Glycoursodeoxycholic acid (Ursodeoxycholylglycine)   中文名称: 苷熊去氧胆酸酸

Endogenous Metabolite; Microbial Metabolite

由于糖熊去氧胆酸（GUDCA）已被证明通过预防线粒体肿胀具有神经保护作用，我们测试了这种胆汁酸对UCB诱导的线粒体呼吸链改变的有益作用GUDCA显示能够完全逆转细胞色素c氧化酶活性的抑制（图1c）。[1]
接下来，我们探讨了暴露于UCB的未成熟神经元的氧化状态。我们观察到，UCB显著诱导了活性氧物种的产生，即O2•−（图2a）和GSSG（图2b），以及NADPH浓度的降低（图2c）。此外，用GUDCA预孵育神经元有效地阻止了UCB引起的所有这些氧化事件。[1]
鉴于线粒体呼吸链耗氧量阈值（Davey等人，1998），可以推测UCB引起的细胞色素c氧化酶抑制水平可能不足以损害线粒体功能。为了阐明这一点，我们首先测定了之前用UCB孵育的解离神经元的耗氧率。如图3所示，UCB显著降低了以葡萄糖、琥珀酸盐或抗坏血酸盐为底物的耗氧率，而GUDCA显著阻止了这种影响。对氧气消耗的影响与线粒体有关，因为琥珀酸盐和抗坏血酸盐都能产生与葡萄糖相同的结果。此外，在所有情况下，抗霉素或氰化钾分别消除了琥珀酸或抗坏血酸驱动的氧气消耗（数据未显示）。抗坏血酸对氧气消耗的抑制表明，UCB对细胞色素c氧化酶的抑制会影响细胞呼吸。为了进一步测试这种可能性，我们评估了Δψm作为线粒体内膜完整性的指标；如图3b所示，UCB导致Δψm崩溃，GUDCA显示出恢复线粒体完整性的能力。[1]
奇怪的是，尽管UCB诱导的线粒体呼吸链功能损伤没有伴随着细胞内ATP水平的降低（数据未显示），但细胞外ATP浓度却有所增加（图4a）。此外，还观察到细胞内乳酸浓度增加（图4b），以及F1,6P2/F6P比值增加（图4c），表明糖酵解激活，这进一步得到了F2,6P2水平升高的支持（图4d）。值得注意的是，所有这些影响都被GUDCA消除了。[1]
最后，我们试图研究UCB引发的线粒体损伤是否与神经毒性有关。如图5a所示，通过流式细胞术评估，UCB提高了膜联蛋白V+/7-AAD−神经元的比例；它还引发了凝聚或碎裂核比例的增加，如荧光显微镜下DAPI所示（图5b）。胱天蛋白酶3激活的增加进一步证实了凋亡导致的细胞死亡（图5c）。胱天蛋白酶9激活的类似增加表明线粒体参与了这一过程。这种影响再次被GUDCA完全抵消。然后，我们可以推测，糖酵解速率的增加（图4）是弥补线粒体损伤的失败尝试。这些结果支持了UCB通过凋亡导致神经细胞死亡的观点，主要是在未成熟的神经元中，并证实了GUDCA有效地保护细胞免受这种神经毒性。1.

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GUDCA防止线粒体存活率降低和凋亡，同时对抗和减少NSC-34/hSOD1G93A细胞中Caspase-9的激活[2]
SC引起的MN凋亡增加主要源于线粒体动力学异常，包括形态异常、生物能量衰竭和由mSOD1介导的退化。在这种情况下，线粒体依赖性胱天蛋白酶-9的激活被证明在mSOD1小鼠的疾病进展中起着至关重要的作用。我们之前已经证明，UDCA和GUDCA能够抑制胆红素诱导的神经元和星形胶质细胞凋亡，GUDCA能有效维持胆红素处理神经元中胱天蛋白酶-9的激活。为了探索GUDCA在ALS MN变性模型中的疗效，我们评估了GUDCA保护线粒体动态特性、胱天蛋白酶-9激活和凋亡导致的细胞死亡的能力，以及恢复表达hSOD1G93A的NSC-34功能的能力。为此，在细胞分化开始时（0 DIV）或2天后（2 DIV），将NSC-34细胞单独或与50μM GUDCA一起孵育，以分别区分预防和恢复能力。在4 DIV时收集细胞，其中表达hSOD1G93A的NSC-34中SOD1积累增加和凋亡明显。我们首先观察到，用GUDCA孵育的细胞没有显示PI+细胞数量的变化（0 DIV时hSOD1wt为4.2±0.1，hSOD1G93A为3.8±0.1；2 DIV时hSOD1wt为4.0±0.5，hSOD1G93A为3.6±0.1）或MTS还原能力（0 DIV时，hSOD1 wt为102±9.7%，hSOD12G93A为88±3.3%）；与未处理的细胞相比，2 DIV时hSOD1wt和hSOD1G93A分别为99±13.2%和99±8.7%），证明了这种胆汁酸的安全性。[2]

