Fenretinide (4-HPR)   中文名称: 维甲酰酚胺

Dihydroceramide desaturase (DES) – Fenretinide (4-HPR) inhibits DES activity in a dose- and time-dependent manner in CCRF-CEM leukemia cells. [1]

在多种T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）细胞系中，芬瑞替尼（4-HPR）表现出短期和长期的抗癌作用。在CCRF-CEM白血病细胞中，芬瑞替尼以剂量和时间依赖的方式抑制DES活性，并在此过程中增加内源性细胞内dhCer水平。在CCRF-CEM和Jurkat细胞中，芬瑞替尼（3 μM）可导致dhCer积累[1]。芬瑞替尼通过抑制神经酰胺来保护胰岛素信号通路。当芬瑞替尼存在时，脂质可防止胰岛素刺激的葡萄糖吸收减少[2]。浓度高于1 μM时，芬瑞替尼可降低OVCAR-5细胞的存活率和增殖能力；浓度为10 μM时，可抑制70-90%的细胞生长。预孵育三天后，芬瑞替尼（1 μM）可显著降低OVCAR-5细胞的侵袭能力。内皮细胞暴露于 1 µM 4-HPR 后，并未形成管状结构，而是形成了微小的细胞聚集体 [4]。在人 CCRF-CEM 和 Jurkat 急性淋巴细胞白血病细胞中，芬瑞替尼 (4-HPR) 以剂量和时间依赖的方式诱导细胞活力急性下降；在 3 µM 浓度下处理 48 小时后，CCRF-CEM 细胞的存活率下降至 15.3% ± 6.3，Jurkat 细胞的存活率下降至 21.1% ± 10.2，而 10 µM 浓度下细胞死亡几乎完全，这已通过 Annexin V-碘化丙啶染色证实。[1] 芬瑞替尼 (4-HPR) 在浓度低至 0.5 µM 时即可降低两种细胞系的克隆形成能力 (p>0.05)。 [1]芬瑞替尼（4-HPR）以剂量（p<0.01）和时间（p<0.05）依赖的方式抑制CCRF-CEM细胞中的二氢神经酰胺去饱和酶（DES）活性，导致内源性二氢神经酰胺（dhCer）含量相应增加；在浓度低至0.5 µM时，DES抑制作用在处理后的第一个小时内即可发生，并持续存在。[1]LC-MS分析显示，芬瑞替尼（4-HPR）在亚致死浓度和细胞毒性浓度下均可诱导CCRF-CEM和Jurkat细胞中二氢神经酰胺（而非神经酰胺）的积累；在CCRF-CEM细胞中，当浓度≥1 µM时，二氢鞘氨醇（dhSph）水平升高，鞘氨醇（Sph）在CCRF-CEM细胞中轻微积累，但内源性神经酰胺水平未见升高。[1]
用霉酚酸酯（SPT抑制剂）预孵育可阻断芬瑞替尼（4-HPR）诱导的dhCer积累，但不能阻止细胞活力下降或细胞内ROS生成增加；霉酚酸酯处理在1 µM或3 µM浓度下，16小时或24小时均不能阻止4-HPR介导的两种细胞系的细胞毒性（p>0.05）。[1]
抗坏血酸和维生素E显著降低了芬瑞替尼（4-HPR）（3 µM）触发的ROS生成（p<0.01），但只有抗坏血酸能完全抑制ROS生成；维生素E能持续保护细胞免受4-HPR介导的细胞死亡（通过XTT和Annexin V-PI染色），而抗坏血酸的保护作用仅持续24小时。[1]
抗氧化剂（抗坏血酸、维生素E、Trolox、Trolox-甲基醚）既不能阻断内源性dhCer的积累，也不能显著改变芬瑞替尼（4-HPR）处理后的神经酰胺水平。[1]
芬瑞替尼（4-HPR）在两种细胞系中均引起明显的剂量和时间依赖性脂质过氧化增加；抗坏血酸和维生素E均能在6小时内抑制4-HPR介导的脂质过氧化，但只有维生素E在暴露24小时后仍能缓冲脂质过氧化。 [1] NDGA（脂氧合酶抑制剂）而非黄芩苷，能有效阻断芬瑞替尼（4-HPR）（3 µM）在两种细胞系中诱导的总体氧化应激（CM-H2DCFDA氧化），并能保护细胞免受4-HPR诱导的24小时脂质过氧化，但不能阻止细胞死亡；NDGA几乎完全抑制了4-HPR触发的线粒体超氧化物生成，而维生素E则仅表现出部分抑制或无效作用。[1] 芬瑞替尼（4-HPR）降低了Jurkat细胞的克隆形成能力，但未观察到急性细胞毒性；在0.5 µM 4-HPR处理24-48小时后进行细胞周期分析，结果显示处理组和未处理组细胞之间无显著差异。 [1] 即使在没有二氢神经酰胺或活性氧（ROS）积累的情况下，芬瑞替尼（4-HPR）诱导的细胞死亡也可能发生。[1]

