Ganoderic acid D   中文名称: 灵芝酸D

Target: SIRT3 (mitochondrial deacetylase) – no IC50/Ki/EC50/DC50 values reported. [1]
Cyclophilin D (CypD) – acetylated CypD is deacetylated via SIRT3. [1]
14-3-3 protein family (six isoforms: ζ/δ, β/α, θ, σ, γ, ε) – predicted to bind Ganoderic acid D; confirmed for 14-3-3 ζ with equilibrium dissociation constant (K_D) = (4.04 ± 0.32) × 10⁻⁶ M (from SPR analysis). [2]
Annexin A5 – predicted direct binding (ligand-protein interaction energy: -39.2). [2]
Aminopeptidase B – predicted direct binding (interaction energy: -49.3). [2]

灵芝酸D可抑制多种癌细胞系的生长，其对人宫颈癌细胞HeLa的IC50值为17.3 mM[2]。灵芝酸D（1–50 μM；24-72小时）以剂量和时间依赖的方式降低细胞活力[2]。灵芝酸D（10、50 μM；24、48小时）可诱导G2/M期阻滞[2]。灵芝酸D（10、50 μM；24、48小时）可诱导HeLa细胞凋亡，并产生特征性的形态学改变[2]。10 μM；灵芝酸D处理48小时后可上调PRDX3和14-3-3E[2]。

---

灵芝酸D（处理24小时）以剂量依赖的方式（0、50、100、200 μmol/L）抑制HT29和SW620结肠癌细胞的葡萄糖摄取、乳酸生成、丙酮酸生成和乙酰辅酶A生成；在200 μmol/L浓度下观察到最显著的抑制效果。[1]
灵芝酸D不调节Glut1和HK1蛋白的表达，但以剂量依赖的方式上调HT29和SW620细胞中SIRT3蛋白的表达；在200 μmol/L浓度下处理24小时后，SIRT3的表达量比对照组增加了2.5倍。 [1]
PGC-shSIRT3质粒敲低SIRT3（转染效率约87%）逆转了灵芝酸D（200 μmol/L，24 h）对HT29和SW620细胞葡萄糖摄取、乳酸生成、丙酮酸和乙酰辅酶A的抑制作用。[1]
灵芝酸D（200 μmol/L，24 h）显著抑制了环孢菌素D（CypD）的乙酰化水平；SIRT3 shRNA逆转了这种抑制作用。共免疫沉淀实验表明，灵芝酸D诱导了SIRT3和CypD的结合，而PGC-shSIRT3阻断了这种结合。 [1] 灵芝酸D处理48小时后，HeLa人宫颈癌细胞的增殖受到抑制，IC₅₀值为17.3 ± 0.3 μM。[2] 流式细胞术分析显示，灵芝酸D（10和50 μM）可诱导HeLa细胞发生G2/M期阻滞和凋亡。10 μM GAD处理24小时后，G2/M期细胞比例从16.7%（对照组）增加至28.8%；凋亡率从0.7%（对照组）增加至7.9%。10 μM GAD处理48小时后，G2/M期细胞比例为0.30%（对照组为18.2%），凋亡率为17.7%（对照组为3.8%）。 [2]
通过DAPI染色，在用灵芝酸D（10和50 μM，处理48小时）处理的HeLa细胞中观察到典型的细胞凋亡形态学变化（核浓缩和碎裂）。[2]
在用50 μM灵芝酸D处理48小时的HeLa细胞中观察到DNA片段化（DNA梯状条带）。[2]
蛋白质组学分析（双向电泳和MALDI-TOF MS/MS）鉴定出HeLa细胞经10 μM灵芝酸D处理48小时后有21种差异表达蛋白：7种下调，14种上调。这些基因包括 eIF5A（下调）、14-3-3E（上调）、PRDX3（上调）、EB1（下调）、膜联蛋白 A5（上调）、亚精胺合酶（上调）、EphA7（上调）、细胞角蛋白 19（下调）等。蛋白质印迹实验证实了 eIF5A、14-3-3E、PRDX3 和 EB1 的变化。[2]

采用表面等离子共振 (SPR) 生物传感器分析法测定了灵芝酸 D 与 14-3-3 ζ 蛋白的结合亲和力。人重组 GST-14-3-3 ζ 和 GST（对照）通过标准伯胺偶联法，使用 N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和 N-羟基琥珀酰亚胺固定在传感器芯片上。将灵芝酸 D 在运行缓冲液（含 0.5% DMSO 的 HBS-EP）中进行系列稀释，浓度分别为 10、7、4.9、3.43、2.40 和 1.68 μM。样品以 30 μL/min 的流速注入 60 秒，并监测解离过程超过 120 秒。结合速率常数 (k_on) 为 (5.02 ± 0.24)×10³ M⁻¹ s⁻¹，解离速率常数 (k_off) 为 (2.03 ± 0.17)×10⁻² s⁻¹，平衡解离常数 (K_D) 为 (4.04 ± 0.32)×10⁻⁶ M。χ² 值为 0.32。同时测定了与 GST 的非特异性结合 (K_D = (8.06 ± 0.37)×10⁻⁶ M)。[2]

