Go6976 (PD40697)

Protein Kinase C (PKC) (IC50 = 20 nM)

Go6976 是一种高效的体外 PKC 抑制剂 (IC50 = 20 nM)。它与十字孢菌素的结构相似，使其成为最有效的 PKC 抑制剂[1]。有趣的是，Go6976 还被发现可以废除 S 和 G2 逮捕。剂量反应研究表明，30 nM Go6976 足以在 6 小时内消除 S 期停滞，并在 24 小时内完全消除 G2 停滞，随后发生致命的有丝分裂。将细胞与 100 nM Go6976 一起孵育足以分别在 6 小时和 24 小时完全消除 S 和 G2 停滞，并且仅比牛血清中的效力稍弱。在所使用的浓度下，与对照相比，单独用 UCN-01 或 Go6976 孵育细胞不会降低活力。

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使用代表HIV-1整合后状态的U1和ACH-2细胞系，测试了PKC合成抑制剂Gö6976的作用。Gö6976是一种非糖苷类吲哚咔唑，被发现能有效抑制Bryostatin 1、肿瘤坏死因子α和白细胞介素6诱导的HIV-1。Gö6976有效阻断Bryostatin 1或肿瘤坏死因子α诱导的病毒转录，从而抑制细胞内病毒蛋白合成和病毒脱落。Gö6976还阻断了白细胞介素6介导的病毒蛋白转录后诱导。Gö6976的IC50比另一种具有类似机制的PKC抑制剂H-7的IC50强12至60倍。当在强效PKC激活剂Bryostatin 1诱导前或诱导后1小时内不添加Gö6976时，抑制作用会降低。然而，U1细胞可以在无毒的Gö6976（300 nM）浓度下长时间生长，这几乎可以抑制HIV-1的诱导，而不会产生耐药性。结果表明，使用Gö6976等强效PKC抑制剂抑制HIV-1前病毒从潜伏/低水平产生的感染状态诱导可能是一种有前景的额外抗病毒方法。[1]

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我们通过使用基于聚合酶活性的报告分析，确定蛋白激酶C（PKC）抑制剂Gö6976具有进入后的抗流感病毒作用。对流感病毒感染的细胞以及用RNA聚合酶复合物构建体瞬时转染的细胞观察到这种抑制作用。重要的是，病毒蛋白磷酸化的体外分析确定PKC-α是一种磷酸化PB1和NS1的激酶，而不是PB2、PA或NP。Gö6976能够在体外阻断PKC特异性磷酸化。因此，我们的数据表明，PKC有助于流感PB1和NS1蛋白的磷酸化，这似乎与病毒RNA聚合酶活性和有效的病毒复制在功能上相关[3]。

Go6976（2.5 mg/kg ip）作为PKD抑制剂，通过抑制MAPKs激活减少TNF-α的产生，有效预防LPS/D:-GalN诱导的急性肝损伤，并显着提高LPS/D-GalN的存活率- 受到挑战的老鼠。 Go6976能有效抑制小鼠慢性粒细胞白血病的进展[4]
为了探索Gö6976在体内的作用，我们创建了CML小鼠模型。注射肿瘤细胞约3周后，小鼠开始出现白血病症状，包括后肢瘫痪、体重减轻、毛发蓬松和活动减少（图2（a））。结合以下实验数据，成功建立了K562-NOD/SCID CML小鼠模型。注射K562细胞后，每周对CML小鼠称重并记录。在Gö6976组（2.5mg/kg）和对照组中都发现了小鼠的体重减轻。与对照组相比，注射后5周，Go6976组的小鼠体重减轻明显减少（图2（b））。

图2:Go6976对慢性粒细胞白血病小鼠的治疗作用。（a）K562-NOD/SCID CML小鼠出现后肢瘫痪、体重减轻、毛发蓬松和活动减少。（b）注射K562细胞后不同时间的小鼠体重（*P < 0.05 与对照组相比）。（c）两组小鼠的存活曲线（每组8只小鼠）。（d）两组小鼠脾脏的一般形态。（e）两组小鼠脾脏的重量。 我们在实验期间收集了小鼠的外周血，发现两组的白细胞都呈上升趋势。然而，白细胞数量在2.5 注射后第一周开始，mg/kgGo6976组低于对照组。2.5中的白细胞数量 从第3周到第5周，mg/kg Gö6976组与对照组相比显著降低（图3（a））。同时，通过流式细胞术观察不同时间小鼠外周血中CD45+白血病细胞的百分比。结果显示，外周血白细胞中CD45+白血病细胞的比例在第一周和第二周仅为约1%，在第三周约为2-3%。在第一至第三周，两组之间没有显著差异。第四周，CD45+白血病细胞在2.5 mg/kg Gö6976组明显低于对照组（图3（b-d））。