在喂食高脂饮食的雄性C57Bl/6小鼠中，芬瑞替尼（4-HPR）（10 mg/kg，腹腔注射）可选择性地抑制神经酰胺的积累。胰岛素和葡萄糖耐量试验表明，芬瑞替尼治疗可提高胰岛素敏感性和葡萄糖耐量[2]。在NOD/SCID小鼠中，芬瑞替尼联合酮康唑（25 mg/kg）可提高血浆中4-HPR的水平[3]。

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在处死前12小时，对喂食高脂饮食的小鼠进行单次腹腔注射芬瑞替尼（10 mg/kg），可使比目鱼肌中二氢神经酰胺的含量增加约6倍，肝脏中增加约2倍，并有神经酰胺含量略微下降的趋势（20-30%），但差异不显著。 [2]

慢性治疗：雄性 C57Bl/6 小鼠喂食高脂饮食 (HFD) 16 周，其中一半小鼠在最后 4 周于饮用水中添加芬瑞替尼 (10 μg/ml，含 0.5% 乙醇)。与单独喂食 HFD 的小鼠相比，芬瑞替尼治疗改善了葡萄糖耐量（腹腔注射葡萄糖耐量试验，1 g/kg）和胰岛素敏感性（胰岛素耐量试验，0.75 单位/kg）。HFD+FEN 小鼠的 HOMA-IR（由空腹血糖和胰岛素计算得出）显著降低。芬瑞替尼对小鼠体重无显著影响。[2]

对这些小鼠的比目鱼肌和肝脏进行脂质分析表明，芬瑞替尼使神经酰胺水平恢复正常（降低至与标准饮食对照组相似的水平），并逐步增加二氢神经酰胺的水平，与单独喂食 HFD 的小鼠相比。芬瑞替尼显著降低了肝脏甘油三酯（TAG）水平，并逆转了油红O染色评估的肝脂肪变性，但对肝脏二酰甘油（DAG）水平无影响。[2]

高脂饮食显著增加了肝脏中Des1的转录本和蛋白水平，肌肉中也有较小程度的增加。长期芬瑞替尼治疗降低了肝脏中Des1的表达（mRNA和蛋白），并显著降低了肌肉中Des1 mRNA的水平。[2]

使用合成的二氢神经酰胺类似物（D-赤式-C12-二氢神经酰胺；C12-dhCCPS）测定二氢神经酰胺去饱和酶 (DES) 活性。将细胞与该合成类似物孵育 1 小时，然后加入指定浓度的芬瑞替尼 (4-HPR)。暴露 1 小时或 6 小时后，收集细胞，并通过液相色谱-质谱联用 (LC/MS) 分析合成底物 (C12-dhCCPS) 及其去饱和产物 (C12-CCPS) 的水平。DES 活性估计为去饱和产物占细胞内总 C12-吡啶 (C12-PyrdhCer 加 C12-PyrCer) 的百分比。[1]