细胞活力测定[2]
细胞类型： HeLa 人宫颈癌细胞系 (CCL-2)
测试浓度： 1、5、10、20、50 μM
孵育时间： 24、48、72 小时
实验结果： 细胞存活率降低，呈剂量和时间依赖性，48 小时处理的 IC50 值为 17.3 μM。

---

细胞周期分析[2]
细胞类型：HeLa 人宫颈癌细胞系 (CCL-2)
测试浓度：10、50 μM
孵育时间：24、48 小时
实验结果：诱导 G2/M 期阻滞。经 10 μM 处理 24 小时后，细胞周期曲线显示 G2/M 期细胞比例增加。

---

细胞凋亡分析[2]
细胞类型：HeLa 人宫颈癌细胞系 (CCL-2)
测试浓度：10、50 μM
孵育时间：48 小时
实验结果：HeLa 细胞被诱导出现典型的凋亡形态学变化。

---

蛋白质印迹分析[2]
细胞类型：HeLa 人宫颈癌细胞系 (CCL-2)
测试浓度：10 μM
孵育时间：48 小时
实验结果：14-3-3E 和 PRDX3 表达上调。

---

为测定葡萄糖消耗和乳酸生成，将细胞用灵芝酸 D 处理 48 小时，然后收集培养基。使用 Amplex Red 葡萄糖/葡萄糖氧化酶测定法测定葡萄糖摄取，使用乳酸测定试剂盒测定乳酸生成。结果以细胞总蛋白进行标准化。[1]
为测定丙酮酸，收集用灵芝酸 D 处理的细胞，并将其溶解于丙酮酸测定缓冲液中。将 50 μL 样品与 50 μL 反应混合物混合，并在室温下孵育 30 分钟。在 570 nm 处测量吸光度，并根据标准曲线（每孔 10-0.1 mmol）计算丙酮酸浓度，然后以细胞蛋白进行标准化。[1] 对于乙酰辅酶 A 测定，收集用灵芝酸 D 处理的细胞，用 PBS 洗涤，并溶解于洗涤缓冲液中。加入冰冷的 3 M HClO₄，并在冰上孵育 30 分钟。离心后，用饱和 KHCO₃ 中和上清液，并再次离心。使用荧光测定法（激发/发射波长 = 535/589 nm）的乙酰辅酶 A 测定试剂盒定量乙酰辅酶 A 水平，并根据标准曲线计算浓度，以细胞总蛋白进行标准化。 [1]
对于蛋白质印迹实验，蛋白质经10% SDS-PAGE凝胶电泳分离后转移至PVDF膜。膜用5%脱脂奶粉的TBS/T缓冲液封闭，然后在4℃下与一抗（抗己糖激酶II、抗Glut1、抗SIRT3、抗乙酰化CypD、抗GAPDH）孵育过夜，随后在室温下与HRP标记的二抗孵育60分钟。使用ECL试剂检测信号。[1]
对于质粒转染，使用FuGENE HD试剂将PGC-shNegative和PGC-shSIRT3质粒转染至HT29和SW620细胞中。转染48小时后，细胞用于后续实验。[1]
对于免疫共沉淀实验，细胞用NP40缓冲液裂解。蛋白裂解液用琼脂糖珠预清除。每个免疫沉淀反应使用 600 μg 总蛋白和 4 μg SIRT3 抗体，4°C 旋转过夜，然后加入 30 μg 磁珠并继续旋转 2 小时。离心后，沉淀物用 NP40 缓冲液洗涤两次，复合物用 SDS 裂解缓冲液洗脱。[1]
对于细胞毒性试验 (MTT)，将 HeLa 细胞以 1×10³ 个细胞/孔的密度接种于 96 孔板中，并过夜培养。更换新鲜培养基，加入不同浓度的灵芝酸 D (1、5、10、20、50 μM)，分别培养 24、48 或 72 小时。然后加入 20 μL MTT 溶液 (5 mg/mL)，37°C 孵育 3 小时。最后加入 100 μL 裂解缓冲液，过夜孵育。在 570 nm 处测量光密度。采用 Logit 法计算 IC₅₀。[2]
对于细胞周期的流式细胞术分析，收集用灵芝酸 D（10 或 50 μM）处理的 HeLa 细胞，用 PBS 洗涤，在冰冷的 70% 乙醇中于 4°C 固定 2 小时，离心，并将细胞重悬于碘化丙啶染色缓冲液（0.1% Triton X-100、10 μg/mL RNase A、50 μg/mL 碘化丙啶，溶于 PBS）中，避光孵育 30 分钟。使用流式细胞仪进行分析。 [2]
对于核染色（细胞凋亡形态学），用灵芝酸D（10或50 μM，处理48小时）处理的HeLa细胞用PBS洗涤，室温下用4%多聚甲醛固定30分钟，用0.5 mg/mL DAPI PBS溶液染色10分钟，洗涤后在荧光显微镜下拍照。[2]
对于DNA片段化分析，使用DNAzol从用灵芝酸D（10或50 μM，处理48小时）处理的HeLa细胞中提取基因组DNA，上样至2%琼脂糖凝胶进行电泳，用溴化乙锭（0.5 mg/L）染色，并在紫外光下拍照。 [2]
对于双向电泳分析，HeLa 细胞用 10 μM 灵芝酸 D 或 0.1% DMSO（对照）处理 48 小时。细胞在含有 7 M 尿素、2 M 硫脲、2% CHAPS、1% DTT、0.8% Pharmalyte 和蛋白酶抑制剂的缓冲液中裂解。将 150 μg 蛋白质上样至 IPG 胶条（pH 4–7，17 cm）进行等电聚焦 (IEF)，然后平衡并在 12% SDS-PAGE 凝胶上进行分离。凝胶经银染、扫描后，使用 PDQuest 软件进行分析。切取倍数变化 ≥2 倍 (p<0.05) 的蛋白质斑点，并通过 MALDI-TOF MS/MS 进行鉴定。[2]

