Ethyl Caffeate primarily targets the transcription factor NF-κB by preventing its binding to DNA. At the molecular level, its effects are mediated through the inhibition of NF-κB-DNA complex formation. The compound does not affect upstream signaling components including IκBα phosphorylation/degradation, NF-κB (p65) translocation to the nucleus, or the activation of mitogen-activated protein kinases (SAPK/JNK, p38, p42/44). The IC₅₀ for inhibiting LPS-induced NO production in RAW 264.7 macrophages is 5.5 μg/mL. [1]
NF‑κB (by impairing NF‑κB‑DNA complex formation) [1]

咖啡酸乙酯以剂量依赖的方式显著抑制 RAW 264.7 巨噬细胞中 LPS 诱导的 NO 生成，IC₅₀ 为 5.5 μg/mL。在 2 μg/mL 浓度下，NO 生成量较仅 LPS 处理的细胞降低了 35%。[1]
该化合物抑制 iNOS mRNA 的表达；在 1 μg/mL 浓度下，iNOS mRNA 水平降低了 56%，而在 2 μg/mL 浓度下，iNOS mRNA 水平与溶剂对照组相似。在蛋白水平上，0.5 μg/mL 咖啡酸乙酯使 iNOS 蛋白水平降低至仅 LPS 处理细胞的约 30%。[1]
咖啡酸乙酯抑制 LPS 诱导的 COX-2 蛋白表达；在 5 μg/mL 浓度下，COX-2 蛋白表达水平降低至仅 LPS 处理对照组的 45%。它还能显著抑制PGE₂的产生；在1 μg/mL浓度下，PGE₂的产生被显著抑制，而在2-5 μg/mL浓度下，PGE₂的产生被完全抑制。[1]
在TPA处理的MCF-7细胞中，咖啡酸乙酯（10-100 μg/mL）以剂量依赖的方式下调cox-2的转录活性，使全长cox-2启动子活性分别降低72%（10 μg/mL）、57%（50 μg/mL）和48%（100 μg/mL）。[1]
浓度高达10 μg/mL的咖啡酸乙酯不影响巨噬细胞中LPS诱导的MAPK磷酸化（SAPK/JNK、p38、p42/44）。它还不影响IκBα的磷酸化和降解，也不影响NF-κB p65向细胞核的转位。[1]
体外EMSA结合实验表明，咖啡酸乙酯（10-20 μg/mL）呈剂量依赖性地抑制NF-κB与DNA的结合，在20 μg/mL时完全抑制。50 μM DTT可完全逆转这种抑制作用。[1]
结构-活性关系研究表明，儿茶酚部分和α,β-不饱和酯基团对于NF-κB DNA结合的抑制均至关重要。咖啡酸乙酯（同时含有儿茶酚和α,β-不饱和酯基团）的抑制效果最佳；3,4-二羟基氢化肉桂酸乙酯（仅含有儿茶酚部分）的抑制作用较弱；肉桂酸乙酯（仅含有α,β-不饱和酯基团）则无抑制作用。 [1] 乙基咖啡因的IC50值为5.5 μg/ml，能显著抑制脂多糖（LPS）诱导的一氧化氮（NO）生成[1]。乙基咖啡因显著抑制了LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞中NO的生成，IC₅₀值为5.5 μg ml⁻¹；浓度为2 μg ml⁻¹时，NO生成量较仅LPS处理的对照组降低了35%。[1]乙基咖啡因抑制了iNOS mRNA的表达：浓度为1 μg ml⁻¹时，LPS处理的巨噬细胞中iNOS mRNA水平降低了约56%（通过密度分析法测定）；浓度为2 μg ml⁻¹时，iNOS mRNA水平与溶剂对照组相似。 [1]

- Western blot 分析显示，浓度为 0.5 μg ml⁻¹ 的乙基咖啡因可将 iNOS 蛋白水平降低至仅用 LPS 处理的细胞的约 30%。[1]

