Glycocholic acid   中文名称: 甘氨胆酸

Bile acid derivative; anticancer; Microbial Metabolite; Endogenous Metabolite

甘胆酸 (GC) 会加剧表阿霉素诱导的细胞死亡并增强表阿霉素的细胞毒性。它还大大增加Caco-2细胞中表阿霉素的细胞内积累和大鼠小肠中表阿霉素的吸收。甘胆酸和表柔比星显着降低人肠道 MDR1、MDR 相关蛋白（MRP）1 和 MRP2 mRNA 表达水平，同时下调 MDR1 启动子区，抑制 Bcl-2 mRNA 表达，诱导 Bax mRNA 表达，并显着降低 MDR1 启动子区的表达水平。增加 Bax 与 Bcl-2 的比率以及 p53、caspase-9 和 -3 的 mRNA 水平。甘胆酸和抗癌药物共同作用，通过与细胞凋亡、P-gp 和 MRP 调节以及其他过程相关的途径来调节 MDR [1]。

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癌细胞对化疗的耐药性限制了癌症治疗的疗效。多药耐药性（MDR）的主要机制是“泵”和“非泵”耐药性。我们评估了Glycocholic acid（GC）在抑制人结肠腺癌Caco-2细胞和大鼠肠道泵和非泵阻力以及增加表阿霉素化学敏感性方面的作用和机制。GC可增加表阿霉素的细胞毒性，显著增加表阿霉素在Caco-2细胞中的细胞内积累和表阿霉素在大鼠小肠中的吸收，并增强表阿霉素诱导的细胞凋亡。GC和表阿霉素显著降低了人肠道MDR1、MDR相关蛋白（MRP）1和MRP2的mRNA表达水平；下调MDR1启动子区；抑制Bcl-2的mRNA表达；诱导Bax mRNA表达；显著增加Bax-Bcl-2比值和p53、caspase-9和-3的mRNA水平。这表明GC和表阿霉素诱导的细胞凋亡是通过线粒体途径介导的。我们得出结论，同时抑制泵和非泵阻力会显著提高表阿霉素的化学敏感性。抗癌药物与GC的组合可以通过调节P-gp和MRPs以及调节凋亡相关途径的机制来控制MDR。[1]

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甘胆酸/GC和表阿霉素联合治疗显著增加了表阿霉素的细胞毒性[1]
我们使用MTT染料还原法来测定细胞生长抑制。图1A显示了在孵育0、24、48和72小时后，用0、100、250、300、400和500μM GC处理Caco-2细胞后的存活率测定结果。MTT法测定的GC对细胞存活率%的影响具有时间依赖性，72小时后效果最为显著。用250μM GC孵育72小时后，存活率为80±3%，而24小时和48小时后分别为96±4%和90±4%。我们将潜伏期定为72小时，这与Kosmider等人（2004）和Budman等人（2007）的研究一致。他们发现，生长抑制和凋亡诱导的最深远影响是在孵育72小时后。由于我们的目的是开发GC作为增强表阿霉素效力的佐剂，我们选择了250μM GC（ P-gp、MRP1、MRP2、Bcl-2、Bax和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的半定量RT-PCR[1]
为了分析甘胆酸GC和表阿霉素对泵和非泵阻力相关蛋白的影响，使用RT-PCR评估了MDR1、MRP1、MRP2、Bax、Bcl-2、caspase-3、caspase-8、caspase-9和p53的mRNA表达水平。GC和表阿霉素联合或单独使用72小时后，显著下调了MDR1、MRP1、MRP2和Bcl-2的相应mRNA水平（P<0.05）（图2A和B）。然而，72小时的相同处理显著上调了Bax、caspase-3、caspase-9和p53的相应mRNA水平（P<0.05）。与单独使用GC或表阿霉素治疗相比，GC和表阿霉素联合治疗导致MDR1、MRP1、MRP2和Bax表达的下调和上调显著增加（P<0.05）。GC和表阿霉素单独或联合使用显著增加了Bax-to-Bcl-2的比率（图2C），但对Caco-2细胞中caspase-8的表达没有显著影响（图2B）。GC联合表阿霉素对p53、caspase-9和caspase-3的mRNA水平没有比单独使用表阿霉素增加更多（P>0.05）。

