GNE-131

Nav1.7 (IC50 = 3 nM)

GNE-131（化合物 13）针对人 NaV1.7 的 IC50 为 0.003±0.001 μM，并且在人肝微粒体中具有中等清除率。它还表现出针对病毒的高功能活性。 GNE-131 的体外代谢稳定性和效力均良好[1]。

还使用Qube自动电生理平台评估了GNE-131（化合物13）对小鼠NaV1.7的影响，并测量了0.007μM（13）和0.005μM（25）的IC50值。通过自动电压钳在体外测试选定的类似物对hERG钾通道的影响，抑制作用通常较低（化合物13在10μM测试浓度下抑制11%±2%）。 GNE-131（化合物13）的ADME曲线如表7所示。所有化合物在肝微粒体中均表现出中度至高度的代谢稳定性，GNE-131（化合物13）在人、大鼠和狗肝细胞中也表现出高度的稳定性。GNE-131（化合物13）在MDR1转染的MDCK细胞中表现出中等渗透性，其中25个显示出P-糖蛋白（Pgp）介导的高流出潜力。在10μM的浓度下，这些化合物对CYP亚型3A4、1A2、2C9和2D6没有明显的抑制作用。血浆蛋白结合（PPB）通过快速平衡透析测定，通常非常高（人类、小鼠和大鼠为99.0-99.9%）。通过使用HT透析膜进行平衡透析对GNE-131（化合物13）的测试表明，小鼠的PPB分别为99.8%和99.7%。

GNE-131 在大鼠、小鼠和狗体内的清除率较差。 GNE-131 的卓越功效也在转基因小鼠疼痛模型中得到了证实 [1]。

静脉注射GNE-131后小鼠、大鼠和狗的药代动力学参数如表8所示。GNE-131的总清除率较低（0.8–7 mL/min/kg），与肝细胞稳定性测试推断的低体外清除率一致（表7）。分布体积低（<0.7 L/kg），在酸性化合物通常观察到的范围内[1]

同样，环丙基磺酰胺类似物GNE-131在测试剂量下显示出伤害性行为的显著降低，在30mg/kg剂量和2.8±0.8μM的血浆浓度下降低了85%。两种金刚烷基三唑10和GNE-131抑制伤害性行为的EC50值分别计算为5.8μM（10）和0.5μM（GNE-131）（图6B）[1]。

竞争性绑定实验[1]
在96孔聚丙烯板中于室温下进行18小时的结合反应。在360μL的测定体积中，将膜与50 pM[3H]GX-545和浓度逐渐增加的试验化合物（1%DMSO）一起孵育。非特异性结合是在1μM未标记的GX-545存在下定义的。在DMSO（1%）存在下测定总结合。将反应转移并通过用0.5%聚乙烯亚胺预浸的96孔玻璃纤维/C滤板过滤。用200μL含0.25%BSA的冰冷缓冲液洗涤过滤后的反应物5次。通过液体闪烁计数测定结合放射性。

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肝微粒体代谢稳定性研究[1]
在CD-1小鼠（n=10）、Sprague-Dawley大鼠（n=20）、食蟹猴（n=4）、比格犬（n=3）和人类（n=15）的混合肝微粒体中评估了氧化代谢。在含有0.5mg/mL微粒体蛋白、1mM NADPH和1μM试验化合物的0.1M磷酸钾缓冲液（pH 7.4）中为每种物种制备孵育混合物。通过加入NADPH引发反应。样品在37°C下孵育，等分试样在0、20、40和60分钟时取样。在每个时间点用95/5乙腈/水（v/v）和内标淬灭反应。样品在3000g下离心10分钟。上清液用水（1:2比）稀释，使用t=0峰面积比值作为100%，通过LC-MS/MS测定化合物残留百分比。按照Obach等人的描述测定体外Clint和结垢肝Clhep。