接下来，我们验证了表达hSOD1G93A的NSC-34细胞中的线粒体染色程度低于hSOD1wt细胞（0.8倍，p < 0.01), 表明线粒体活力降低和能量受损（图4a，b）。有趣的是，在分化过程之前用GUDCA处理的突变细胞中，这种效应被阻止了，但如果以后添加，则不会。更重要的是，GUDCA能够阻止胱天蛋白酶-9的激活，并恢复NSC-34/hSOD1G93A细胞的基础水平，与表达hSOD1wt的NSC-34细胞相比，其基础水平增加了1.8倍（图4c）。此外，GUDCA能够抑制hSOD1G93A细胞在4 DIV时的核分裂，这被证明增加了2.1倍（p<0.05）（图4d），并在2 DIV孵育（NS）时在一定程度上阻止了其进展。总的来说，这些效应在线粒体膜水平上增强了GUDCA的稳定特性，并增强了其作为抗凋亡化合物的指示作用。2.

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GUDCA可防止NSC-34/hSOD1G93A细胞释放更多的NO和MMP-9，同时还能有效逆转MMP-9的激活，但不会导致ATP的耗竭[2]
细胞外NO和MMP-9水平的升高与ALS的发病机制有关，分别被认为是氧化应激和神经炎症的介质。另一种多效性细胞间信号分子是ATP，根据剂量的不同，ATP具有多种相互矛盾的作用。ATP耗竭被认为发生在ALS发作时，可能源于线粒体ATP输出不足或钙调节失调。在我们的ALS实验模型中，我们观察到NSC-34/hSOD1G93A细胞释放低水平的ATP（p<0.01），同时产生更多的NO和MMP-9流出（p<0.05）（图5）。尽管GUDCA无法恢复ATP的正常细胞外值（图5a），但当在SOD1积累之前加入时，它确实减少了亚硝酸盐的产生（p < 0.05), 但此后不会（图5b）。然而，当在0或2 DIV时加入GUDCA时，GUDCA在表达hSOD1G93A的NSC-34中无法显著改变SOD1的积累。事实上，与hSOD1wt细胞相比，含有SOD1内含物的hSOD1G93A细胞密度增加了1.7±0.4倍，在GUDCA加入后保持不变（0 DIV时为1.4±0.5倍；2 DIV时为1.7±0.6倍）。这一发现表明，GUDCA对NO的减少并非源于mSOD1细胞内积累的减少。现在考虑到MMPs的激活（图5c–e），尽管我们没有观察到hSOD1G93A细胞中MMP-2激活的任何变化或GUDCA的修饰，但胆汁酸对hSOD1G93A细胞中MMP-9刺激的有趣抑制作用（p<0.05）（图5d）。最有趣的是，即使在2 DIV时SOD1细胞内积聚开始后给药，GUDCA也通过减弱MMP-9的病理激活和相关的有害结果，显示了相对于其治疗作用的机会窗口（p < 0.05).