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甘胆酸GC和表阿霉素联合治疗显著降低了hMDR1启动子区的萤光素酶活性[1]
为了研究GC和表阿霉素对hMDR1转录调控的潜在影响，将hMDR1启动子的159 bp（残基-120至+39）克隆到pGL3基本载体中萤火虫荧光素酶报告基因的上游。这159 bp的hMDR1 DNA元件由编码AP-1、CAAT、GC盒和Y-box的近端启动子区组成，这是hMDR1高效转录所必需的。为了正常化，共转染pRL-TK载体的Renilla萤光素酶报告基因。随后使用双荧光素酶测定系统测量hMDR1启动子-pGL3和pRL-TK载体的发光活性。然后比较GC、表阿霉素和GC联合表阿霉素对Caco-2细胞中159 bp元件的hMDR1调控启动子区活性的影响。 GC和GC与表阿霉素联合72小时显著抑制了hMDR1启动子活性（P<0.05；图3）。阳性对照利福平显著增加了萤光素酶活性（P<0.001），这表明利福平显著诱导了hMDR1启动子活性。GC联合表阿霉素对hMDR1启动子相关荧光素酶活性的抑制作用明显强于GC或表阿霉素单独使用（P<0.05）。在阴性对照实验中，hMDR1启动子缺陷型pGL3碱性萤光素酶报告载体的活性水平不受GC、表阿霉素或GC与表阿霉素联合使用的影响，这表明各个测试试剂与萤光素酶报道载体之间没有非特异性的直接相互作用。

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GC/甘胆酸显著增加了Caco-2细胞中表柔比星的细胞内积累[1]
我们使用流式细胞术来确定GC和表阿霉素联合治疗Caco-2细胞是否会增加表阿霉素的保留。此外，通过添加维拉帕米，验证了多药耐药相关蛋白（如P-gp）在表阿霉素外排中的功能参与。维拉帕米是一种钙通道阻滞剂，是典型的P-糖蛋白底物，也是研究最多的多药耐药性调节剂之一（Germann，1996，Lo和Huang，2000）。研究表明，维拉帕米与其他底物竞争结合P-糖蛋白，从而逆转多药耐药性（Gottesman和Pastan，1993）。用25μM Ver（Ver25）、250μM Ver250或250μM GC（GC250）预处理72小时，显著增加了Caco-2细胞在180分钟时表阿霉素的细胞内积累（P<0.05；图4）。GC 250对表阿霉素的保留率明显高于Ver25（P<0.05；图4）。但GC 250显示表阿霉素的保留率明显低于Ver250（P<0.05；图4）。这些结果表明，使用GC联合表阿霉素抑制P-gp和MRPs可能是Caco-2细胞内表阿霉素摄取增加的原因。

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甘胆酸/GC和表阿霉素联合治疗显著诱导染色质凝缩[1]
我们使用荧光显微镜和荧光DNA结合染料AO染色来评估GC和表阿霉素的细胞毒性作用是否与其对Caco-2细胞凋亡诱导的作用有关。活细胞有一个均匀的亮绿色细胞核（图5）。凋亡细胞在细胞核中显示出明亮的绿色区域，染色质浓缩或断裂。对照组未见明显形态学变化（图5A）。然而，暴露于GC、表阿霉素或GC与表阿霉素联合72小时的Caco-2细胞在细胞核中显示出浓缩的染色质和凋亡小体的出现（图5B-D，白色箭头）。根据图5B-D，发现与单独使用Epi或GC相比，暴露于GC联合Epi的细胞中观察到更多的亮点（两种情况下均P<0.05），这与我们的其他数据一致。