采用 XTT 法测定代谢活性（细胞活力）。将细胞以 750,000 个细胞/ml 的密度接种于 96 孔板中，每孔 100 µl。4 小时后，加入处理剂，使最终细胞密度达到 500,000 个细胞/ml，最终体积达到 150 µl/孔。在选定的处理时间结束前 4 小时加入 XTT 试剂混合物，并测量 490 nm 处的吸光度。对于霉酚酸酯或抗氧化剂的研究，将细胞接种于 60 mm 培养皿中，4 小时后加入霉酚酸酯或抗氧化剂，2 小时后加入芬瑞替尼 (4-HPR)，然后将细胞以四复孔接种于 96 孔板中。[1]
克隆形成能力测定：将细胞暴露于选定的芬瑞替尼 (4-HPR) 浓度下 16 小时（5×10^6 个细胞/样品）。将6孔板用2 ml/孔预热的1.2%甲基纤维素培养基覆盖，并在其上覆盖一层含有50,000个细胞的0.6%甲基纤维素培养基。将培养板置于37°C、5% CO2的加湿培养箱中培养7-9天，直至出现明显的克隆形成。使用倒置显微镜计数每个孔中3个随机区域的克隆（>50个细胞）来确定克隆形成能力。[1]
根据制造商的RAPID方案，采用Annexin V-碘化丙啶染色法检测细胞凋亡。每个样本取10,000个细胞进行流式细胞术分析。细胞分为：健康细胞（PI-和FITC-）、早期凋亡细胞（PI-和FITC+）以及晚期凋亡/坏死细胞（PI+和FITC+）。使用WinMDI 2.8和Summit v4.3软件分析结果。 [1]
使用 CM-H2DCFDA 检测一般氧化应激。将细胞接种于不含红酚的 RPMI1640 完全培养基中（每组处理 5×10⁶ 个细胞）。处理后，将约 2×10⁶ 个细胞重悬于含 10 µM CM-H2DCFDA 的 PBS 缓冲液中，并在 37°C 避光孵育 25 分钟。使用酶标仪或流式细胞仪测量荧光强度。以不含探针的细胞作为阴性对照，新鲜配制的 H₂O₂（200 µM，15 分钟）作为阳性对照。[1]
通过 MitoSOX 氧化评估线粒体超氧化物生成。处理后，将约 2×10⁶ 个细胞重悬于含 5 µM MitoSOX 的 Hank's 缓冲盐溶液中，并在 37°C 避光孵育 15 分钟。样品用PBS缓冲液洗涤后，使用酶标仪或流式细胞仪测量荧光强度。[1]
细胞内脂质过氧化采用BODIPY 581/591 C11（十一烷酸）进行检测。细胞在37℃避光条件下与10 µM BODIPY孵育3小时，以确保其充分内化。根据暴露时间，在探针处理之前或之后进行后续处理。测量荧光前，用1 ml PBS缓冲液/样品替换培养基。每个样品使用10,000个细胞进行脂质过氧化的流式细胞术分析。[1]
内源性鞘脂种类采用LC/MS进行分析。处理后，细胞用PBS缓冲液洗涤两次，以避免外部鞘脂污染。总值通过改进的Bligh和Dyer脂质提取法，以无机磷酸盐进行标准化。 [1]
细胞周期分析采用碘化丙啶标记法，在用芬瑞替尼（4-HPR）（0.5 µM）处理 24-48 小时后进行。[1]

雄性C57Bl/6小鼠（6周龄）喂食标准饲料或高脂饲料（D12492），持续长达16周。对于急性单次注射，小鼠腹腔注射溶于DMSO并重悬于温热PBS中的芬瑞替尼（10 mg/kg）；注射后12小时处死小鼠。收集比目鱼肌和肝脏进行脂质分析。[2]

对于慢性干预，喂食高脂饲料的小鼠（5至17周龄）在饮用水中添加芬瑞替尼（10 μg/ml），持续4周。芬瑞替尼首先溶于100%乙醇，然后用水稀释至最终浓度（0.5%乙醇）。水在弱光条件下配制，并置于避光瓶中，每1-2天更换一次。对照组饮用水含有等量的乙醇（0.5%）。经过4周治疗后，小鼠接受腹腔葡萄糖耐量试验（禁食6小时后腹腔注射1 g/kg葡萄糖）和胰岛素耐量试验（禁食6小时后腹腔注射0.75单位/kg胰岛素）。使用血糖仪测量血糖；使用ELISA法测定胰岛素水平。HOMA-IR值由空腹血糖和胰岛素计算得出。处死小鼠后，收集比目鱼肌和肝脏，用于脂质提取（LC-MS/MS）、组织学分析（冷冻肝切片油红O染色）、定量实时PCR（TRIzol提取，oligo(dT)引物cDNA合成，SYBR Green PCR，以β-actin为内参进行标准化）和Western blot分析（SDS-PAGE电泳分离组织提取物，转移至硝酸纤维素膜，用Des1抗体进行免疫印迹，红外成像检测）。[2]

代谢/代谢物
芬利替尼的已知代谢物包括(2S,3S,4S,5R)-6-[4-[[(2E,4E,6E,8E)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基环己烯-1-基)壬-2,4,6,8-四烯酰基]氨基]苯氧基]-3,4,5-三羟基氧杂环己烷-2-羧酸。

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与其他维甲酸类药物相比，芬瑞替尼（4-HPR）表现出良好的全身毒性特征，这为继续开展体内研究和进一步应用于临床试验提供了可能。[1]

[1]. Dihydroceramide accumulation and reactive oxygen species are distinct and nonessential events in 4-HPR-mediated leukemia cell death. Biochemistry and Cell Biology (2012), 90(2), 209-223.

[2]. Fenretinide Prevents Lipid-induced Insulin Resistance by Blocking Ceramide Biosynthesis. Journal of Biological Chemistry (2012), 287(21), 17426-17437.

