Target: Tubulin (β‑tubulin, colchicine‑binding site) – Fenbendazole binds to free tubulin and mildly inhibits polymerization; Competitive colchicine binding assay suggests binding at the colchicine site (Fig. S1) [1].
Target: Hypoxia‑inducible factor (HIF) pathway – Fenbendazole stabilizes HIF‑1α protein and induces HIF‑dependent gene expression (e.g., p21) via free tubulin binding, not via mitochondrial inhibition [2].

当应用于具有野生型p53的人类非小细胞肺癌（NSCLC）肿瘤细胞系（H460和A549）时，芬苯达唑（1 μM；24小时）可显著减缓细胞生长[1]。芬苯达唑（1 μM；24小时）可提高p53蛋白水平并诱导细胞植入[1]。人类NSCLC细胞在暴露于1 μM芬苯达唑24小时后，会进入细胞生命周期的有丝分裂期[1]。唑类化合物（1 μM；24 小时）可部分改变 A549 细胞的微管网络 [1]。体外实验：如免疫荧光（α-微管蛋白染色）所示，芬苯达唑（1 μM，24 小时）可部分改变 A549 人非小细胞肺癌 (NSCLC) 细胞的微管网络，导致细胞核周围微管笼的完整性丧失，但其作用不如秋水仙碱（50 ng/ml）显著，后者可导致微管完全解聚 [1]。在体外使用纯化牛微管蛋白（1.8 mg/ml）进行的微管蛋白聚合实验中，芬苯达唑（10 μM）对聚合作用有轻微抑制作用（通过 340 nm 处的浊度测定），而秋水仙碱（100 nM）的抑制作用更强 [1]。芬苯达唑（1 μM，24 小时）可轻微降低 α-微管蛋白的表达水平。与对照组相比，A549细胞中聚合微管蛋白的含量（可溶性/聚合微管蛋白测定）显著降低，而诺考达唑和秋水仙碱几乎完全抑制了聚合微管蛋白的形成。与诺考达唑、秋水仙碱和长春新碱显著降低乙酰化微管蛋白水平不同，芬苯达唑并未改变乙酰化微管蛋白的水平[1]。
芬苯达唑（1 μM）可诱导细胞周期蛋白B1/CDK1水平早期升高（8小时 vs 对照组16小时），并在12-24小时增加磷酸化组蛋白H3（Ser10）的水平，表明细胞有丝分裂停滞。流式细胞术显示亚G1期凋亡细胞数量随时间增加（32小时时约占30%）[1]。
芬苯达唑（1 μM）显著抑制H460和A549非小细胞肺癌细胞的生长（MTT法）。野生型p53的肿瘤细胞系比p53突变/缺失细胞更敏感。芬苯达唑诱导p53靶基因（p21、MDM2）的表达，并增加核内p53的积累。在转染野生型p53的p53缺失型H1299细胞中，芬苯达唑增强了细胞凋亡[1]。
芬苯达唑（1 μM，4小时）抑制H460和A549细胞的葡萄糖摄取（2-NBDG荧光法），并降低培养上清液中的乳酸水平。它降低了 GLUT-4 和己糖激酶 II (HKII) 的 mRNA 表达，并增加了 p53 调节的代谢基因 (TIGAR、SCO2、GLS2、脯氨酸氧化酶) [1]。
芬苯达唑 (1 μM, 24 h) 降低了细胞裂解液中己糖激酶 II 的酶活性（分光光度测定）。体外实验表明，纯化的酵母HKII活性可被递增剂量的芬苯达唑（0-100 μM）抑制[1]。
芬苯达唑（1 μM，24 h）可增加线粒体p53的转位（GFP-p53转染和线粒体组分的Western blot分析），并伴有线粒体膜去极化（JC-1染色）[1]。
在小鼠原代皮层神经元中，芬苯达唑（1 μM，8 h）可增加p21 mRNA的表达（实时PCR），而1 μM（20 h）可增加p21蛋白的表达（Western blot分析）。它还能稳定HT22细胞中的HIF-1α蛋白（4小时），并以浓度依赖的方式（0.5-2 μM）增加ODD-Luc报告基因活性（HIF-1α稳定性的替代指标）[2]。
芬苯达唑（0.25-1 μM）以剂量依赖的方式保护胚胎皮层神经元免受同型半胱氨酸（HCA）诱导的氧化应激（MTT法）。用紫杉醇（0.1 μM）预处理可消除这种神经保护作用，紫杉醇可降低游离微管蛋白水平。在神经保护浓度（≤1 μM）下，芬苯达唑不破坏神经元形态（β-微管蛋白III免疫染色）[2]。芬苯达唑（10 μM）对离体小鼠肝脏线粒体呼吸速率（状态4和状态3）、膜电位（番红O染色）或活性氧（ROS）释放（Amplex Red染色）均无影响，表明其HIF稳定作用并非由于直接的线粒体功能障碍所致[2]。芬苯达唑在体外不抑制延胡索酸酶活性（与甲苯达唑不同），该活性通过240 nm处的连续光密度测定法测定[2]。