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甘胆酸/GC和表阿霉素联合治疗显著增加了亚G1期DNA含量的积累[1]
单独用GC、单独用表阿霉素或两者处理72小时的Caco-2细胞显示出典型的DNA含量模式，反映了细胞周期的亚G1期、G0/G1期、S期和G2/M期（图6）。Caco-2细胞亚G1期的百分比与凋亡细胞的比例相对应，在所有三种处理后显著增加。用GC加表阿霉素处理的细胞亚G1期的百分比（46.3%；P<0.001）明显高于单独用GC处理的百分比（26.8%）或单独用表阿霉素治疗的百分比（20.6%）。

甘胆酸/GC对大鼠外翻肠囊吸收表阿霉素的影响[1]
调节剂对MDR谱中药物肠道吸收的影响和机制可能因细胞类型、物种和外排转运蛋白底物的理化性质而异（Komarov等人，1996，Lo，2003）。尽管细胞系是在细胞水平上研究抗癌药物和MDR调节剂机制相互作用的有效方法，但使用其他系统（如离体外翻囊、原位灌注和体内实验）的研究对于评估表柔比星在有和没有Glycocholic acid/GC或维拉帕米尔的情况下的吸收/解吸机制是必要的。Caco-2细胞单层具有人类来源的优势，但该系统是静态的，与小肠相比，其运输速率非常低，细胞旁途径的增强程度过高（Barthe等人，1999）。离体外翻囊技术通过检测肠囊中的药物含量，提供了从粘膜侧到浆膜侧药物吸收机制的定量信息，而顶端细胞膜中的P-gp和MRPs可能通过从粘膜细胞中排出药物来限制生物利用度。该模型保持了组织活力，提供了可靠的数据，对于研究药物与转运蛋白的相互作用似乎特别有用，尽管它是一个封闭的系统（Barthe等人，1999，van de Kerkhof等人，2007）。使用改进的外翻囊的小亲水分子的渗透性值与人类的数据接近，而Caco-2细胞的值要低几个数量级（Barthe等人，1999）。原位大鼠肠道灌注是一种可靠的技术，可以结合肠道代谢来研究药物吸收潜力。然而，该系统耗时，因此不适合筛查目的（Bohets等人，2001）。它没有提供细胞水平的事件信息，麻醉和手术操作可能会减少吸收（Barthe等人，1999）。最后，动物体内吸收可以提供有价值的生物利用度数据；然而，它甚至更耗时、更费钱，因此不适合筛查（Barthe等人，1999，Bohets等人，2001）。因此，外翻囊系统是研究表阿霉素吸收的合适离体模型。 此外，已经报道了肠道组织中药物吸收的区域差异（Makhey等人，1998，Englund等人，2006）。因此，我们研究了GC或维拉帕米对包括空肠和回肠在内的不同肠段表阿霉素吸收的影响。表阿霉素在大鼠小肠的不同节段从粘膜侧运输到浆膜侧60分钟（图7A和B）。在用250μM GC或维拉帕米预处理的囊中测量的表阿霉素浓度在空肠和回肠中均显著高于对照组（P<0.01，每组n=3只大鼠）。回肠表阿霉素联合GC或维拉帕米的吸收明显高于空肠（P<0.05）。维拉帕米的增强作用高于GC（与Epi加GC相比P<0.05），这与细胞内积累研究一致。这意味着GC或维拉帕米对P-gp和/或MRPs表现出抑制作用，从而导致联合治疗中表阿霉素流出减少，表阿霉素吸收增加，或两者兼而有之。

细胞生长抑制试验[1]
使用MTT（3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基溴化四唑）测定细胞存活率。Caco-2细胞被胰蛋白酶消化，通过移液管分解，并用血细胞计数器计数。将细胞接种在96孔板中（104个细胞/孔），让其附着过夜，然后用不同浓度的表阿霉素（含或不含Glycocholic acid/GC）处理。孵育0、24、48或72小时后，向每个孔中加入20μl浓度为5mg/ml的MTT试剂，并将细胞再孵育4小时。然后小心去除每个孔的上清液，向每个孔中加入100μl二甲亚砜（DMSO）并充分混合。使用MRX微孔板阅读器在545nm处读取该板的光密度。将吸光度值（OD545）转换为96孔板中每个孔的细胞数。细胞存活率（%）是通过将用表阿霉素和GC孵育的细胞数量除以仅用组织培养基孵育的（对照）细胞数量来计算的。表阿霉素和表阿霉素与GC的组合的细胞生长抑制效力以IC50值表示，IC50值定义为抑制细胞生长50%所需的药物浓度。数据是四个实验的平均值±标准差（Pakunlu等人，2006）。

