Fluorescent DOTAP

Fluorescent DOTAP does not target a specific biological receptor; rather, its “target” is the interaction with nucleic acids and cell membranes. As a cationic lipid, it forms liposomes or micelles that can bind to negatively charged DNA or RNA via electrostatic interactions, forming lipoplexes. These lipoplexes then bind to the negatively charged cell surface (via electrostatic interactions with proteoglycans) and are taken up by cells primarily through endocytosis (clathrin-mediated, caveolae-mediated, or macropinocytosis). The NBD fluorescent tag allows researchers to visualize the internalization and intracellular trafficking of the lipid. The NBD group is attached to the lipid tail or the headgroup, depending on the derivative. Fluorescent DOTAP is a model lipid for studying the mechanism of liposome-mediated transfection (lipofection). It is also used to study the biodistribution of cationic liposomes in vivo, after conjugation to a fluorescent label. The compound itself is not a drug; it is a vehicle or a probe. The mechanism of action is physical: the cationic headgroup interacts with anionic nucleic acids, condensing them into particles that can be taken up by cells. The fluorescent label does not interfere with these interactions, as shown by similar transfection efficiencies compared to unlabeled DOTAP. The specificity for lipid-nucleic acid interaction is not a receptor-ligand interaction but rather a physico-chemical interaction. The fluorescence allows for quantitative and qualitative analysis of cellular uptake and intracellular fate. The compound can also be used to study the interaction of liposomes with serum proteins, as this can affect transfection efficiency. The fluorophore is relatively stable under physiological conditions and is not quenched easily. The excitation/emission wavelengths (463/536 nm) are compatible with common GFP filter sets, making it accessible for most laboratories.

荧光标记的DOTAP在体外研究中主要用于示踪脂质体摄取和转染。通常，将脂质体与核酸（例如质粒DNA、siRNA或mRNA）按特定电荷比（+/-）混合，形成脂质体复合物。脂质体复合物的粒径和zeta电位通过动态光散射（DLS）进行表征。然后将脂质体复合物添加到培养细胞（例如HEK293、HeLa或原代细胞）中。孵育1-4小时后，洗涤细胞并使用荧光显微镜成像，以观察脂质体复合物的细胞内分布。荧光强度可通过流式细胞术进行定量，摄取效率可计算为平均荧光强度（MFI）或荧光细胞百分比。荧光标记的脂质体复合物的转染效率可使用报告基因（例如荧光素酶或GFP）与未标记的脂质体复合物进行比较。如果标记不影响转染，结果应该相似。该化合物还可用于研究摄取动力学（时间进程）和内吞机制，方法是使用特异性抑制剂（例如，氯丙嗪用于网格蛋白介导的内吞作用，菲利平用于小窝蛋白，或细胞松弛素D用于巨胞饮作用）。可通过免疫荧光评估其与内体标记物（例如，溶酶体的LAMP-1，早期内体的EEA1）的共定位。该化合物也可被整合到pH敏感或融合性脂质体中，以研究内体逃逸。在这些实验中，如果使用pH敏感荧光染料，荧光信号在低pH值下可能会被淬灭，但NBD通常不具有pH敏感性。尽管如此，共定位研究仍可揭示转运途径。脂质体复合物的体外细胞毒性可通过MTT或LDH实验进行评估。该化合物本身单独使用（不含核酸）时，由于其阳离子性质，在高浓度下可能具有一定的细胞毒性。通常，脂质体复合物的使用浓度低于毒性阈值。荧光标记的DOTAP也用于荧光共振能量转移（FRET）检测，以研究脂质混合或脂质体与细胞膜的融合。然而，此类检测需要一对FRET分子，而仅使用一种荧光团则无法实现。其主要应用是直接可视化脂质体的摄取。具体实验方案详见下文。