芬苯达唑（1 mg；口服；每日一次）治疗12天可显著降低肿瘤的重量和体积[1]。
体内研究：在携带A549人非小细胞肺癌异种移植瘤（肿瘤大小2-3 mm）的雌性无胸腺裸鼠（nu/nu）中，每隔一天口服芬苯达唑（1 mg/只），持续12天，与载体对照组（橄榄油）相比，肿瘤体积和重量显著降低。肿瘤血管生成（血红蛋白含量）减少，TUNEL染色显示细胞凋亡增加。免疫组织化学显示，芬苯达唑治疗组肿瘤中p53阳性细胞增加，CD31阳性内皮细胞减少[1]。
在另一项研究中，芬苯达唑未进行体内神经保护作用的测试；然而，连续5天以50 mg/kg的剂量灌胃给予转基因小鼠甲苯咪唑（一种相关的苯并咪唑类药物）可增加小鼠脑内ODD-Luc的活性，表明HIF稳定[2]。据报道，芬苯达唑在实验动物中具有较高的安全性和较低的毒性（参考文献[1]），但这些论文中没有提供针对神经系统模型的具体体内疗效数据[1][2]。

细胞周期分析 [1]
细胞类型： A549 细胞
测试浓度： 1 μM
孵育时间： 24 小时
实验结果： 导致细胞周期蛋白 B1/CDK1 水平早期升高（8 小时，而未处理的对照细胞为 16 小时）。在 12 小时和 24 小时，磷酸化组蛋白 H3 (Ser10) 表达上调。

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细胞凋亡分析 [1]
细胞类型： A549 细胞
测试浓度： 1 uM
孵育时间： 8、16、24、32、40、48 小时
实验结果： 凋亡细胞数量随时间推移而增加，细胞周期蛋白 B1 水平降低，约 30% 的细胞在 32 小时后发生凋亡。

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蛋白质印迹分析[1]
细胞类型： H460 细胞
测试浓度： 1 μM
孵育时间： 24 小时
实验结果： 导致线粒体组分中 p53 蛋白水平升高。