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P-gp、MRP1、MRP2、Bcl-2、Bax、胱天蛋白酶和p53的半定量RT-PCR[1]
Caco-2细胞用250μM的Glycocholic acid/GC（含或不含10μg/ml表阿霉素）预处理72小时。根据制造商的说明，使用试剂盒从细胞中分离RNA。使用分光光度分析评估RNA产量和纯度。用模板、dNTP、AMV逆转录酶、Tfl DNA聚合酶以及50μl总反应体积中MDR1、MRP1、MRP2、Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-8、caspase-9和p53的相应5′和3′引物（表1）对每个样品的总RNA（1μg）进行RT-PCR。表2给出了这些蛋白质的PCR周期。扩增后通过RT-PCR检测MDR1、MRP1、MRP2、Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-8、caspase-9和p53 mRNA的表达水平。使用2%琼脂糖凝胶电泳分析每种反应混合物的等分试样，并使用DNA凝胶染色对扩增的DNA进行可视化（Chearwae等人，2004）。使用凝胶文档系统和商业软件对凝胶进行数字拍摄和扫描。MDR1、MRP1、MRP2、Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-8、caspase-9和p53的基因表达计算为分析的RT-PCR产物的平均带密度与内标（GAPDH）的平均带强度之比。将用表阿霉素或GC或两者处理的不同mRNA的表达值与对照组（仅用培养基处理）的表达值进行比较。还将用表阿霉素联合GC处理的不同mRNA的表达值与用GC或单独表阿霉素处理的不同RNA的表达值进行了比较（Chearwae等人，2004，Pakunlu等人，2004）。显示了四次独立测量的平均值±S.D。

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转染和双荧光素酶活性测定[1]
将细胞以每孔2×105的密度铺在六孔板上，并让其附着过夜。我们将2μg/孔的hMDR1启动子-pGL3萤火虫荧光素酶报告基因构建体和0.2μg/孔pRL-TK-Renilla荧光素酶报道基因（Promega）与6μl脂质体试剂混合，然后将细胞在25°C下孵育15分钟，然后在37°C下温育15小时。接下来，用25μM的利福平（阳性对照）、10μg/mL的表阿霉素、250μM的GC或表阿霉素和Glycocholic acid/GC的组合处理细胞72小时。孵育后，用双萤光素酶报告物评估萤光素酶报道基因活性。检测系统。简而言之，用冷PBS洗涤细胞两次，然后在300μl报告裂解缓冲液中裂解。在37°C下孵育15分钟后，将裂解物在涡流混合器中混合15秒，并在4°C下离心30秒。然后通过将100μl含荧光素的试剂（萤光素酶检测试剂II）自动注射到20μl裂解物上清液中来启动萤光素酶反应；使用光度计测量所得发光（Chen等人，2004）。在我们量化萤火虫的发光后，我们淬灭了反应，然后通过同时向同一管中加入100μl试剂来启动肾荧光素酶反应。在完成背景校正（针对未经处理的对照细胞中的活性）后，我们将结果计算为hMDR1启动子-pGL3活性水平除以pRL-TK活性。使用蛋白质测定法测定细胞总蛋白浓度。数据是四个独立实验的平均值±标准差。

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使用流式细胞术测量Caco-2细胞中表阿霉素的细胞内积累[1]
我们如前所述测量了细胞内表阿霉素荧光（Lo和Huang，2000，Lo，2003）。将细胞（每孔104个）接种到24孔板中以允许融合。然后用PBS冲洗细胞两次，用250μM的Glycocholic acid/GC预处理，并在37°C下孵育72小时。然后通过向培养基中加入10μg/ml的表阿霉素进行实验。在37°C下孵育3小时后，用冰冷的PBS洗涤细胞两次，胰蛋白酶处理，离心，然后重新悬浮在PBS中。然后使用配备氩离子激光器的流式细胞仪在488 nm和15 mW下进行流式细胞术分析。通过585/42 nm带通滤光片测量红色表阿霉素荧光。使用商业软件（Lysis II；Becton Dickinson）进行数据采集和分析。使用线性标尺收集正向和侧向散射信号，以对数标尺收集荧光信号。每个样本中至少分析了10000个细胞。在每个实验中，都进行了四次测定。