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体外Pgp（MDR1）转运试验[1]
使用异源表达人Pgp的Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞来确定化合物是否是这些转运蛋白的底物。MDR1-MDCKI细胞获美国国家癌症研究所许可。对于转运研究，在使用前4天将细胞接种在12孔Costar Transwell板上（聚酯膜，孔径0.4μm；Corning Life Sciences，Lowell，MA），接种密度为1.3×105个细胞/mL。在MDR1测定中，化合物在顶端到基底外侧（a-B）和基底外侧到顶端（B-a）方向上以10μm进行测试。将化合物溶解在由Hank's平衡盐溶液和10mM HEPES组成的运输缓冲液中。Lucifer Yellow被用作细胞旁标记。流出比（ER）计算为ER=；标准偏差不可用。

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体外血浆蛋白结合[1]
红色设备[1]
通过使用RED（快速平衡透析）装置进行平衡透析，在体外和CD-1小鼠、Sprague-Dawley大鼠、食蟹猴、比格犬和人血浆中测定蛋白质结合的程度。将试验化合物溶解在二甲基亚砜（DMSO）中，并加入血浆中，使试验化合物的终浓度为5μM，血浆中DMSO的浓度为1%。血浆样本（300μL）在37°C的加湿培养箱中，在摇动平台上用PBS缓冲液（500μL）透析4小时。透析后，将缓冲液和血浆样品转移到96孔板上。血浆蛋白用含有内标的乙腈沉淀。通过LCMS/MS定量血浆和缓冲液样品中母体分析物的量，并计算未结合分数百分比（fu）。

HT透析[1]
通过使用HT透析板（型号HTD 96b）进行平衡透析，以与上述类似的方式在WuXi Apptec测定CD-1小鼠血浆（生物回收IVT）中的蛋白质结合程度，除了使用终浓度为2μM的试验化合物。

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细胞色素P450（CYP）抑制试验[1]
将受试化合物与0.2 mg/mL人肝微粒体（150个供体池）以及NADPH辅因子和每种受试CYP的特异性探针底物一起孵育：CYP1A2（非那西丁）、CYP2C9（华法林）、CYP4C19（美苯妥英）、CYP2D6（右美沙芬）和CYP3A4（睾酮和咪达唑仑）。30分钟后，通过加入含有内标的冷乙腈/甲酸（94:6 v/v）终止反应。通过LCMS/MS分析确定CYPs对探针底物的转化来确定抑制作用。测试每种测试化合物的五个浓度（0.1、1、5和10μM，以及溶剂对照）以产生IC50值。IC50值来自单个实验；SD不适用。

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人孕烷X受体（PXR）激活试验[1]
通过使用DPX2细胞来确定测试化合物激活PXR的能力，DPX2细胞是一种与PXR表达载体和萤光素酶报告基因稳定整合的人HepG2衍生细胞系。DPX2细胞在37°C的CO2培养箱中用0.046至20μM的八种浓度的测试化合物处理24小时，一式两份。用CellTiter Fluor荧光法评估细胞存活率，以获得相对荧光单位（RFU）。使用One Glo测量萤光素酶活性，该活性与PXR激活程度和DPX2细胞中伴随的基因转录成正比，以获得相对发光单位（RLU）。通过将每种测试化合物浓度下的平均RLU除以平均RFU，以及在载体对照中，PXR（萤光素酶）活性与细胞存活率归一化。PXR受体活化倍数增加是通过将单个剂量的标准化萤光素酶活性除以标准化DMSO载体对照的活性来计算的。最终数据表示为相对于车辆控制的折叠激活。利福平（RIF）用作阳性对照。使用八种浓度的试验化合物和RIF，可以从对数剂量反应曲线的非线性回归分析中得出EC50。当两种化合物以10μM的试验浓度使用时，试验化合物对PXR的诱导以利福平的活化百分比表示。显示10μM RIF活化率<15%的测试化合物将被视为阴性。