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细胞实验（癌细胞）：将人非小细胞肺癌 A549、H460 和 H1299 细胞培养于含 10% FBS 的 DMEM 培养基中。对于免疫荧光染色，将盖玻片上的细胞用芬苯达唑（1 μM）或秋水仙碱（50 ng/ml）处理 24 小时，进行透化、固定，用抗 α-微管蛋白一抗和 FITC 标记的二抗染色，并用碘化丙啶对细胞核进行复染 [1]。
微管蛋白聚合测定：将纯化的牛微管蛋白（1.8 mg/ml）溶于 PEM 缓冲液（80 mM PIPES、1 mM EGTA、0.5 mM MgCl₂、1 mM GTP）中，并与 DMSO、芬苯达唑（10 μM）或秋水仙碱（100 nM）孵育。聚合反应通过监测 340 nm 波长下的吸光度进行 30 分钟监测 [1]。
可溶性/聚合微管蛋白分级分离：将处理 24 小时的细胞在微管稳定缓冲液（0.1 M MES、1 mM EGTA、0.5 mM MgCl₂、0.1 mM EDTA、4 M 甘油、0.1% NP-40、1 mM GTP、1 mM PMSF、蛋白酶抑制剂）中裂解，在 100,000 g 下离心 30 分钟，分离可溶性（上清液）和聚合（沉淀）组分。用抗α-微管蛋白和β-肌动蛋白进行蛋白质印迹分析[1]。
细胞周期和凋亡：用1 μM芬苯达唑处理同步化的A549细胞指定时间，用70%乙醇固定，用碘化丙啶染色，并通过流式细胞术进行分析。细胞凋亡也可通过膜联蛋白V/PI染色进行评估[1]。
MTT细胞活力检测：将细胞接种于96孔板中，用化合物处理24-48小时，然后加入MTT，用DMSO溶解甲臜，在570 nm处测定吸光度[1]。
Western blot：用NP-40缓冲液裂解细胞，通过SDS-PAGE分离蛋白质，转移至PVDF膜，用针对cyclin B1、CDK1、pH3(Ser10)、p53、p21、MDM2、Ac-α-微管蛋白、β-肌动蛋白、COX IV等的抗体进行检测[1]。
葡萄糖摄取：用1 μM芬苯达唑处理细胞4小时，然后用100 μM 2-NBDG孵育1小时，洗涤后测量荧光强度（激发/发射波长485/528 nm）[1]。乳酸和葡萄糖氧化测定：使用商业试剂盒（葡萄糖氧化酶/过氧化物酶和乳酸测定）检测培养上清液[1]。
己糖激酶活性：将细胞裂解液或纯化的酵母己糖激酶II与反应混合物（8.3 mM 甘氨酰甘氨酸、17 mM ATP、0.0011% 甲酚红、14 mM MgCl₂、27 mM 葡萄糖）孵育，测定A₅₆₀的减少量[1]。
线粒体分离和p53易位：细胞处理24小时后，使用商业试剂盒分离线粒体，并通过Western blot分析各组分[1]。
细胞测定（神经元）：将E15 CD-1小鼠胚胎的原代皮层神经元培养于含10% FBS/5%马血清的MEM培养基中。为了进行神经保护，将神经元与 HCA (5 mM) 和 芬苯达唑 (0.125‐2 μM) 共同处理 16 小时，通过 MTT 或活/死染色 (钙黄绿素 AM/乙锭同型二聚体‐1) 评估活力。对于紫杉醇预处理，在HCA和FZ处理前30分钟加入0.1 μM紫杉醇[2]。
HT22 HRE-Luc和ODD-Luc报告基因检测：将稳定转染HRE-荧光素酶或ODD-荧光素酶的HT22细胞用化合物处理4-24小时，裂解细胞，测定荧光素酶活性并以蛋白浓度进行标准化[2]。
免疫细胞化学（神经元）：用4%多聚甲醛固定细胞，用抗β-微管蛋白III抗体和二抗染色，并通过荧光显微镜观察[2]。
线粒体检测：通过Percoll密度梯度离心分离小鼠脑非突触线粒体。使用Oxytherm血氧仪测量呼吸作用（状态4和ADP存在下的状态3）。使用番红O荧光（激发/发射波长495/586 nm）测量膜电位。使用 Amplex Red (激发/发射 555/581 nm) 和 HRP 和 SOD 测量 ROS 发射 [2]。
延胡索酸酶活性：将线粒体裂解物与苹果酸 (0.05‐0.4 mM) 和不同浓度的苯并咪唑孵育，在 A₂₄₀ 处监测延胡索酸的产生 [2]。

动物/疾病模型： 雌性无胸腺裸鼠（nu/nu）异种移植A549细胞[1]：1 mg/只
给药途径： 口服；隔日一次，持续12天
实验结果： 导致肿瘤体积和重量显著减少。肿瘤内血红蛋白含量的降低意味着肿瘤血管供应的减少。

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动物实验方案（异种移植）：雌性无胸腺裸鼠（nu/nu）（6周龄）适应环境3天后，将5 × 10⁶个A549细胞溶于100 μl PBS中，皮下注射至右侧腹部。当肿瘤直径达到 2-3 mm（约 4 周）时，小鼠每隔一天经口灌胃给予溶于橄榄油的芬苯达唑（1 mg/只），持续 12 天。对照组小鼠仅灌胃橄榄油。使用数字游标卡尺测量肿瘤体积（体积 = 宽度² × 长度/2）。实验结束时，切除肿瘤，称重，并进行血红蛋白测定（分光光度法，A₅₉₀）、TUNEL 染色、p53 和 CD31 免疫组化染色。所有实验程序均已获得机构动物伦理委员会批准[1]。
动物实验方案（HIF报告基因）：ODD-Luc转基因小鼠（ADU FB.129S6-Gt(ROSA)26Sortm2(HIF1A/luc)Kael/J）每日一次灌胃给予甲苯咪唑（50 mg/kg）或载体（PBS：芝麻油 1:1），连续5天。末次给药6小时后，小鼠腹腔注射D-荧光素（75 mg/kg），并用异氟烷麻醉，然后使用IVIS-100系统进行生物发光成像。对头部区域（ROI）的荧光素酶信号进行定量分析。（本研究中未纳入芬苯达唑体内实验数据）[2]。

毒性/毒代动力学：体外实验表明，浓度≥2 μM的芬苯达唑对原代皮层神经元的基础存活率有逐渐降低的影响（MTT法）[2]。在癌细胞中，未提供更高浓度的详细数据。体内实验表明，裸鼠口服芬苯达唑（1 mg/只，隔日一次，连续12天）耐受性良好，未见明显的毒性反应。根据既往报道（参考文献见[1]），该药物在实验动物中具有较高的安全性和较低的毒性。但未提供LD₅₀、器官毒性或具体的毒代动力学数据[1][2]。

[1]. Fenbendazole acts as a moderate microtubule destabilizing agent and causes cancer cell death by modulating multiple cellular pathways. Sci Rep. 2018 Aug 9;8(1):11926.