- 在 MCF-7 细胞中，使用人 COX-2 启动子构建体进行瞬时转染实验，乙基咖啡因（10、50、100 μg ml⁻¹）分别使 TPA 诱导的全长 (−1334/−1) COX-2 启动子活性降低了 72%、57% 和 48%。未观察到对 TPA 诱导的 IL-10 启动子活性的影响，表明其具有特异性。缺失分析表明，−646/−1启动子区域（包含NF-κB、NF-IL6和CRE位点）是最小反应元件，乙基咖啡因（20 μg ml⁻¹）对−1334/−1构建体的荧光素酶活性抑制率为67%，对−646/−1构建体的荧光素酶活性抑制率为80%。[1] 5 μg ml⁻¹的乙基咖啡因可抑制LPS诱导的RAW 264.7细胞中COX-2蛋白表达45%（密度分析）。[1] 1 μg ml⁻¹的乙基咖啡因可显著抑制LPS刺激的RAW 264.7细胞中PGE₂的产生；在 2-5 μg ml⁻¹ 浓度下，观察到 PGE₂ 完全抑制。[1]

- 乙基咖啡因 (1-10 μg ml⁻¹) 不影响 LPS 诱导的 RAW 264.7 细胞中 MAPK（SAPK/JNK、p38、p42/44）的磷酸化（通过磷酸化特异性抗体的 Western blot 检测）。[1]

- 乙基咖啡因 (1-20 μg ml⁻¹) 不影响 LPS 刺激的 RAW 264.7 细胞中 IκBα 的磷酸化、IκBα 的降解或 NF-κB p65 的核转位（通过 Western blot 检测）。 [1]

- 在体外EMSA实验中，乙基咖啡因以剂量依赖的方式抑制NF-κB与DNA的结合：10 μg ml⁻¹时有显著抑制作用，20 μg ml⁻¹时完全抑制；50 μM DTT可完全逆转这种抑制作用。[1]

- 在使用EMSA进行的构效关系研究中，乙基咖啡因（50 μM）完全抑制NF-κB与DNA的结合；3,4-二羟基氢化肉桂酸乙酯（100 μM）也完全抑制，儿茶酚（400 μM）完全阻断结合，而肉桂酸乙酯（浓度高达400 μM）则无抑制作用。 [1]

- 乙基咖啡因在浓度≤10 μg ml⁻¹时对RAW 264.7细胞几乎没有细胞毒性（MTT法测定）。浓度为5 μg ml⁻¹时，>50%的细胞存活；浓度为20 μg ml⁻¹时，细胞存活率下降，但未提供具体数据。[1]

在小鼠皮肤免疫组织化学研究中，局部应用咖啡酸乙酯可显著抑制表皮层中TPA诱导的COX-2表达，且呈剂量依赖性。在1 mg/200 μL/位点（24 mM）时，咖啡酸乙酯的抑制效果与1 mg/200 μL/位点的塞来昔布（13 mM）相当。在2 mg/200 μL/位点（48 mM）时，咖啡酸乙酯抑制TPA诱导的COX-2表达的效果优于10 mg/200 μL/位点的塞来昔布（131 mM）。[1]

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- 在雌性ICR小鼠皮肤中，局部应用咖啡酸乙酯（1 mg/200 μL/位点，~24 mM）可显著抑制TPA（10 nmol）诱导的COX-2表达，免疫组织化学结果证实了这一点；其抑制效果与相同剂量（1 mg/200 μl/位点，~13 mM）的塞来昔布相当。更高剂量的乙基咖啡因（2 mg/200 μl/位点，~48 mM）在抑制TPA诱导的COX-2表达方面比10 mg/200 μl/位点（~131 mM）的塞来昔布更有效。[1]

采用电泳迁移率变动分析 (EMSA) 评估 NF-κB 与 DNA 的结合。将 LPS 刺激的 RAW 264.7 细胞的核提取物 (4 μg) 与生物素末端标记的 22 聚体双链 NF-κB 寡核苷酸在含有 10% 甘油、100 mM KCl、1.5 mM MgCl₂ 和 0.3 mM EDTA 的结合缓冲液中于室温孵育 20 分钟。对于体外结合实验，将 LPS 刺激的细胞核提取物与不同浓度的测试化合物（包括浓度为 10 和 20 μg/mL 的咖啡酸乙酯）于 37°C 处理 30 分钟，然后进行 EMSA 分析。DNA-蛋白质复合物在 5-10% 梯度聚丙烯酰胺凝胶上进行分离。特异性通过抗p65抗体的超迁移实验和与未标记的NF-κB寡核苷酸的竞争实验得到证实。[1]