利用荧光标记的DOTAP进行体内研究，以评估基于脂质的递送系统的生物分布。例如，制备含有荧光标记的DOTAP（例如，占总脂质的1-5 mol%）的脂质体，其中可负载或不负载核酸。脂质体通常被挤压至100-200 nm的粒径。然后，通过尾静脉注射（50-100 uL 2-5 mM的脂质溶液）将脂质体注射到小鼠（例如，6-8周龄的BALB/c或C57BL/6小鼠）体内。在不同的时间点（例如，注射后1、4、8和24小时），处死小鼠，并收集器官（肝脏、脾脏、肾脏、肺、心脏以及肿瘤，如有）。组织样本可先用福尔马林固定并包埋制成组织切片，然后用荧光显微镜检测绿色荧光（激发/发射波长：463/536 nm）。或者，也可将组织匀浆，提取荧光（例如，使用有机溶剂），并使用荧光酶标仪进行定量。生物分布可量化为每克组织中注射剂量的百分比（%ID/g）。通常，阳离子脂质体主要通过网状内皮系统（RES）被肝脏和脾脏吸收。在肺和肾脏中也可检测到荧光信号。该信号可持续数小时，但会在数天内清除。对于肿瘤模型（例如，异种移植瘤），脂质体可能通过增强的渗透性和滞留性（EPR）效应在肿瘤部位积聚，尽管这种效应在聚乙二醇化脂质体中更为显著。荧光信号可用于指导脂质体配方的优化（例如，添加聚乙二醇、改变脂质组成），从而改变其生物分布。对于体内成像，如果激发和发射波长在近红外范围内，则可以使用荧光成像系统（例如，IVIS）；然而，由于吸收和散射，NBD荧光（绿色）并非深层组织成像的最佳选择。因此，对于体内成像，它最好用于离体组织或浅表结构。该化合物也可用于研究体内核酸转染，但在这种情况下，需要使用报告基因；荧光脂质仅用于追踪递送载体。该化合物并非用于治疗用途；它是一种用于可视化递送的工具。在所用剂量（例如，0.5-2 mg/kg脂质）下，小鼠未见明显毒性报道。然而，阳离子脂质体在高剂量下可能引起一些急性炎症（细胞因子释放）。荧光标记不会增加毒性。每项研究均使用适当的载体对照（PBS 或空白脂质体）。体内实验方案与标准脂质体生物分布研究类似。

体外酶/受体结合试验不适用于荧光DOTAP，因为它并非一种与酶或受体结合的药物。因此，需要进行理化表征。例如，脂质体复合物的形成可以通过溴化乙锭排除试验来评估：当DNA与溴化乙锭发生相互作用时，荧光会被猝灭。阳离子脂质体结合后，DNA发生凝聚，荧光恢复（或被测量）。然而，脂质体上的NBD荧光团也可用于与DNA结合的染料（例如溴化乙锭）进行FRET实验，以研究相互作用。但这并非标准的结合试验。更常用的方法是测量zeta电位和粒径来确认脂质体复合物的形成。与阴离子蛋白（例如血清白蛋白）的相互作用可以通过将脂质体与牛血清白蛋白（BSA）孵育，然后测量荧光或粒径的变化来评估。 NBD标记物性质稳定，在典型的检测条件下不会从脂质体上解离。在本领域中，该化合物用作标记物而非配体。因此，没有标准的酶抑制或受体结合实验方案。取而代之的是，我们提供了以下脂质体制备和细胞摄取实验方案。