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拼音双语对照 笔记 UDCA和GUDCA保护HBMEC免受UCB诱导的凋亡，但只有GUDCA能有效减少半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3的激活[3]
在HBMEC系中，UCB诱导的凋亡包括凋亡特征的存在，这些特征随着暴露时间的增加而增加，并在48小时达到最大水平（Palmela等人，2011）。因此，选择这一时间来评估UDCA和GUDCA保护HBMEC免受UCB诱导的凋亡的能力。在三个不同的时间点添加胆汁酸，评估其在受伤前后添加的潜力。无论添加时间如何，添加UDCA和GUDCA都能减少UCB损伤（图1）。这种保护作用在GUDCA治疗中最大，特别是在添加UCB前1小时添加时（UCB值降低54%，P<0.001，而UDCA在同一时间点降低42%，P<0.01）。重要的是，当在添加UCB后8小时添加胆汁酸时，胆汁酸部分逆转了UCB损伤，与UCB损伤相比，保护率降低了近30%（图1）。

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UDCA和GUDCA可消除UCB在HBMEC中引起的超微结构变化[3]
基于UCB在48小时孵育后对细胞凋亡的诱导作用以及UDCA和GUDCA部分恢复细胞功能的拯救能力，我们决定进一步评估UCB是否会产生HBMEC超微结构水平的变化，以及胆汁酸处理是否会预防这种变化。透射电子显微镜分析显示，经UCB处理的细胞中核糖体的数量显著减少，在两种胆汁酸存在的情况下明显恢复（图3）。相对于从培养的HBMEC上分离的细胞片段和观察到的线粒体嵴破坏，情况也是如此，这表明UCB的破坏作用在每种胆汁酸的存在下再次显著降低。

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UDCA比GUDCA更有效地降低了UCB诱导的HBMEC中白细胞介素-6 mRNA和细胞因子表达的增加[3]
我们之前观察到的UCB对HBMEC的重要影响之一是白细胞介素-6 mRNA水平和蛋白质分泌的上调（Palmela等人，2011）。这项先前的工作表明，UCB在4小时时诱导了最大的细胞因子分泌，而在UCB暴露后1小时，mRNA表达最高。然后选择这些时间点，并在UCB孵育前1小时加入胆汁酸。如图4所示，两种胆汁酸都消除了白细胞介素-6 mRNA的上调（图4A），GUDCA的UCB值降低了27%（P<0.05），UDCA的UCB值降低了46%（P<0.001）。另一方面，只有UDCA对UCB诱导的白细胞介素-6的释放显示出预防作用（图4B），使UCB诱导细胞因子的分泌减少了35%（P<0.001）。

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UDCA和GUDCA可防止和挽救UCB对HBMEC完整性的破坏[3]
所测试的胆汁酸能够抵消UCB诱导的白细胞介素-6的上调，这使我们假设UDCA和GUDCA可以预防随之而来的内皮通透性增高。因此，我们测量了低分子量化合物荧光素钠的细胞旁渗透性。这是一种广泛使用的阻隔性能指标，几项研究表明，在与高渗透性相关的条件下，其值会增加（Hülper等人，2013；Labus等人，2014）。在我们之前的研究中，我们发现，随着UCB暴露时间的延长，这一参数显著增强（Palmela等人，2012），正如本研究所观察到的那样（图5）。在这里，我们还观察到，单独使用UDCA和GUDCA不会影响HBMEC的完整性，因为我们没有观察到渗透率值的任何变化。然而，胆汁酸对荧光素钠渗透性的影响分析表明，只有UDCA可以预防UCB损伤，如果在之前添加（比UCB值降低22%，P<0.01）或在4小时添加（对UCB值保护18%，P<0.05）。事实上，虽然UCB诱导荧光素钠分子的通过率从对照组的1.42×10-5cm/s增加到UCB处理样品的2.48×10-5cm-s，但与UDCA一起孵育会将该值降低到1.95×10-5cm/s，或在UCB添加后4小时预处理或处理的细胞中降低到1.99×10-5cm2/s。相比之下，GUDCA的值为2.19×10−5和2.24×10−5 cm/s（分别在UCB添加处理前和4小时后），因此与UCB值没有差异。

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UDCA和GUDCA以时间依赖的方式穿过HBMEC单层[3]
将50μM的每种研究胆汁酸添加到插入培养系统的上部（“血液”）隔室中，以评估它们是否能够穿过HBMEC单层，从而假设达到脑实质。在短时间的孵育（4小时）后，培养板下腔室中几乎检测不到胆汁酸。然而，当治疗时间延长（48小时）时，单层胆汁酸通过量显著增加（UDCA和GUDCA分别为18.8±4.8和16.2±3.9μM）。