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- NF-κB-DNA结合的电泳迁移率变动分析（EMSA）：从LPS刺激的RAW 264.7细胞（1 μg ml⁻¹ LPS，30分钟）中制备核提取物。将核提取物（4 μg）与不同浓度的乙基咖啡因在37°C下孵育30分钟。然后，加入生物素末端标记的双链22聚体NF-κB寡核苷酸（5′-ATGTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3′），并在室温下于含有10%甘油、100 mM KCl、1.5 mM MgCl₂和0.3 mM EDTA的结合缓冲液中孵育20分钟。 DNA-蛋白质复合物通过5-10%梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳与游离寡核苷酸分离。使用抗p65抗体进行超迁移实验，并与未标记的NF-κB寡核苷酸竞争，以验证其特异性。使用DTT（50 μM）检测反应的可逆性。[1]

RAW 264.7 小鼠巨噬细胞培养于含 10% FBS 的 DMEM 培养基中。NO 生成测定中，细胞（2×10⁵ 个细胞/孔）先用咖啡酸乙酯（0.1-20 μg/mL）预处理 1 小时，再用 LPS（1 μg/mL）刺激 24 小时。亚硝酸盐积累通过 Griess 反应测定（取 100 μL 上清液与 100 μL Griess 试剂混合，于 540 nm 波长处测定吸光度）。细胞活力通过 MTT 法测定，以排除细胞毒性。[1] RT-PCR 测定中，细胞（3×10⁶ 个细胞/孔）先用咖啡酸乙酯（0.5-5 μg/mL）处理 1 小时，再用 LPS（1 μg/mL）处理 6 小时。使用TRIZOL试剂分离总RNA，并用特异性引物扩增iNOS mRNA。GA3PDH用作内参。[1]
对于Western blot实验，细胞先用咖啡酸乙酯处理1小时，然后用LPS（1 μg/mL）处理18小时（iNOS、COX-2）、30分钟（MAPK）或11分钟（IκBα）。将总蛋白、胞质蛋白或核蛋白（20 μg）通过SDS-PAGE电泳分离，转移至PVDF膜，并用针对iNOS、COX-2、磷酸化MAPK、IκBα、p65 NF-κB、PARP和α-微管蛋白的特异性抗体进行检测。 [1]
对于 COX-2 启动子活性检测，使用 LipofectAMINE 将 pCOX-2-Luc 和 pRL-TK-Luc 共转染至 MCF-7 细胞（1.2×10⁵/孔）。恢复后，用 TPA（50 ng/mL）单独处理细胞，或用咖啡酸乙酯（10-100 μg/mL）处理细胞 6 小时。使用双荧光素酶报告基因检测法测定萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶活性。[1]
对于 PGE₂ 测定，用 500 μM 阿司匹林预处理 RAW 264.7 细胞 3 小时（以灭活 COX-1），洗涤后，用咖啡酸乙酯（0.1-20 μg/mL）处理 1 小时，再用 LPS（1 μg/mL）处理 16 小时。使用 ACE 竞争性酶免疫测定法测定培养基中的 PGE₂ 含量。 [1]

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- NO 生成测定：将 RAW 264.7 细胞（96 孔板中每孔 1×10⁴ 个细胞）用乙基咖啡因（0.1‐20 μg ml⁻¹）预处理 1 小时，然后用 LPS（1 μg ml⁻¹）刺激 24 小时。通过 Griess 反应测定培养上清液中的亚硝酸盐积累：取 100 μl 上清液与 100 μl Griess 试剂（0.1% N-(1‐萘基)乙二胺水溶液和 1% 磺胺 5% 磷酸溶液的 1:1 混合物）混合，在 540 nm 处测定吸光度。 [1]