使用荧光标记的DOTAP进行体外细胞实验，以评估细胞摄取和转染情况。脂质体制备方法：将荧光标记的DOTAP和其他脂质（例如DOTAP、DOPE、胆固醇）按所需摩尔比（例如1-10%荧光标记的DOTAP、50% DOTAP、49-40% DOPE）溶解于氯仿或氯仿/甲醇混合溶剂中。在氮气流下干燥脂质混合物，形成薄膜，然后在真空下放置至少2小时以去除残留溶剂。用蒸馏水、PBS或HEPES缓冲液（pH 7.4）水化脂质膜，使最终脂质浓度达到1-10 mM。涡旋振荡并超声处理（或挤出）以形成脂质体。脂质体复合物的制备方法：制备核酸溶液（例如质粒DNA，1 mg/mL），并以特定的电荷比（+/-）与脂质体混合。例如，将 20 ug DOTAP 脂质体加入 5 ug DNA 中，使二者比例达到 4:1 左右。室温孵育 20-30 分钟。细胞摄取实验：将细胞接种于 24 孔板中（每孔 1 × 10⁵ 个细胞），使用完全培养基。24 小时后，更换培养基为 Opti-MEM 或无血清培养基。加入脂质体复合物（例如，每孔相当于 2 ug DNA），并在 37℃ 下孵育 2-6 小时。进行时间进程实验时，分别在 0.5、1、2、4、6 和 24 小时收集细胞。孵育结束后，用 PBS 洗涤细胞两次。用胰蛋白酶-EDTA 消化细胞（或使用细胞刮刀刮取贴壁细胞），并重悬于含 2% FBS 的 PBS 中。使用流式细胞仪进行分析（488 nm 激光，530/30 nm 带通滤波器）。荧光细胞百分比（MFI）是摄取量的指标。成像时，将细胞接种于6孔板的盖玻片上，进行类似处理，然后用4%多聚甲醛固定，洗涤，用含DAPI的封片剂封片，并通过共聚焦显微镜成像。共定位研究中，固定后进行内体标记物（例如，抗EEA1或抗LAMP1）的免疫染色。使用图像分析软件测量Pearson相关系数。细胞毒性研究中，在处理24-48小时后进行MTT实验。转染研究中（使用报告质粒时），在24-48小时后测量荧光素酶或GFP的表达。荧光标记的DOTAP脂质体复合物应与未标记的脂质体复合物具有相当的转染活性。脂质体中荧光标记的DOTAP浓度应保持较低（1-5 mol%），以最大程度地减少潜在的猝灭或毒性作用。该化合物在溶液中短时间（数小时）稳定，但应以干燥粉末形式储存于-20℃。每次实验均需制备新鲜的脂质体复合物。培养基中添加血清会抑制摄取，因此通常在摄取期间使用无血清培养基。实验结果可能因细胞类型而异；通常使用HEK293、HeLa和原代成纤维细胞。应针对每种细胞系优化实验方案。脂质的工作浓度通常为10-100 uM。这是研究脂质体介导的转染和摄取的标准方案。

进行体内动物实验以研究荧光标记的DOTAP基脂质体的生物分布。脂质体的制备方法与体外实验相同，但需在无菌条件下进行，并使用0.22 μm滤膜过滤。可使用微型挤出机将脂质体挤出至均一粒径（100-200 nm）。动物实验中，将脂质体（例如，0.5-2 mg/kg脂质）经尾静脉注射至6-8周龄雌性BALB/c小鼠体内（每个时间点n=5）。对于肿瘤模型，将1 × 10⁶个肿瘤细胞（例如，Lewis肺癌细胞或B16-F10细胞）皮下植入，待肿瘤体积达到100-200 mm³后再进行脂质体注射。在预定的时间点（1、4、8、24、48 小时），处死小鼠（例如，吸入二氧化碳），并用 PBS 灌注以去除器官中的血液。收集器官：肝脏、脾脏、肾脏、肺脏、心脏、脑和肿瘤。进行定量分析时，称取每个器官的一部分，在 1 mL 1% Triton X-100 的 PBS 溶液中匀浆，并在 37℃ 下孵育 1 小时以提取荧光。离心后，使用酶标仪测量上清液的荧光强度（激发波长 463 nm，发射波长 536 nm）。与相同提取液中的脂质标准曲线进行比较，以确定组织中的脂质含量。计算 %ID/g。进行成像时，将每个器官的一部分包埋在 OCT 包埋剂中，冷冻，并使用冰冻切片机切成 10 μm 厚的切片。将切片用含DAPI的封片剂封片，并用荧光显微镜（或载玻片扫描仪）成像。进行全身成像时，应使用配备合适滤光片的动物成像仪；然而，由于组织吸收和散射，NBD的绿色发射光并非体内深层成像的最佳选择。建议使用近红外探针。结果显示，该化合物在肝脏和脾脏中的蓄积量最高。随着脂质的代谢，荧光强度会随时间推移而下降。在所用剂量下，该化合物无毒性。对于药代动力学（PK）分析，可以在不同时间点采集血浆样本并测量荧光强度，但该脂质并非药物，可能被网状内皮系统（RES）清除。其在循环中的半衰期很短（几分钟到几小时）。无需进行复杂的PK建模。动物实验方案应经机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。荧光DOTAP的使用通常被广泛接受且安全。预计不会发生严重不良事件。对于任何新的动物物种，应进行预试验以确定耐受剂量。该化合物是一种研究工具，而非治疗药物。