[3]. Fenretinide metabolism in humans and mice: utilizing pharmacological modulation of its metabolic pathway to increase systemic exposure. Br J Pharmacol. 2011 Jul;163(6):1263-75.

[4]. Action of fenretinide (4-HPR) on ovarian cancer and endothelial cells. Anticancer Res. 2005 Jan-Feb;25(1A):249-53.

4-羟基苯基视黄酰胺是一种类视黄醇，由全反式视黄酸的羧基与4-羟基苯胺的苯胺基缩合而成。它是一种合成的类视黄醇激动剂，具有抗增殖、抗氧化和抗癌活性，且体内半衰期较长。其凋亡机制似乎与“经典”类视黄醇不同。它具有抗肿瘤和抗氧化作用。它是一种类视黄醇和单羧酸酰胺，在功能上与全反式视黄酸相关。作为一种合成类视黄醇，它可以口服用于预防前列腺癌和预防高危女性的对侧乳腺癌。它还具有抗肿瘤活性。芬替尼是一种口服有效的合成苯基视黄酰胺类视黄醇（维生素A）类似物，具有潜在的抗肿瘤和化学预防活性。芬特尼布可与维甲酸受体 (RAR) 结合并激活它们，从而诱导某些肿瘤细胞类型的分化和凋亡。该药物还可以通过调节血管生成相关生长因子及其受体来抑制肿瘤生长，并表现出不依赖于维甲酸受体的凋亡特性。(NCI04)
一种合成维甲酸，口服用于预防前列腺癌，也可用于预防高危女性的对侧乳腺癌。它也是一种有效的抗肿瘤药物。
药物适应症

已研究用于治疗黄斑变性。
作用机制

芬利替尼通过维甲酸受体依赖性和非维甲酸依赖性机制抑制多种人类癌细胞系的生长。¹体内实验表明，芬利替尼选择性地在乳腺组织中蓄积，尤其能有效抑制大鼠乳腺癌的发生发展。¹芬利替尼的一个重要特征是，它通过诱导细胞凋亡而非分化来抑制细胞生长，这与维生素A的作用机制截然不同。¹与仅抑制雌激素受体（ER）阳性肿瘤的他莫昔芬不同，芬利替尼可以诱导ER阳性和ER阴性乳腺癌细胞的凋亡。 2. 所有这些特性使芬瑞替尼成为治疗乳腺癌的理想候选药物。化学预防。芬瑞替尼（4-HPR）正在进行体外和体内试验，以及临床试验，以测试其对多种癌症的疗效，包括神经母细胞瘤、乳腺癌和膀胱癌。[1]芬瑞替尼（4-HPR）主要通过诱导细胞死亡而非分化来发挥其抑制细胞生长的作用，这与维生素A和全反式维甲酸（ATRA）不同。[1]芬瑞替尼（4-HPR）可用于治疗维甲酸耐药性癌症。 [1]在T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）细胞系（CCRF-CEM、Jurkat）中，芬瑞替尼（4-HPR）可诱导内源性线粒体凋亡，其特征是活性氧（ROS）早期升高和鞘脂水平调节。[1]该研究表明，芬瑞替尼（4-HPR）治疗后的早期变化（鞘脂调节和ROS产生）是机制上独立的事件，即使在二氢神经酰胺或ROS积累缺失的情况下，细胞死亡也可能发生。[1]

C26H33NO2

391.5457

391.251

65646-68-6

5288209

Light yellow to yellow solid powder

1.1±0.1 g/cm3

597.6±42.0 °C at 760 mmHg

162-163°C

315.2±27.9 °C

0.0±1.8 mmHg at 25°C

1.607

7.41

49.33

2

2

6

29

726

0

CC1=C(C(CCC1)(C)C)/C=C/C(=C/C=C/C(=C/C(=O)NC2=CC=C(C=C2)O)/C)/C

AKJHMTWEGVYYSE-FXILSDISSA-N

InChI=1S/C26H33NO2/c1-19(11-16-24-21(3)10-7-17-26(24,4)5)8-6-9-20(2)18-25(29)27-22-12-14-23(28)15-13-22/h6,8-9,11-16,18,28H,7,10,17H2,1-5H3,(H,27,29)/b9-6+,16-11+,19-8+,20-18+

(2E,4E,6E,8E)-N-(4-hydroxyphenyl)-3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)nona-2,4,6,8-tetraenamide

4-HPR McNR-1967 McNR1967 McNR 1967 HPR Fenretinide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ≥ 130 mg/mL (~332.01 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.38 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.38 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.38 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。