PatchXpres自动电压钳平台[1]
在整个细胞结构中记录了宏观钠电流。细胞内溶液包含5 mM NaCl、10 mM CsCl、120 mM CsF、0.1 mM CaCl2、2 mM MgCl2、10 mM HEPES和10 mM EGTA（用CsOH调节至pH 7.2），而细胞外溶液包含140 mM NaCl、5 mM KCl、2 mM CaCl2，1 mM MgCl2和10 mM HEPES（用NaOH调节至pH 7.4）。一般来说，用胆碱等摩尔替代可以减少外部钠。用葡萄糖将内溶液和外溶液的渗透压分别调节至300和310mOsm/kg。以40kHz的采样频率记录电流，以5Hz进行滤波，并用DataXpress软件进行分析。串联电阻补偿为60-80%。将化合物抑制拟合到Hill方程Y=[C]h/（IC50h+[C]h），以估算半最大抑制浓度（IC50值）；其中Y是相对于对照的标准化抑制，[C]是测试化合物浓度，IC50是抑制电流50%的测试化合物的浓度，h是希尔系数。PatchXpress自动电压钳平台上产生的IC50值以平均值±标准差表示。

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QPatch HT自动电压钳位装置[1]
如PatchXpress系统所述，使用细胞内和细胞外溶液以及渗透压。使用QPatch检测软件对数据进行分析。QPatch自动电压钳平台上的IC50值由合并数据生成，SD不适用。

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Qube384自动电压钳位系统[1]
在电生理记录期间使用反向钠梯度。具体而言，使用低钠（1 mM）细胞外溶液和高钠（120 mM）细胞内溶液。这些溶液含有以下物质（mM）：低钠、1 NaCl、139氯化胆碱、5 KCl、2 CaCl2、1 MgCl2和10 HEPES；高钠、120氟化钠、10氯化铯、0.1氯化钙、2 氯化镁、10 HEPES和10 EGTA。外部溶液用氢氧化钠滴定至pH 7.4，而细胞内溶液用CsOH滴定至pH 7.2。电流在5 kHz下进行低通滤波，并以25 kHz的采样频率记录。应用了最小密封电阻和最小电流大小的适当滤波器，并对串联电阻进行了100%补偿（通常在-120保持电位的0 mV测试脉冲下，膜电阻>500 MΩ，电流幅值>1 nA）。数据是在室温下收集的，相当于记录室的27±2°C。每个实验板都包含车辆控制装置，以量化和校正任何与化合物无关的电流“耗尽”。在车内20分钟后建立基线。在实验结束时，通过向每个孔中加入300 nM河豚毒素（TTX）来建立最大抑制作用。IC50测定暴露20分钟后或动力学实验暴露26分钟后，根据电流振幅从基线到最大阻断的分数减少计算阻断分数。使用Analyzer和Prism软件进行数据分析。Qube自动电压钳平台上的IC50值由Hill方程拟合合并数据得出，SD不适用。

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VSD4残基的定点突变[1]
如上所述，在稳定的HEK293细胞系中，人NaV1.7通道与β1亚基共表达。还产生了具有hNaV1.7的永久转染Y1537A、R1602A、R1605A或R1608A突变的稳定HEK293细胞系，每个细胞系共表达β1亚基。使用安捷伦的QuikChange II XL定点突变试剂盒产生hNaV1.7 VSD4突变体，所有构建体均通过全长DNA测序得到确认。除非另有说明，否则使用Qube384自动电压钳系统在上述条件下记录突变钠电流的全细胞膜片钳记录。为了确定失活状态阻断，膜电位保持在-60 mV（NaV1.7WT和NaV1.7Y1537A）或-75 mV（NaN.17R1602A、NaV1.7R1605A和NaV1.7R1608A；见支持信息）。每10秒一次，将电压降至非常负的（Vhold=-150 mV）电压20 ms，然后施加测试脉冲以量化药物阻断。归一化化合物抑制符合Hill方程。使用Analyzer和Prism软件进行数据分析。结果以平均值±SEM表示。使用Prism进行统计比较（Student's t检验、单因素方差分析），P<0.05的P值被认为具有统计学意义。