- 细胞活力检测 (MTT)：将 RAW 264.7 细胞（1×10⁴ 个细胞/孔）用乙基咖啡因（0.1-20 μg ml⁻¹）处理 24 小时，然后加入 MTT，并在 570 nm 处测量甲臜吸光度。细胞活力计算公式为 (OD₅₇₀ 处理组 / OD₅₇₀ 溶剂对照组) × 100。[1]

- RT-PCR 分析：将 RAW 264.7 细胞（6 孔板中 3×10⁶ 个细胞/孔）用乙基咖啡因（0.5-5 μg ml⁻¹）预处理 1 小时，然后用 LPS（1 μg ml⁻¹）刺激 6 小时。使用 TRIZOL 试剂提取总 RNA。使用逆转录酶以 2 μg 总 RNA 为模板合成第一链 cDNA。iNOS 引物：正义链 5′-CAGAAGCAGAATGTGACCATC-3′，反义链 5′-CTTCTGGTCGATGTCATGAGC-3′；GA3PDH 作为内参。PCR 条件：94°C 2 分钟（1 个循环）；94°C 1 分钟，55°C 30 秒，72°C 1 分钟，共 30 个循环。PCR 产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳分离，并用溴化乙锭染色显影。[1]

- Western blot 分析：裂解细胞，取总细胞蛋白、胞质蛋白或核蛋白（20 μg）进行 5-20% 梯度 SDS-PAGE 电泳分离，然后转移至 PVDF 膜。将膜用3%脱脂奶粉封闭，与一抗（抗iNOS、抗IκBα、抗磷酸化IκBα、抗NF-κB p65、抗磷酸化MAPKs、抗PARP、抗α-微管蛋白、抗GA3PDH）于4℃孵育过夜，然后与HRP标记的二抗孵育，最后通过增强化学发光法显色。[1]

- 瞬时转染和荧光素酶活性检测：将MCF-7细胞（24孔板，每孔1.2×10⁵个细胞）与COX-2启动子-荧光素酶构建体（全长或缺失）和pRL-TK-Luc共转染，转染试剂为脂质体转染试剂。4小时后更换培养基，细胞恢复培养16小时。然后分别用载体（0.1% DMSO）、TPA（50 ng ml⁻¹）或TPA加乙基咖啡因（10-100 μg ml⁻¹）处理6小时。检测细胞裂解液中的萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶活性；启动子活性以萤火虫/海肾荧光素酶比值表示。[1]

- PGE₂生成测定：将RAW 264.7细胞（96孔板中每孔1×10⁴个细胞）用500 μM阿司匹林预处理3小时以灭活COX-1，洗涤后，用乙基咖啡因（0.1-20 μg ml⁻¹）处理1小时，再用LPS（1 μg ml⁻¹）处理16小时。收集培养基，并通过竞争性酶免疫测定法测定PGE₂。 [1]

本研究使用雌性ICR小鼠。剃除小鼠背部皮肤毛发。小鼠局部涂抹咖啡酸乙酯（1 mg/200 μL/位点或2 mg/200 μL/位点）或塞来昔布（1 mg/200 μL/位点或10 mg/200 μL/位点）30分钟，随后涂抹TPA（10 nmol/200 μL/位点）4小时。处理结束后，采用颈椎脱臼法处死小鼠。取皮肤组织进行福尔马林固定、石蜡包埋、切片（4 μm）和脱蜡。抗原修复时，将切片置于10 mM柠檬酸缓冲液（pH 6.0）中加热10分钟。内源性过氧化物酶用3%过氧化氢甲醇溶液封闭15分钟。将切片与多克隆COX-2抗体（1:500稀释）在室温下孵育1-2小时，然后使用HPR EnVision系统进行DAB显色，并用Mayer苏木素复染。[1]

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- 小鼠皮肤中COX-2表达的免疫组织化学研究：将雌性ICR小鼠剃毛后的背部局部涂抹丙酮（溶剂对照，200 μl/点）或TPA（10 nmol/点，200 μl/点），持续4小时。对于化合物处理组，小鼠先用乙基咖啡因（1 mg或2 mg/点，溶于200 μl丙酮）或塞来昔布（1 mg或10 mg/点，溶于200 μl丙酮）处理30分钟，然后再用TPA处理4小时，最后通过颈椎脱臼处死。将皮肤切片（4 μm）脱蜡、复水，在 10 mM 柠檬酸缓冲液（pH 6.0）中煮沸 10 分钟进行抗原修复，然后用 3% H₂O₂ 甲醇溶液处理以阻断内源性过氧化物酶。切片用 2% 正常山羊血清封闭，与多克隆 COX-2 抗体（1:500 稀释）室温孵育 1-2 小时，然后使用 HRP EnVision 系统显色，用二氨基联苯胺染色，最后用 Mayer 苏木素复染。[1]