明胶酶谱法[2]
在所述的非还原条件下，通过在0.1%明胶-10%丙烯酰胺凝胶中进行SDS-PAGE酶谱测定MMP-2和MMP-9的细胞外水平。然后，用2.5%Triton X-100（在50 mM Tris pH 7.4；5 mM CaCl2；1μM ZnCl2中）洗涤凝胶1小时，以去除SDS并使凝胶中的MMP物种复性。为了诱导明胶裂解，将凝胶在37°C下在不含Triton X-100的相同缓冲液中孵育过夜。对于酶活性分析，凝胶用0.5%考马斯亮蓝R-250染色，并在30%乙醇/10%乙酸/H2O中分离。明胶活性被检测为蓝色背景上的白色条带，并通过使用计算机图像分析进行测量，并对总细胞蛋白进行归一化。

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亚硝酸盐测定[2]
如我们之前所述，通过用Griess试剂测量NSC-34细胞外培养基中亚硝酸盐的累积水平来估计NO的产生。简而言之，在室温下，将培养上清液与Griess试剂[1%（w/v）磺胺在5%H3PO4中的比例为1:1（v/v），0.1%（w/v”N-1萘乙二胺在96孔组织培养板中混合10分钟。使用酶标仪测定540 nm处的吸光度。每次测定都使用校准曲线。所有样本均进行了两次测量，并使用了平均值。

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ATP测定[2]
样品在冰上处理以避免ATP降解。为了测定细胞外ATP水平，收集培养基并用2M高氯酸处理。接下来，用4M KOH溶液进行中和。为了去除细胞碎片，样品在4°C下以10000×g的速度离心5分钟。通过酶法测定ATP水平，并在λem=410-460nm和λex=365nm下使用荧光计定量相应的荧光强度。每次进行测定时，都会生成ATP标准曲线。

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线粒体活力测定[2]
为了染色活线粒体，细胞在37°C下与500 nM MitoTracker Red®溶液一起孵育30分钟，然后用4%（w/v）多聚甲醛固定。细胞核用Hoechst 33258染料染色。使用荧光显微镜对每个样品采集至少十个随机显微场（原始放大倍数=×400）的红色荧光和紫外图像。荧光强度由ImageJ软件定量，并归一化为细胞总数。

神经元的治疗[1]
神经元在37°C下，在100μM HSA（UCB/HSA摩尔比为0.5）存在下，在无（对照）或有50μM UCB（来自10mM储备溶液）的Neurobase培养基中孵育1小时。在黑暗中在0.1 M NaOH中临时制备UCB储备溶液，并使用0.1 M HCl将pH值调节至7.4。在适当的情况下，在加入UCB前1小时，用糖熊去氧胆酸（GUDCA）（50μM）预孵育神经元。

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细胞分化和治疗[2]
为了减缓增殖速度并促进细胞成熟，我们在添加了低FBS的培养基中培养了低浓度的NSC-34细胞，这是一种研究NSC-34电池细胞毒性机制的既定方案。因此，48小时后，用包含DMEM-F12加FBS（1%）、非必需氨基酸（1%），青霉素/链霉素（1%）和G148（0.1%）的新鲜培养基代替增殖培养基，如前所述。在0、2和4 DIV时进行评估，以评估转染效率、SOD1的积累和细胞存活率。在另一组实验中，细胞在0 DIV和2 DIV时与50μM糖脱氧胆酸（GUDCA）一起孵育，以评估这种胆汁酸在第一种情况下预防和在最后一种情况下恢复转染的hSOD1在4 DIV时对细胞凋亡和ATP、NO以及MMP-2和MMP-9释放到细胞外培养基中的影响的能力。选择50μM GUDCA的剂量是为了模拟每天每公斤体重13至15mg UDCA治疗后患者血清中常见的GUDCA浓度。我们之前已经证明，这种浓度对神经元没有毒性，最重要的是，在预防神经退行性变方面具有有益的特性