图3。两组小鼠外周血分析，包括白细胞计数和流式细胞术分析CD45+白血病细胞的百分比。（a）对照组和Gö6976组外周血白细胞计数（*P < 0.05 与对照组相比）。（b）第4周对照组CD45+白血病细胞百分比。（c）第4周Go6976组CD45+白血病细胞的百分比。（d）第3周和第4周两组外周血CD45+白血病细胞百分比（*P < 0.05 与对照组相比）。

记录两组小鼠的死亡时间。对照组第一只小鼠在注射后第29天死亡，对照组最后一只小鼠在移植后第71天死亡。在Gö6976组中，第一只小鼠在注射后第40天死亡，三只小鼠存活到观察期的第80天。小鼠的存活时间在2.5 mg/kg Gö6976组的小鼠明显长于对照组。（图2（c））。最后，在注射后第9周收集脾脏并称重。我们发现，2.5岁以下的小鼠脾脏 mg/kg Gö6976组小于对照组（图2（d）），脾脏重量也低于对照组（见图2（e））。 Go6976对健康小鼠的一般状况、肝脏、脾脏或肺部没有显著影响[4]
通过上述实验，我们证明了Gö6976在体内和体外对CML具有显著的抑制作用。我们发现，在体外实验中，Gö6976对普通造血细胞和免疫细胞几乎没有影响（图1（c））。因此，它是否对健康小鼠有影响将是我们下一个研究方向。

我们将健康的BALB/c小鼠分为三组：对照组（生理盐水）、低剂量Go6976-组（2.5mg/kg Gö6976）和高剂量Gö6976-10mg/kg Gö6976-组。我们发现，在给药期间，各组小鼠的精神状态、日常活动、食物摄入或排便没有异常，对照组、低剂量Gö6976组和高剂量Gö6936组的体重增加没有显著差异（图4（a））。这三个群体的增长趋势保持一致。注射后3周，取肝脏、脾脏和肺部，用HE染色。在光学显微镜下观察了三组器官的组织结构，与对照组相比，这两个Gö6976组没有炎症浸润、细胞变性、坏死、间质充血、水肿或其他病理反应（图4（b-d））。

图4。Go6976对健康小鼠体重和器官的影响。（a）各组小鼠的体重增长率。（b）HE染色后各组小鼠的肝脏切片。（c）HE染色后各组小鼠脾脏切片。（d）HE染色后各组小鼠的肺切片。

细胞计数试剂盒-8测定[1]
收集对数生长期的K562细胞，以5×103个细胞/孔的密度接种到96孔细胞培养板中。K562细胞用5μMGo6976处理，10 μΜGo6976，0μΜGo6976 + 2 μM伊马替尼，5μM Go6976 + 2 μM伊马替尼和10μΜGo6976 + 2 μM伊马替尼，对照组仅用PBS治疗。每组设置5个平行孔，培养72小时 h.向每个孔中加入10微升细胞计数试剂盒-8（CCK-8）溶液。孵育3天后 在37°C的5%CO2培养箱中，吸光度为450 记录nm。

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MTT法[1]
收集对数生长期的CD34+细胞和PBMCs，以5×103个细胞/孔的密度接种在96孔细胞培养板上。CD34+细胞和PBMC分别用0.5、1.0、2.5和5.0μM的Go6976处理24小时 h.每组设置5个平行孔，培养72小时 h.然后，50μL的2 向每个孔中加入mg/mL MTT溶液，并将细胞培养4 h，以2000r/min离心10分钟 min。将上清液在黑暗中丢弃。最后，向每个孔中加入100μL DMSO，将混合物摇动5分钟 在450℃下读取每个孔的吸光度 nm.

体内药物治疗 [4]
药物治疗从 K562 细胞注射后第 8 天开始，每周给药两次，持续 4 周。根据是否给予 Go6976/Gö6976，将 K562-NOD/SCID CML 小鼠分为两组：实验组小鼠注射 2.5 mg/kg Go6976/Gö6976，对照组小鼠注射等体积的生理盐水。

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体内药物毒性实验 [4]
将 24 只 BALB/c 小鼠随机分为 3 组：实验组小鼠注射 2.5 mg/kg Go6976/Gö6976 或 10 mg/kg Go6976/Gö6976小鼠和对照组小鼠注射等体积的生理盐水。每隔2天给小鼠称重并注射，共注射12次。注射结束后，采集这些小鼠的血液和器官。

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溶于DMSO；2.5 mg/kg；腹腔注射

border-color: rgb(238, 238, 238);">LPS/D-GalN 攻击的小鼠

[1]. Gö 6976, a selective inhibitor of protein kinase C, is a potent antagonist of human immunodeficiency virus 1 induction from latent/low-level-producing reservoir cells in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 1993 May 15;90(10):4674-8.

[2]. Microbial metabolites and derivatives targeted at inflammation and bone diseases therapy: chemistry, biological activity and pharmacology. The Journal of Antibiotics volume 71, pages 60–71 (2018).

[3]. Influenza A virus proteins PB1 and NS1 are subject to functionally important phosphorylation by protein kinase C. J Gen Virol. 2009;90(Pt 6):1392-1397.