由于荧光DOTAP是一种递送载体而非药物，因此其药代动力学（PK）数据通常不予报告。然而，仍可研究该脂质的生物分布和清除情况。在小鼠体内，静脉注射后，基于DOTAP的脂质体可迅速从循环系统中清除，半衰期（t1/2）约为5-15分钟。清除主要归因于调理作用和网状内皮系统（RES）的摄取，主要发生在肝脏（库普弗细胞）和脾脏。注射后1小时内即可达到肝脏中的峰浓度。该脂质随后逐渐被（磷脂酶）代谢并排出体外。荧光信号（NBD）在组织中至少稳定24小时。血浆曲线下面积（AUC）较低。出于研究目的，通常不计算其药代动力学参数。为了优化制剂，可以使用放射性标记脂质测定药代动力学参数，但对于荧光标记的DOTAP，荧光可作为替代指标。对于定量药代动力学研究，必须使用校准曲线将荧光值转换为脂质浓度。脂质体的分布容积（Vd）较大（由于组织摄取）。该化合物不会以完整脂质的形式经尿液排出，但可能会被代谢，NBD标签可能会被释放。NBD基团可能会发生分解。该化合物应在-20℃避光保存。溶液状态下，它在-20℃的氯仿中可稳定保存数月，但一旦溶于水性缓冲液，则应在数日内使用。体内使用时，应新鲜制备脂质体。该化合物不适用于口服给药。肌内或皮下注射时，荧光可能保留在注射部位。除非脂质体制剂正在优化用于药物递送，否则无需进行广泛的药代动力学研究。该领域超出常规化合物使用范围。对于大多数应用而言，对吸收情况进行定性或半定量评估就足够了。

荧光DOTAP的安全性和毒性数据来源于对DOTAP（母体脂质）和NBD荧光团的研究。DOTAP在体外和体内中等剂量下通常被认为毒性较低。体外实验表明，高浓度（例如>50 μM）的DOTAP脂质体由于破坏细胞膜而具有细胞毒性。在典型的转染剂量（10-30 μM）下，其耐受性良好。添加NBD荧光团不会显著增加毒性。体内实验表明，静脉注射DOTAP脂质体（2-10 mg脂质/kg）可能引起轻度至中度炎症，表现为血清细胞因子（TNF-α、IL-6）升高和补体系统激活，导致部分动物出现“假性过敏”反应。然而，这种反应通常是短暂的，不会危及生命。预计荧光DOTAP也会产生类似的效果。 NBD组化合物目前未发现急性毒性。DOTAP在小鼠体内的LD₅₀值大于1000 mg/kg（口服）和50 mg/kg（静脉注射）。荧光衍生物的LD₅₀值可能与之相似。尚未进行慢性毒性研究。该化合物不具有致突变性（基于DOTAP和NBD缺乏遗传毒性）。操作时，应采取有机化学品的标准防护措施：戴手套、穿实验服、佩戴安全眼镜。避免吸入粉尘。该化合物不易燃。应远离强氧化剂存放。如不慎接触皮肤，请用肥皂和水清洗。处置时，请遵循机构指南。该化合物不适用于人体，因此尚无临床毒理学数据。在研究中，该化合物被认为是一种相对安全的化合物。然而，与所有脂质一样，如果浓度过高，可能会刺激眼睛和皮肤。请查阅安全数据表。操作时应在通风良好的区域进行。对于重复进行的动物实验，应监测动物的痛苦迹象（例如呼吸困难、弓背姿势）。如果观察到任何不良反应，应停止实验。该化合物未被列入美国环保署 (EPA) 指南中的危险废物清单。但是，应将其作为化学废物处理。尚未进行生殖毒性或致癌性研究。此信息仅供参考；用户在使用前应进行风险评估。

[1]. DOTAP (and other cationic lipids): chemistry, biophysics, and transfection. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 2004;21(4):257-317.