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细胞培养和治疗[3]
为了测试在UDCA和糖熊去氧胆酸/Glycoursodeoxycholic acid (GUDCA)存在的情况下，UCB诱导的内皮细胞损伤是否可以消除，我们使用HBMEC系作为人类BBB的简化模型。该细胞系来源于转染SV40大T抗原的HBMEC原代培养物（Stins等人，2001），最近被证明是最适合体外BBB屏障紧密性的人类细胞系（Eigenmann等人，2013）。细胞在罗斯威尔公园纪念研究所培养基中培养，该培养基补充了10%胎牛血清、10%NuSerum IV、1%非必需氨基酸、1%最低必需培养基维生素、1 mM丙酮酸钠、2 mM l-谷氨酰胺和1%抗生素抗真菌溶液，以8×104个细胞/mL的密度接种在涂有I型胶原的盖玻片或平板中，并在培养2天后进行处理，如前所述（Palmela等人，2011）。对于完整性研究，基于对荧光素钠细胞旁渗透性的测量，将细胞以8×104个细胞/插入物的密度接种在I型胶原涂层的聚酯transwell插入物（0.4μm）上，并在培养8天后进行处理（Palmela等人，2012）。内皮培养物在富含5%二氧化碳的潮湿气氛中保持在37°C，所有实验都在汇合处进行。
还对胆汁酸UDCA和Glycoursodeoxycholic acid (GUDCA)进行了共孵育研究，非共轭形式的辛醇/水分配系数为1000，甘氨酸酰胺化分子的辛醇/水中分配系数为105，前者和后者的logP值分别为3.0和2.02（Roda等人，1990）。在联合孵育研究中，UDCA或GUDCA的最终浓度为50μM，这是在接受UDCA治疗的患者的循环中发现的。特别是，在接受UDCA治疗后，患者的血清中通常会发现50μM GUDCA的浓度，剂量为每天每公斤体重13-15mg（Podda等人，1990；Poupon等人，1994；Brites等人，1998）。我们之前已经证明，这种浓度对神经元没有毒性（Silva等人，2001b），最重要的是，在预防神经退行性疾病方面具有有益的特性（Brito等人，2008；Vaz等人，2010）。胆汁酸在三个不同的时间点加入：UCB加入前1小时和UCB孵育后4或8小时。对于短期UCB孵育，仅评估了用胆汁酸预孵育1小时的效果。还包括适当的对照组，包括用UDCA和GUDCA处理的细胞（不含UCB），以确定这些分子没有毒性。

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透射电子显微镜[3]
在用UDCA或糖熊去氧胆酸/Glycoursodeoxycholic acid (GUDCA)预处理的HBMEC中暴露于UCB 48小时后，通过透射电子显微镜进行超微结构分析。细胞用0.1%磷酸盐缓冲液中的1.2%戊二醛和相同缓冲液中1%四氧化锇固定，用分级乙醇系列脱水，然后包埋在环氧树脂中。超薄切片用乙酸铀酰和柠檬酸铅染色，并在80 kV的加速电压下用Hitachi H-7500透射电子显微镜观察。

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通过渗透率测量评估屏障完整性[3]
在用UCB处理48小时的细胞中评估了UDCA和糖熊去氧胆酸（GUDCA）调节通透性的能力，该时间点导致UCB对HBMEC单层完整状态的最大破坏（Palmela等人，2012）。
在我们之前的研究中，我们发现UCB增加了对荧光素钠（Palmela等人，2012）的渗透性，荧光素钠是一种低分子量示踪剂（376 Da），但对白蛋白结合的伊文思蓝（68 kDa）没有渗透性。因此，在这项研究中，如前所述，使用荧光素钠进行了HBMEC细胞旁渗透性测定（Veszelka等人，2007；Cardoso等人，2012；Palmela等人，2012.）。简而言之，将细胞培养插入物转移到基底隔室中含有Ringer-Hepes溶液（118 mM NaCl、4.8 mM KCl、2.5 mM CaCl2、1.2 mM MgSO4、5.5 mM d-葡萄糖、20 mM Hepes，pH 7.4）的12孔板上。将荧光素钠溶液（Ringer–Hepes中的10 mg/mL荧光素钠）加入到上室中。在20、40和60分钟时将插入物转移到新孔中。收集下腔室溶液以测定荧光素钠水平（Hitachi F-2000荧光分光光度计，激发：440 nm，发射：525 nm）。还测量了无细胞插入物的通量。内皮渗透系数如前所述计算（Deli等人，2005），平均控制渗透系数为1.4×10-5cm/s。