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冷冻肝细胞代谢稳定性研究[1]
在CD-1小鼠（n=10）、Sprague-Dawley大鼠（n=3）、食蟹猴、比格犬和人类（n=10。以0.5×106个细胞/mL的密度接种细胞；通过加入测试化合物引发反应，使最终底物浓度为1μM。样品在37°C、5%二氧化碳和饱和湿度下孵育，在0、1、2和3小时取等分试样。在每个时间点用含乙腈的内标淬灭反应。样品在2000g下离心10分钟。上清液用水（1:2比例）稀释，通过LC/MS/MS测定剩余试验化合物的百分比。使用t=0峰面积比值为100%，如前所述测定体外Clint和缩放的肝Clhep，其中QLiver是肝血流；标准偏差不适用。

Pharmacokinetic Studies in Mice, Rats, and Dogs[1]
FVB Mouse PK[1]
Male FVB mice between 6 and 7 weeks of age with body weight ranging from 23 to 30 g were divided into groups of 3 per route and dose, and were not fasted before dosing. Mice in each group received an oral dose of the test article at 30 mg/kg prepared in 0.5% methyl cellulose with 0.2% Tween 80 (MCT) at a dose volume of 5 mL/kg. Blood samples (15 μL) were collected via tail nick from each animal at 0.25, 0.5, 1, 2, 4, and 6 h postdose and added to 60 μL of EDTA (1.7 mg/mL) water. Test article concentration in each blood sample was determined by a nonvalidated LCMS/MS assay at Genentech. The study for compound 25 was performed at Xenon Pharmaceuticals at a dose of 10 mg/kg using otherwise similar conditions.

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CF-1 Mouse PK[1]
Male CF-1 mice (4–5 weeks old) ranging from 30 to 40 g were were given ad libitum food and water access prior to studies. For iv dosing, three mice were given a single iv dose in 50% poly(ethylene glycol) 400 in phosphate buffered saline and 50% 2-(hydroxpropyl)-β-cyclodextrin in phosphate buffered saline (40:60). Blood samples (approximately 0.04 mL per sample) were collected from each animal into tubes containing K2EDTA at 0.033, 0.167, 0.5, 1, 2, 4, 8, and 24 h after dose administration. For oral dosing, three mice were given a single po dose in 0.5% w/w methyl cellulose and 0.2% v/v tween 80 in deionized water. Blood samples (approximately 0.04 mL per sample) were collected from each animal into tubes containing K2EDTA at 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, and 24 h after dose administration. Blood was centrifuged for 10 min to harvest plasma. The concentration of test compound in each plasma sample was determined by LCMS/MS assay at Xenon.

Rat PK[1]
Male Sprague–Dawley (SD) rats (9–11 weeks old) ranging from 250 to 300 g were fasted 16 h before oral dose administration. Three rats were given a single iv dose in 10% DMSO, 50% poly(ethylene glycol) 400, and 40% phosphate buffered saline. Blood samples (approximately 0.2 mL per sample) were collected from each animal into tubes containing K2EDTA at 0.033, 0.083, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 6, and 8 h after dose administration. Blood was centrifuged for 10 min to harvest plasma. The concentration of test compound in each plasma sample was determined by a nonvalidated LCMS/MS assay at Genentech. Pharmacokinetic analysis was performed at Genentech using noncompartmental methods.

Dog PK[1]
Pharmacokinetics of test compound was determined in male Beagle dogs following a single intravenous bolus (iv) administration. Non-naive male Beagle dogs ages ranging from 6 months to 3 years old and weighing between 6 and 12 kg were obtained from Marshall Bioresources (Beijing, China). Animals were not fasted before iv dosing. Blood samples were collected in tubes containing K2EDTA at predose and at 0.033, 0.083, 0.25, 0.5, 1, 3, 6, 9, and 24 h post-iv administration. Blood was centrifuged for 10 min to harvest plasma. The concentration of test compound in each plasma sample was determined by a nonvalidated LCMS/MS assay at Wuxi AppTech, Inc. Pharmacokinetic analysis was performed at Genentech using noncompartmental methods.