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使用荧光显微镜检测染色质凝聚[1]
在我们用单独的培养基、Glycocholic acid/GC、表阿霉素或GC加表阿霉素处理细胞后，我们使用离心（200 g，1分钟）收集1×106个细胞。将颗粒重新悬浮在100μl PBS和10μl 100mg/ml吖啶橙中，然后在配备有由image Pro Plus软件控制的荧光图像捕获装置的倒置显微镜下观察。观察到碎裂核和浓缩染色质的特征，并将其与对照组进行比较（Kosmider等人，2004）。

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使用流式细胞仪检测DNA含量的亚G1积累[1]
在我们用单独的培养基、10μg/ml的表阿霉素、250μM的Glycocholic acid/GC或表阿霉素和GC的组合处理细胞24小时后，我们使用离心（1200 rpm，5分钟）收集了105个细胞。将颗粒重新悬浮在200μl PBS中，用800μl冰冷的无水乙醇固定，并在-20°C下保持30分钟。我们使用离心（1200 rpm，5分钟）收集细胞，用冰冷的PBS洗涤两次，将其重新悬浮在50μg/ml的碘化丙啶PBS中，然后在25°C的黑暗中孵育40分钟。我们用流式细胞仪分析样品。数据采集和分析是使用商业软件完成的。以对数尺度收集荧光信号。每个实验重复四至六次（Barcia等人，2003，Wang等人，2006，Yamanaka等人，2006）。

大鼠空肠和回肠翻转囊[1]
本研究使用在动物中心饲养繁殖的雄性Sprague-Dawley大鼠。动物实验方案符合国家批准的指南。大鼠空肠和回肠翻转囊的制备方法参照先前文献（Lo和Huang，2000；Lo，2003）。体重约300克的大鼠禁食1天，仅给予双蒸水，直至用二氧化碳处死。取出大鼠空肠和回肠末端（各约25厘米）及其下方的肠系膜。将肠段用冰盐水冲洗，然后置于Tyrode氏液中。翻转肠囊，注入3毫升Tyrode氏液，并在两端结扎。将两端之一用针结扎，以便进行后续取样。然后将囊肿置于50 ml Tyrode氏溶液中孵育60分钟，溶液中添加或不添加250 μM的甘氨胆酸/GC或维拉帕米。实验过程中，溶液通入空气并维持在37 °C。在0分钟时，向黏膜侧加入100 μg/ml的表柔比星。在每项研究中，每隔10分钟从囊肿内取出200 μl溶液，持续60分钟，并用新鲜的Tyrode氏溶液补充，以保持浆膜侧溶液的体积恒定。每个实验重复三次。采用高效液相色谱法（HPLC）测定每个样品中表柔比星的浓度，具体方法如下所述。

[1]. Inhibit multidrug resistance and induce apoptosis by using glycocholic acid and epirubicin. Eur J Pharm Sci. 2008 Sep 2;35(1-2):52-67.

甘氨胆酸是一种胆汁酸与甘氨酸的结合物，其胆汁酸成分为胆酸。它是一种人体代谢产物，在功能上与胆酸和甘氨鹅脱氧胆酸相关。它是甘氨胆酸盐的结合酸。
它是胆酸的甘氨酸结合物。它作为一种去污剂，能够溶解脂肪以促进吸收，自身也能被吸收。
已有报道称，甘氨胆酸存在于智人和秀丽隐杆线虫中，并有相关数据。
它是胆酸的甘氨酸结合物。它作为一种去污剂，能够溶解脂肪以促进吸收，自身也能被吸收。