MTT 检测结果显示，浓度为 10 μg/mL 或更低时，咖啡酸乙酯对 RAW 264.7 巨噬细胞几乎没有细胞毒性。浓度为 5 μg/mL 时，超过 50% 的细胞仍保持存活。[1] MTT 检测结果显示，在 MCF-7 细胞中，浓度为 10-100 μg/mL 的咖啡酸乙酯处理 6 小时后，未观察到细胞毒性作用。[1]

[1]. Ethyl caffeate suppresses NF-kappaB activation and its downstream inflammatory mediators, iNOS, COX-2, and PGE2 in vitro or in mouse skin. Br J Pharmacol. 2005 Oct;146(3):352-63.

反式咖啡酸乙酯是由反式咖啡酸的羧基与乙醇缩合形成的乙酯。它具有抗炎和抗肿瘤活性。它是一种烷基咖啡酸酯和乙酯，在功能上与反式咖啡酸相关。据报道，紫苏、喜马拉雅茶梅和其他一些生物体中含有咖啡酸乙酯，并有相关数据。

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咖啡酸乙酯是通过生物活性导向分级分离法从鬼针草的乙酸乙酯萃取物中分离得到的。其结构通过红外光谱、核磁共振波谱和电子轰击质谱进行表征。分子量：208 [M]⁺。熔点：147-149°C。 [1]
所提出的作用机制是“氧化抑制”机制：儿茶酚部分被氧化为α-苯醌，后者通过迈克尔加成反应与NF-κB p65亚基的半胱氨酸巯基反应，从而阻止DNA结合。α,β-不饱和酯基团为与p65的共价相互作用提供了额外的反应中心。[1]
该化合物不影响IL-10启动子活性，表明其对COX-2调控具有特异性。[1]

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- 乙基咖啡因部分通过抑制NF-κB-DNA复合物的形成来抑制iNOS和COX-2的表达，而不影响IκB的降解或MAPK的磷酸化。儿茶酚部分和α,β-不饱和酯基团是阻止NF-κB-DNA结合的关键结构特征。本文提出了一种“氧化抑制”机制：儿茶酚部分氧化为α-苯醌可能允许其与p65亚基的半胱氨酸残基发生迈克尔加成反应，从而阻断DNA结合。[1]

- 乙基咖啡因的抗炎特性可能有助于其抗肿瘤活性，这已通过抑制TPA诱导的小鼠皮肤COX-2表达得到证实。[1]

- 乙基咖啡因是通过生物活性导向的分级分离从鬼针草（全草）中分离得到的：乙醇提取、乙酸乙酯萃取、硅胶柱层析和RP-18柱层析。[1]

C11H12O4

208.2106

208.073

102-37-4

Ethyl trans-caffeate;66648-50-8

5317238

Light yellow to yellow solid powder

1.3±0.1 g/cm3

377.0±32.0 °C at 760 mmHg

148.4±18.6 °C

0.0±0.9 mmHg at 25°C

1.612

1.72

66.76

2

4

4

15

237

0

CCOC(=O)/C=C/C1=CC(=C(C=C1)O)O

WDKYDMULARNCIS-GQCTYLIASA-N

InChI=1S/C11H12O4/c1-2-15-11(14)6-4-8-3-5-9(12)10(13)7-8/h3-7,12-13H,2H2,1H3/b6-4+

ethyl (E)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)prop-2-enoate

Ethyl caffeate; 102-37-4; ethyl trans-caffeate; Ethyl 3,4-dihydroxycinnamate; Caffeic acid ethyl ester;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 本产品在运输和储存过程中需避光。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~250 mg/mL (~1200.71 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (9.99 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (9.99 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (9.99 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。