浓度为 200 μmol/L 的灵芝酸 D 处理 24 小时后，对 HT29 和 SW620 细胞活力的抑制率不超过 20%，表明其细胞毒性作用低于标准细胞毒性抗癌药物。[1]

[1]. Effect of ganoderic acid D on colon cancer Warburg effect: Role of SIRT3/cyclophilin D. Eur J Pharmacol. 2018 Apr 5;824:72-77.

[2]. Proteomics characterization of the cytotoxicity mechanism of ganoderic acid D and computer-automated estimation of the possible drug target network. Mol Cell Proteomics. 2008 May;7(5):949-61.

灵芝酸D是一种三萜类化合物。据报道，灵芝酸D存在于平盖灵芝（Ganoderma applanatum）中，相关数据可供参考。

---

灵芝酸D是一种高度氧化的四环三萜类化合物，来源于灵芝（Ganoderma lucidum）。灵芝是一种在中医中应用超过2000年的真菌，用于滋补强身、延年益寿。[2]
灵芝酸D抑制结肠癌细胞中的瓦博格效应（有氧糖酵解），瓦博格效应是癌症能量代谢重编程的标志。这种抑制作用是通过上调SIRT3并随后使环孢菌素D去乙酰化介导的。[1]
在HeLa宫颈癌细胞中，灵芝酸D诱导G2/M期细胞周期阻滞和细胞凋亡，这已通过流式细胞术和DNA片段化分析得到证实。 [2]蛋白质组学和反向对接分析表明，14-3-3蛋白家族的六种亚型可能是灵芝酸D的直接靶点，这些蛋白在细胞毒性机制中起着核心作用。[2]

C30H42O7

514.6503

514.293

108340-60-9

14109406

White to off-white solid powder

1.2±0.1 g/cm3

688.3±55.0 °C at 760 mmHg

218 - 220 °C

384.1±28.0 °C

0.0±4.9 mmHg at 25°C

1.559

2.43

125.81

2

7

6

37

1120

7

C[C@H](CC(=O)CC(C)C(=O)O)[C@H]1CC(=O)[C@@]2([C@@]1(CC(=O)C3=C2[C@H](C[C@@H]4[C@@]3(CCC(=O)C4(C)C)C)O)C)C

YTVGSCZIHGRVAV-IYAQLQCNSA-N

InChI=1S/C30H42O7/c1-15(10-17(31)11-16(2)26(36)37)18-12-23(35)30(7)25-19(32)13-21-27(3,4)22(34)8-9-28(21,5)24(25)20(33)14-29(18,30)6/h15-16,18-19,21,32H,8-14H2,1-7H3,(H,36,37)/t15-,16?,18-,19+,21+,28+,29-,30+/m1/s1

(6R)-6-[(5R,7S,10S,13R,14R,17R)-7-hydroxy-4,4,10,13,14-pentamethyl-3,11,15-trioxo-1,2,5,6,7,12,16,17-octahydrocyclopenta[a]phenanthren-17-yl]-2-methyl-4-oxoheptanoic acid

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~100 mg/mL (~194.31 mM)
H2O : < 0.1 mg/mL

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.86 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

---

配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.86 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

---

View More

配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.86 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

---

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。