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我们之前的研究（Lo和Huang，2000）表明，脱氧胆酸钠（一种胆汁酸盐）能够通过细胞旁路和跨细胞途径增加两亲性化合物表柔比星的跨上皮转运。脱氧胆酸钠通过与膜脂和膜蛋白相互作用，引起膜扰动，从而影响跨细胞途径。这种胆汁酸还能通过打开紧密连接影响细胞旁途径（Sakai等，1997）。此外，使用通过底物竞争、ATP耗竭或膜扰动发挥作用的多药耐药逆转剂抑制P-gp功能，可能拮抗多药耐药性（MDR）（Kvackajova-Kisucka等，2001；Lo等，2003）。两亲性胆汁酸（如脱氧胆酸钠）通常具有膜扰动特性，可改变Caco-2细胞膜和大鼠结肠上皮细胞膜的流动性，从而调节跨膜蛋白（如P-gp和MRP）的外排功能（Sawada等，1991；Sakai等，1997）。我们不能排除糖皮质激素（GC）具有类似的膜扰乱效应，从而可能增加表柔比星的吸收并降低其外排。我们进一步假设，GC对泵相关耐药性的抑制作用至少部分地通过抑制P-gp和MRPs来实现，正如我们的RT-PCR和MDR1启动子活性研究所示。此外，在本研究中，GC与表柔比星联用通过线粒体途径诱导caspase-3和caspase-9的表达。抗癌药物诱导的促凋亡刺激可能需要一个线粒体依赖性过程，该过程涉及线粒体外膜的通透性增加以及通常位于膜间隙的线粒体蛋白的释放（Petit等人，1997；Minko等人，2005）。基于糖皮质激素（GC）可能具有的膜扰动特性，我们假设GC能够整合到线粒体膜中，改变线粒体膜的流动性，并调节细胞色素c和促凋亡蛋白的释放等关键过程，从而诱导线粒体途径的细胞凋亡。然而，其详细机制尚需进一步研究。[1]

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鉴于GC与表柔比星联合应用对抑制抗凋亡蛋白和多药耐药（MDR）相关蛋白的作用，我们假设泵耐药和非泵耐药之间存在关联。GC与表柔比星联合应用同时抑制泵耐药和非泵耐药可能是一种逆转MDR的新策略。抗癌药物与GC的联合应用可通过调节P-gp和MRP以及调控凋亡相关通路来控制MDR。

C26H43NO6

465.6227

465.309

C, 67.07; H, 9.31; N, 3.01; O, 20.62

475-31-0

10140

White to off-white solid powder

1.4±0.1 g/cm3

655.3±65.0 °C at 760 mmHg

128°C

350.1±34.3 °C

0.0±4.5 mmHg at 25°C

1.645

2.45

127.09

5

6

6

33

759

11

O([H])[C@@]1([H])C([H])([H])[C@]2([H])[C@@]3(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[C@]([H])(C([H])([H])[C@@]3([H])C([H])([H])[C@]([H])([C@@]2([H])[C@]2([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@]([H])([C@]([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])C(N([H])C([H])([H])C(=O)O[H])=O)[C@]21C([H])([H])[H])O[H])O[H]

RFDAIACWWDREDC-FRVQLJSFSA-N

InChI=1S/C26H43NO6/c1-14(4-7-22(31)27-13-23(32)33)17-5-6-18-24-19(12-21(30)26(17,18)3)25(2)9-8-16(28)10-15(25)11-20(24)29/h14-21,24,28-30H,4-13H2,1-3H3,(H,27,31)(H,32,33)/t14-,15+,16-,17-,18+,19+,20-,21+,24+,25+,26-/m1/s1

2-[[(4R)-4-[(3R,5S,7R,8R,9S,10S,12S,13R,14S,17R)-3,7,12-trihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]pentanoyl]amino]acetic acid

Glycocholic acid; 475-31-0; N-Choloylglycine; Cholylglycine; Glycine, N-choloyl-; G59NX3I3RT; DTXSID2047436; CHEBI:17687;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ≥ 100 mg/mL (~214.77 mM)
H2O : < 0.1 mg/mL

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.47 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.47 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.47 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。