[4]. The effect of Gö6976 on chronic myeloid leukemia in vitro and in vivo. Hematology . 2021 Dec;26(1):543-551.

Goe 6976 是一种有机杂六环化合物，属于吲哚咔唑类化合物。它是一种 EC 2.7.11.13（蛋白激酶 C）抑制剂。
它是一种钙依赖性蛋白激酶 C 亚型的抑制剂。

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人类免疫缺陷病毒 (HIV-1) 感染后会经历一段潜伏期或低水平持续 (LLP) 状态，导致宿主无症状感染。多种激活因子，包括有丝分裂原、抗原和细胞因子，均可触发病毒的有效表达。蛋白激酶 C (PKC) 已被证明在这些激活因子诱导的细胞内信号级联反应中发挥重要作用。本研究使用代表 HIV-1 整合后状态的 U1 和 ACH-2 细胞系，测试了合成 PKC 抑制剂 Goe 6976 的作用。 Gö 6976 是一种非糖苷类吲哚咔唑，可有效抑制 Bryostatin 1、肿瘤坏死因子 α 和白细胞介素 6 诱导的 HIV-1 表达。Gö 6976 能有效阻断 Bryostatin 1 或肿瘤坏死因子 α 诱导的病毒转录，从而抑制细胞内病毒蛋白合成和病毒脱落。Gö 6976 还能阻断白细胞介素 6 介导的病毒蛋白转录后诱导。Gö 6976 的 IC50 值比另一种作用机制类似的蛋白激酶 C (PKC) 抑制剂 H-7 高 12 至 60 倍。当未在强效 PKC 激活剂 Bryostatin 1 诱导前或诱导后 1 小时内添加 Gö 6976 时，其抑制作用会减弱。然而，U1 细胞可在无毒浓度的 Gö 6976 (300 nM) 中长期培养，该浓度几乎完全抑制了 HIV-1 的诱导，且未产生耐药性。结果表明，使用强效 PKC 抑制剂（如 Gö 6976）抑制 HIV-1 前病毒从潜伏/低水平产生感染状态的诱导，可能代表一种有前景的新型抗病毒策略。[1] 目标：慢性粒细胞白血病 (CML) 是一种血液系统的恶性肿瘤。Gö6976 是一种吲哚咔唑类化合物，具有很强的抗肿瘤作用，但尚未有关于 Gö6976 对 CML 疗效的报道。本研究旨在：(1) 探讨 Gö6976 在体外和体内对慢性粒细胞白血病 (CML) 的影响；(2) 探讨 Gö6976 对正常细胞和动物的药物毒性。方法：采用 K562 细胞和 CML 小鼠模型探讨 Gö6976 对 CML 的影响。采用外周血单核细胞 (PBMC)、CD34+ 细胞和健康小鼠模型探讨 Gö6976 的药物毒性。结果：细胞实验表明，Gö6976 在 5 μM 和 10 μM 浓度下可抑制 K562 细胞增殖并增强伊马替尼的抑制作用，但浓度低于 5 μM 时对 CD34+ 细胞或 PBMC 的影响甚微。动物实验表明，2.5 mg/kg 的 Gö6976 能有效抑制小鼠慢性粒细胞白血病 (CML) 的发展，而 2.5 mg/kg 和 10 mg/kg 的剂量对健康小鼠几乎没有影响。讨论：由于 Gö6976 对 CML 具有直接抑制作用，并且能增强伊马替尼的药理作用，因此 Gö6976 有望成为一种新型抗 CML 药物。但仍需进一步研究。结论：我们的研究结果证实，Gö6976 能在体外和体内有效抑制 CML，并且对造血细胞、免疫细胞和健康小鼠几乎没有毒性。[4]

C24H18N4O

377.42

378.148

C, 76.17; H, 4.79; N, 14.81; O, 4.23

136194-77-9

3501

white solid powder

1.4±0.1 g/cm3

652.3±55.0 °C at 760 mmHg

348.3±31.5 °C

0.0±2.0 mmHg at 25°C

1.774

3.48

62.75

1

2

2

29

730

0

N#CCCN(C1=C2C(CNC3=O)=C3C4=C1N(C)C5=C4C=CC=C5)C6=C2C=CC=C6

VWVYILCFSYNJHF-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C24H18N4O/c1-27-17-9-4-2-7-14(17)20-21-16(13-26-24(21)29)19-15-8-3-5-10-18(15)28(12-6-11-25)23(19)22(20)27/h2-5,7-10H,6,12-13H2,1H3,(H,26,29)

3-(23-methyl-14-oxo-3,13,23-triazahexacyclo[14.7.0.02,10.04,9.011,15.017,22]tricosa-1,4,6,8,10,15,17,19,21-nonaen-3-yl)propanenitrile

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 3.25 mg/mL (8.59 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 32.5 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 2 中的溶解度: 1.39 mg/mL (3.67 mM) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 13.9 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: 1.39 mg/mL (3.67 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 13.9 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 4 中的溶解度: 0.5% CMC Na+1% Tween 80: 30mg/mL

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。