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UDCA和Glycoursodeoxycholic acid (GUDCA)/糖熊去氧胆酸通过HBMEC单层的评估[3]
为了确定UDCA和糖熊去氧胆酸（GUDCA）是否能够穿过BBB内皮，使用了双室培养系统。在孵育4小时和48小时后，将胆汁酸加入上室，收集下腔室的培养基。通过酶荧光分析法测量UDCA和GUDCA的浓度来评估胆汁酸通过HBMEC单层的情况（Brites等人，1998）。结果显示为平均浓度（μM）±SEM。

[1]. Bilirubin selectively inhibits cytochrome c oxidase activity and induces apoptosis in immature cortical neurons: assessment of the protective effects of glycoursodeoxycholic acid. J Neurochem. 2010 Jan;112(1):56-65.

[2]. Glycoursodeoxycholic acid reduces matrix metalloproteinase-9 and caspase-9 activation in a cellular model of superoxide dismutase-1 neurodegeneration.

[3]. Hydrophilic bile acids protect human blood-brain barrier endothelial cells from disruption by unconjugated bilirubin: an in vitro study. Front Neurosci. 2015 Mar 13;9:80.

Glycoursodeoxycholic acid is a bile acid glycine conjugate derived from ursoodeoxycholic acid. It has a role as a neuroprotective agent and a human blood serum metabolite. It is a bile acid glycine conjugate and a N-acylglycine. It is functionally related to an ursodeoxycholic acid. It is a conjugate acid of a glycoursodeoxycholate.

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High levels of unconjugated bilirubin (UCB) may initiate encephalopathy in neonatal life, mainly in pre-mature infants. The molecular mechanisms of this bilirubin-induced neurologic dysfunction (BIND) are not yet clarified and no neuroprotective strategy is currently worldwide accepted. Here, we show that UCB, at conditions mimicking those of hyperbilirubinemic newborns (50 microM UCB in the presence of 100 muM human serum albumin), rapidly (within 1 h) inhibited cytochrome c oxidase activity and ascorbate-driven oxygen consumption in 3 days in vitro rat cortical neurons. This was accompanied by a bioenergetic and oxidative crisis, and apoptotic cell death, as judged by the collapse of the inner-mitochondrial membrane potential, increased glycolytic activity, superoxide anion radical production, and ATP release, as well as disruption of glutathione redox status. Furthermore, the antioxidant compound Glycoursodeoxycholic acid (GUDCA) fully abrogated UCB-induced cytochrome c oxidase inhibition and significantly prevented oxidative stress, metabolic alterations, and cell demise. These results suggest that the neurotoxicity associated with neonatal bilirubin-induced encephalopathy occur through a dysregulation of energy metabolism, and supports the notion that GUDCA may be useful in the treatment of BIND. [1]

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Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that affects mainly motor neurons (MNs). NSC-34 MN-like cells carrying the G93A mutation in human superoxide dismutase-1 (hSOD1(G93A)) are a common model to study the molecular mechanisms of neurodegeneration in ALS. Although the underlying pathways of MN failure still remain elusive, increased apoptosis and oxidative stress seem to be implicated. Riluzole, the only approved drug, only slightly delays ALS progression. Ursodeoxycholic acid (UDCA), as well as its glycine (Glycoursodeoxycholic acid (GUDCA)) and taurine (TUDCA) conjugated species, have shown therapeutic efficacy in neurodegenerative models and diseases. Pilot studies in ALS patients indicate safety and tolerability for UDCA oral administration. We explored the mechanisms associated with superoxide dismutase-1 (SOD1) accumulation and MN degeneration in NSC-34/hSOD1(G93A) cells differentiated for 4 days in vitro (DIV). We examined GUDCA efficacy in preventing such pathological events and in restoring MN functionality by incubating cells with 50 μM GUDCA at 0 DIV and at 2 DIV, respectively. Increased cytosolic SOD1 inclusions were observed in 4 DIV NSC-34/hSOD1(G93A) cells together with decreased mitochondria viability (1.2-fold, p < 0.01), caspase-9 activation (1.8-fold, p < 0.05), and apoptosis (2.1-fold, p < 0.01). GUDCA exerted preventive effects (p < 0.05) while also reduced caspase-9 levels when added at 2 DIV (p < 0.05). ATP depletion (2-fold, p < 0.05), increased nitrites (1.6-fold, p < 0.05) and metalloproteinase-9 (MMP-9) activation (1.8-fold, p < 0.05), but no changes in MMP-2, were observed in the extracellular media of 4 DIV NSC-34/hSOD1(G93A) cells. GUDCA inhibited nitrite production (p < 0.05) while simultaneously prevented and reverted MMP-9 activation (p < 0.05), but not ATP depletion. Data highlight caspase-9 and MMP-9 activation as key pathomechanisms in ALS and GUDCA as a promising therapeutic strategy for slowing disease onset and progression. [2]