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Efficacy Studies in Human NaV1.7 I848T Transgenic Mice[1]
Male FVB hSCN9a Tg used for the experiments were seven to 10 weeks old and weighed 19 to 27 g. The test compound was administered orally in 0.5% w/w methyl cellulose and 0.2% v/v tween 80 in deionized water at a dose volume of 10 mL/kg 2 h before injection of the pain agent. The mice were then acclimatized to the test chamber for 60 min prior to injection of the pain-inducing agent. A volume of 20 μL of 39 μM aconitine was injected subcutaneously into the dorsal region of the left hind paw to induce spontaneous pain. Video data acquisition begins immediately after injection of the pain agent and continues for a total duration of 70 min. The first 30 min of each acquired video was analyzed and scored for the time spent flicking, lifting, biting, or licking the injected paw. At approximately 3–4 h post treatment (dosing of test compound), terminal blood samples via cardiac puncture were collected upon euthanasia of animals in addition to brain tissue. Plasma prepared in EDTA and brain tissue were frozen in liquid nitrogen and stored at −80 °C for PK analysis.

[1]. Design of Conformationally Constrained Acyl Sulfonamide Isosteres: Identification of N-([1,2,4]Triazolo[4,3- a]pyridin-3-yl)methane-sulfonamides as Potent and Selective hNaV1.7 Inhibitors for the Treatment of Pain. J Med Chem. 2018 Jun 14.

The sodium channel NaV1.7 has emerged as a promising target for the treatment of pain based on strong genetic validation of its role in nociception. In recent years, a number of aryl and acyl sulfonamides have been reported as potent inhibitors of NaV1.7, with high selectivity over the cardiac isoform NaV1.5. Herein, we report on the discovery of a novel series of N-([1,2,4]triazolo[4,3- a]pyridin-3-yl)methanesulfonamides as selective NaV1.7 inhibitors. Starting with the crystal structure of an acyl sulfonamide, we rationalized that cyclization to form a fused heterocycle would improve physicochemical properties, in particular lipophilicity. Our design strategy focused on optimization of potency for block of NaV1.7 and human metabolic stability. Lead compounds 10, 13 (GNE-131), and 25 showed excellent potency, good in vitro metabolic stability, and low in vivo clearance in mouse, rat, and dog. Compound 13 also displayed excellent efficacy in a transgenic mouse model of induced pain.[1]

C23H30N4O3S

442.574304103851

442.20386

C, 62.42; H, 6.83; N, 12.66; O, 10.84; S, 7.24

1629063-81-5

91666633

Light yellow to yellow solid powder

4.8

94Ų

1

6

7

31

780

0

C1(S(NC2N3C(=NN=2)C=C(OCC24CC5CC(CC(C5)C2)C4)C(C2CC2)=C3)(=O)=O)CC1

FPERPEQIXLOVIK-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C23H30N4O3S/c28-31(29,18-3-4-18)26-22-25-24-21-8-20(19(12-27(21)22)17-1-2-17)30-13-23-9-14-5-15(10-23)7-16(6-14)11-23/h8,12,14-18H,1-7,9-11,13H2,(H,25,26)

N-(7-(Adamantan-1-ylmethoxy)-6-cyclopropyl-[1,2,4]-triazolo[4,3-a]-pyridin-3-yl)cyclo-propanesulfonamide

GNE-131; GNE 131; GNE-131; 1629063-81-5; GNE131; N-[7-(1-adamantylmethoxy)-6-cyclopropyl-[1,2,4]triazolo[4,3-a]pyridin-3-yl]cyclopropanesulfonamide; GNE 131; N-(7-(adamantan-1-ylmethoxy)-6-cyclopropyl-[1,2,4]triazolo[4,3-a]pyridin-3-yl)cyclopropanesulfonamide; N-[7-(adamantan-1-ylmethoxy)-6-cyclopropyl-[1,2,4]triazolo[4,3-a]pyridin-3-yl]cyclopropanesulfonamide; CHEMBL4290579; GNE131

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~125 mg/mL (~282.44 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.70 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.70 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.70 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。