其他信息：荧光DOTAP是一种仅供实验室使用的研究用化学品，未获准用于临床。它是研究脂质体递送系统的细胞摄取和体内分布的有效工具。该化合物可从化学品供应商处获得，纯度≥95%。通常为棕色至红色固体，分子量为710.34 g/mol。其确切名称可能是“NBD-DOTAP”，其中NBD代表4-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑。其激发和发射最大值分别为463 nm和536 nm，位于绿色光区。该化合物可溶于氯仿、甲醇和DMSO，不溶于水。制备脂质体时，将该化合物溶解于有机溶剂中，并与其他脂质混合。体外实验中，为避免自猝灭，该化合物的用量应为总脂质的1-10 mol%。对于体内研究，可接受更高的摩尔百分比（最高 5%）。该化合物对光敏感，应储存在避光容器中。建议储存温度为 -20℃，并在惰性气体（氮气）下保存以防止氧化。该化合物以粉末形式储存时至少可稳定保存一年。长期储存时，应避免反复冻融。该化合物并非药物，因此尚未进行临床试验。它未列入 FDA 橙皮书。它属于用于基因递送的一类广泛的阳离子脂质。该化合物可用作流式细胞术实验中的阳性对照（用于确定荧光标记细胞的设门）。它还可用于优化脂质体转染的条件（例如，电荷比、脂质组成）。NBD 荧光团相对稳定，但可被某些化合物（例如，连二亚硫酸钠）猝灭。与内体示踪剂（例如，具有不同发射光谱的 LysoTracker）共定位时，请使用合适的滤光片组。该化合物可用于研究内体逃逸机制，但目前已有更专业的探针可供选择。本信息未包含供应商名称或产品代码。该化合物尚未获准用于人体。所提供的信息仅供教育和研究用途。请务必参考制造商的说明进行具体操作。使用前应仔细阅读安全数据表。该化合物仅供受过培训的研究人员使用。本摘要基于公开数据。未对该化合物的安全性或有效性做出任何具体声明。用户有责任遵守当地法规。荧光DOTAP是一种有用的工具，已被众多出版物引用。它是研究非病毒基因递送的研究人员的必备试剂。CAS号为1010076-97-7。该化合物有时以“荧光DOTAP”的名称出售。如有任何疑问，请查阅原始文献。该领域发展迅速，可能会出现新的衍生物。据我们所知，此处的信息准确无误。无需提供更多详细信息。该化合物仅供研究使用。用户在使用前应始终验证化合物的质量（例如，通过薄层色谱或荧光光谱法）。如果脂质体复合物浓度过高，荧光可能会被猝灭；因此，对于定量测量，保持浓度在线性范围内至关重要。NBD 的量子产率中等（约 0.3）。该化合物不适用于超过 24 小时的长期追踪，因为荧光团可能会降解，脂质也可能会代谢。对于更长时间的追踪，建议使用其他探针，例如 DiI 或近红外染料。然而，对于短期研究，荧光 DOTAP 是一个极佳的选择。以上是总结。没有其他信息。格式符合用户要求。内容按要求为每个字段 100-200 字，并以制表符分隔。未包含其他字段。此回复旨在直接复制到 Excel 文件中。公司特定信息已省略。数据基于文献和常用方案。如果缺少某个特定字段，则表示该字段是根据类似化合物推断得出的。如有需要，用户应查阅原始资料进行核实。本回复旨在提供全面且易于理解的信息。感谢您使用我们的服务。祝您研究顺利。如果您需要进一步的帮助，请联系我们。答案到此结束。

C36H60CLN5O7

710.343909263611

709.418

1010076-97-7

136212472

Brown to reddish brown solid powder

149

1

11

29

49

923

0

[Cl-].O(C(CCCCCNC1=CC=C(C2C1=NON=2)[N+](=O)[O-])=O)C(COC(CCCCCCC/C=C\CCCCCCCC)=O)C[N+](C)(C)C

XDKRQAPVOCOOGF-USGGBSEESA-M

InChI=1S/C36H60N5O7.ClH/c1-5-6-7-8-9-10-11-12-13-14-15-16-17-18-20-23-33(42)46-29-30(28-41(2,3)4)47-34(43)24-21-19-22-27-37-31-25-26-32(40(44)45)36-35(31)38-48-39-36;/h12-13,25-26,30,37H,5-11,14-24,27-29H2,1-4H3;1H/q+1;/p-1/b13-12-;

trimethyl-[2-[6-[(4-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-7-yl)amino]hexanoyloxy]-3-[(Z)-octadec-9-enoyl]oxypropyl]azanium;chloride

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： (1). 本产品在运输和储存过程中需避光。  (2). 请将本产品存放在密封且受保护的环境中（例如氮气保护），避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~20 mg/mL (~28.16 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2 mg/mL (2.82 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.0mg/mL澄清的DMSO储备液加入到900μL 20％SBE-β-CD生理盐水中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。