[2]. Antihelminthic benzimidazoles are novel HIF activators that prevent oxidative neuronal death via binding to tubulin. Antioxid Redox Signal. 2015 Jan 10;22(2):121-34.

[3]. Fenbendazole as a potential anticancer drug. Anticancer Res. 2013 Feb;33(2):355-62.

芬苯达唑属于苯并咪唑类化合物，其结构为1H-苯并咪唑，2位和5位分别被（甲氧羰基）氨基和苯硫酰基取代。它是一种广谱驱虫药，尤其在兽医学中用于治疗线虫感染。芬苯达唑是一种抗线虫药物，属于苯并咪唑、氨基甲酸酯和芳基硫醚类化合物。它是一种具有广谱驱虫活性的苯并咪唑类化合物，可用于治疗多种胃肠道寄生虫感染，包括贾第鞭毛虫、蛔虫、钩虫、鞭虫、绦虫、蛲虫、肺圆线虫、肺吸虫病和粪类圆线虫感染。芬苯达唑获准在兽医指导下用于绵羊、牛、马、鱼、犬、猫、兔和海豹。
兽医学中使用的抗线虫苯并咪唑类药物。另见：杆菌肽亚甲基二水杨酸盐；芬苯达唑（成分）；芬苯达唑；伊维菌素；吡喹酮（成分）。

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适应症
用于治疗和控制猪的胃肠道线虫感染，包括：猪蛔虫（成虫、肠道和移行幼虫期）；线虫属（成虫期）；毛线虫属（成虫期）。用于治疗鸡的胃肠道线虫感染，包括：猪蛔虫（L5期和成虫期）；鸡异刺线虫（L5期和成虫期）；毛细线虫属。 （L5期和成虫期）。

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补充信息：芬苯达唑是一种苯并咪唑类驱虫药，用于兽医学。由于其能够干扰微管、激活p53并破坏葡萄糖代谢，因此已被重新开发为抗癌药物。与经典的微管毒素（例如秋水仙碱、长春花生物碱）不同，芬苯达唑仅引起轻微的微管解聚，且不影响乙酰化微管蛋白的水平。如维拉帕米罗丹明123积累试验所示[1]，它不是P-糖蛋白（P-gp）的底物或抑制剂。在神经元中，芬苯达唑通过与游离微管蛋白结合激活HIF-1α，从而导致p21上调并抵抗氧化应激。这种神经保护作用与线粒体抑制无关，并且会被紫杉醇（一种降低游离微管蛋白的药物）阻断[2]。该化合物已用于动物和人类的口服寄生虫感染治疗，其安全性支持进一步研究其在癌症和神经系统疾病方面的应用[1][2]。

299.072

43210-67-9

Fenbendazole-d3;1228182-47-5

3334

White to off-white solid powder

1.4±0.1 g/cm3

541.4±42.0 °C at 760 mmHg

233°C

281.2±27.9 °C

0.0±1.5 mmHg at 25°C

1.679

4.34

92.31

2

4

4

21

363

0

S(C1C([H])=C([H])C([H])=C([H])C=1[H])C1C([H])=C([H])C2=C(C=1[H])N([H])C(N([H])C(=O)OC([H])([H])[H])=N2

HDDSHPAODJUKPD-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C15H13N3O2S/c1-20-15(19)18-14-16-12-8-7-11(9-13(12)17-14)21-10-5-3-2-4-6-10/h2-9H,1H3,(H2,16,17,18,19)

methyl N-(6-phenylsulfanyl-1H-benzimidazol-2-yl)carbamate

Hoe881vHoe-881v Fenbendazole FenbendazolPanacurFenbendazoleamine Phenbendasol Safe-quard Hoe 881v

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~10 mg/mL (~33.41 mM)
H2O : ~1 mg/mL (~3.34 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 1 mg/mL (3.34 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 10.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 1 mg/mL (3.34 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 10.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。