤体组装检查点（SAC）的功能至关重要，并控制着染色体的排列。单极纺锤体1 (Mps1) 已被证实是激活纺锤体组装检查点 (SAC) 的关键激酶，以确保染色体正确分配到子细胞。本文报道了两种新型选择性Mps1抑制剂BAY 1161909和BAY 1217389的结构和功能表征，它们分别属于不同的结构类别。BAY 1161909和BAY 1217389对Mps1激酶活性的抑制IC50值均低于10 nmol/L，且表现出优异的选择性。在细胞机制分析中，两种 Mps1 抑制剂均能消除诺考达唑诱导的 SAC 活性，并诱导细胞过早退出有丝分裂（“有丝分裂突破”），最终导致多核化和肿瘤细胞死亡。两种化合物均能有效抑制体外肿瘤细胞增殖（IC50 值在 nmol/L 范围内）。在体内，BAY 1161909 和 BAY 1217389 在肿瘤异种移植模型中单药治疗取得了中等疗效。然而，与其独特的作用机制相符，当与紫杉醇联合使用时，低剂量的 Mps1 抑制剂可通过减弱 SAC 活性来降低紫杉醇诱导的有丝分裂阻滞。因此，在多种异种移植模型中，包括那些表现出获得性或固有性紫杉醇耐药性的模型，联合治疗在各自的最大耐受剂量 (MTD) 下均显著提高了疗效，优于紫杉醇或 Mps1 抑制剂单药治疗。两种 Mps1 抑制剂均表现出良好的耐受性，且不会增加紫杉醇单药治疗的毒性。这些临床前研究结果验证了SAC抑制这一创新概念在癌症治疗中的应用，并为评估Mps1抑制剂BAY 1161909和BAY 1217389与抗有丝分裂抗癌药物联合用药的临床概念验证研究提供了依据，旨在提高抗癌药物的疗效并可能克服耐药性。[2]

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蛋白激酶苏氨酸酪氨酸激酶（TTK；也称为Mps1）是纺锤体组装检查点的关键组成部分，也是治疗侵袭性癌症（例如三阴性乳腺癌）的一个很有前景的药物靶点。虽然首批TTK抑制剂已进入临床试验阶段，但人们对小分子化合物抑制TTK如何影响细胞活性知之甚少。我们研究了本实验室自主研发的选择性 TTK 抑制剂 NTRC 0066-0，以及其他公司研发的 11 种 TTK 抑制剂，包括 Mps-BAY2b、BAY 1161909、BAY 1217389（拜耳公司）、TC-Mps1-12（盐野义制药公司）和 MPI-0479605（迈瑞克斯公司）。平行实验表明，这些 TTK 抑制剂的细胞活性与其对 TTK 的结合亲和力相关，并且与靶点停留时间的相关性更强。因此，TTK 抑制剂是靶点停留时间决定体外细胞活性的一个例子。X 射线晶体结构和热稳定性实验表明，活性最强的化合物会诱导富含甘氨酸的环发生位移，这是由于其与 553 位催化赖氨酸结合所致。这种“赖氨酸陷阱”会破坏催化机制。基于这些见解，我们开发了基于(5,6-二氢)嘧啶并[4,5-e]吲哚嗪骨架的TTK抑制剂，该抑制剂具有更长的靶点停留时间，并进一步利用了Lys553周围的变构口袋。它们的结合模式对于激酶抑制剂而言是全新的，可归类为I型/III型混合型。这些抑制剂具有非常强的抗增殖活性，可与经典的细胞毒性疗法相媲美。我们的发现将为TTK抑制剂在癌症治疗中的更多应用开辟新的途径。[3]

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抑制单极纺锤体1 (MPS1) 激酶代表了一种新的癌症治疗方法：它不是阻滞肿瘤细胞的细胞周期，而是驱动细胞进入有丝分裂，而不管是否存在DNA损伤和未连接/错误连接的染色体，从而导致非整倍体和细胞死亡。我们优化筛选MPS1抑制剂的起点是来自不同化学系列“三唑并吡啶”和“咪唑并吡嗪”的两个高通量筛选（HTS）先导化合物。三唑并吡啶系列的主要问题是其HTS先导化合物的效力中等。咪唑并吡嗪系列的效力比前者高出10倍以上；然而，在项目早期阶段，该系列化合物的代谢稳定性较差。本文概述了这两个先导化合物系列如何演变为临床候选药物BAY 1161909和BAY 1217389，并揭示了这两个临床候选药物如何与MPS1激酶的ATP结合位点结合，它们通过不同的结合相互作用作用于不同的结合口袋，同时还介绍了它们的合成以及在选定的体内疗效模型中进行的临床前表征。[4]

C29H26FN5O4S

559.61

559.168

C, 62.24; H, 4.68; F, 3.39; N, 12.51; O, 11.44; S, 5.73

1443763-60-7

1443763-60-7;2170218-39-8;2170218-40-1 (tosylate hydrate);

71599640

White to off-white solid powder

1.4±0.1 g/cm3

1.658

4.44

123

2

8

8

40

951

1

C1(F)=CC=C(C=C1)[C@@H](C)C(NC1C=CC(C2C=CC3N(C=2)N=C(NC2C=CC(S(C)(=O)=O)=CC=2OC)N=3)=CC=1)=O

NRJKIOCCERLIDG-GOSISDBHSA-N

InChI=1S/C29H26FN5O4S/c1-18(19-4-9-22(30)10-5-19)28(36)31-23-11-6-20(7-12-23)21-8-15-27-33-29(34-35(27)17-21)32-25-14-13-24(40(3,37)38)16-26(25)39-2/h4-18H,1-3H3,(H,31,36)(H,32,34)/t18-/m1/s1

(2R)-2-(4-fluorophenyl)-N-[4-[2-(2-methoxy-4-methylsulfonylanilino)-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pyridin-6-yl]phenyl]propanamide

Empesertib; Mps1-IN-5; BAY1161909; 1443763-60-7; Mps1-IN5; BAY 1161,909; BAY-1161,909; BAY1161,909; Empesertib [INN]; Empesertib [WHO-DD]; BAY-1161909; BAY 1161909

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: ≥ 35 mg/mL (~62.5 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.47 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: 2.5 mg/mL (4.47 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.47 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。