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Ursodeoxycholic acid and its main conjugate Glycoursodeoxycholic acid (GUDCA) are bile acids with neuroprotective properties. Our previous studies demonstrated their anti-apoptotic, anti-inflammatory, and antioxidant properties in neural cells exposed to elevated levels of unconjugated bilirubin (UCB) as in severe jaundice. In a simplified model of the blood-brain barrier, formed by confluent monolayers of a cell line of human brain microvascular endothelial cells, UCB has shown to induce caspase-3 activation and cell death, as well as interleukin-6 release and a loss of blood-brain barrier integrity. Here, we tested the preventive and restorative effects of these bile acids regarding the disruption of blood-brain barrier properties by UCB in in vitro conditions mimicking severe neonatal hyperbilirubinemia and using the same experimental blood-brain barrier model. Both bile acids reduced the apoptotic cell death induced by UCB, but only glycoursodeoxycholic acid significantly counteracted caspase-3 activation. Bile acids also prevented the upregulation of interleukin-6 mRNA, whereas only ursodeoxycholic acid abrogated cytokine release. Regarding barrier integrity, only ursodeoxycholic acid abrogated UCB-induced barrier permeability. Better protective effects were obtained by bile acid pre-treatment, but a strong efficacy was still observed by their addition after UCB treatment. Finally, both bile acids showed ability to cross confluent monolayers of human brain microvascular endothelial cells in a time-dependent manner. Collectively, data disclose a therapeutic time-window for preventive and restorative effects of ursodeoxycholic acid and glycoursodeoxycholic acid against UCB-induced blood-brain barrier disruption and damage to human brain microvascular endothelial cells. [3]

C26H43NO5

449.6233

449.314

C, 58.96; H, 8.18; N, 2.64; O, 24.16; S, 6.05

64480-66-6

12310288

White to off-white solid powder

232-235ºC

3.985

106.86

4

5

6

32

727

10

O([H])[C@@]1([H])C([H])([H])[C@]2([H])C([H])([H])[C@@]([H])(C([H])([H])C([H])([H])[C@]2(C([H])([H])[H])[C@]2([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@]3(C([H])([H])[H])[C@@]([H])([C@]([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])C(N([H])C([H])([H])C(=O)O[H])=O)C([H])([H])C([H])([H])[C@@]3([H])[C@@]21[H])O[H]

GHCZAUBVMUEKKP-XROMFQGDSA-N

InChI=1S/C26H43NO5/c1-15(4-7-22(30)27-14-23(31)32)18-5-6-19-24-20(9-11-26(18,19)3)25(2)10-8-17(28)12-16(25)13-21(24)29/h15-21,24,28-29H,4-14H2,1-3H3,(H,27,30)(H,31,32)/t15-,16+,17-,18-,19+,20+,21+,24+,25+,26-/m1/s1

2-[[(4R)-4-[(3R,5S,7S,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-3,7-dihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]pentanoyl]amino]acetic acid

Glycoursodeoxycholic acid; 64480-66-6; Ursodeoxycholylglycine; Glycoursodeoxycholate; GUDCA; Glycine ursodeoxycholic acid; Glycylursodeoxycholic acid; UNII-PF1G5J2X2A;

2934.99.9001

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                  -20°C    1 month

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DMSO : ~100 mg/mL (~222.41 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.63 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.63 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.63 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。