Homoharringtonine (HHT)   中文名称: 高三尖杉酯碱

STAT3 (inhibits phosphorylation at Tyr705) [1]
JAK1 (inhibits phosphorylation at Tyr1022/1023) [1]

高三尖杉酯碱在抑制IL-6诱导的STAT3磷酸化方面表现出剂量和时间上的拮抗作用。高三尖杉酯碱（HHT）通过多种机制诱导细胞凋亡，同时抑制克隆形成、细胞增殖和存活。本研究使用吉非替尼控制的人非小细胞肺癌（NSCLC）细胞系A549（野生型EGFR）和NCI-H1975（H1975的EGFR突变型，L858R和T790M）考察了高三尖杉酯碱的细胞毒性。MTT实验表明，高三尖杉酯碱对A549细胞的IC50值为3.7 μM，毒性较弱。而对H1975细胞的IC50值为0.7 μM，毒性更为显著。 MTT 实验表明，高三尖杉酯碱对 A549 和 H1975 细胞的生长和增殖具有剂量和时间依赖性的抑制作用。台盼蓝间歇试验显示，高三尖杉酯碱显著降低了 A549 和 H1975 细胞的克隆形成能力[1]。

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HHT 抑制了 A549（野生型 EGFR）和 NCI-H1975（EGFR L858R/T790M）非小细胞肺癌 (NSCLC) 细胞的生长、细胞活力和克隆形成。[1]
HHT 的 IC50 值：A549 细胞 = 3.7 μM；NCI-H1975 细胞 = 0.7 μM（MTT 实验）。[1]
HHT 以剂量和时间依赖的方式快速降低 A549 和 H1975 细胞的存活率（台盼蓝排除实验）。 [1]
HHT显著抑制A549和H1975细胞的克隆形成能力（软琼脂克隆形成实验）。[1]
与吉非替尼不同，HHT对A549细胞中EGFR的磷酸化（Y1173）没有影响；HHT和吉非替尼均不下调H1975细胞中EGFR的磷酸化（Western blot）。[1]
HHT诱导细胞核浓缩和碎裂（Hoechst 33258染色）。[1]
HHT处理以剂量依赖的方式导致A549和H1975细胞中细胞色素C释放入胞质增加、全长Caspase 9和Caspase 3减少以及PARP裂解增加（Western blot）。[1]
HHT破坏线粒体跨膜电位（JC-1染色，红色荧光减弱）。 [1]
HHT处理4小时后，细胞内Ca2+水平达到峰值，随后下降至基础水平（FLUO-4流式细胞术）。[1]
HHT对STIM1和Orai1的表达无影响（Western blot）。[1]
预先用广谱caspase抑制剂Z-VAD-FMK（20 μM）处理可显著抑制HHT诱导的细胞凋亡（MTT法）。[1]
在A549和H1975细胞中，MCL1和Survivin的表达均随HHT浓度的增加而降低；BCL2和BAX的表达未受影响（Western blot）。[1]
HHT降低了STAT3在Tyr705位点的磷酸化水平（p-STAT3 Y705），但对Ser727位点的磷酸化水平无影响，并降低了Pim-1和c-Myc的表达（Western blot）。 [1]
HHT 显著降低了 JAK1 的磷酸化水平（Tyr1022/1023），但未改变 PDK1、AKT、ERK、Smad2 或 Smad3 的磷酸化水平（Western blot）。[1]
泛 JAK 抑制剂吡啶酮 6 (P6, 1 μM) 与 HHT (1 μM) 联合处理 12 小时后，进一步抑制了磷酸化 STAT3 和活化 Caspase 3 的表达，并提高了细胞抑制率（Western blot，MTT 法）。[1]
组成型活性突变体 STAT3 (STAT3C) 的过表达表现出对 HHT 处理的耐药性；与对照组相比，抑制率显著降低（MTT 法）。[1]
与 A549 和 MCF-10A 细胞相比，H1975 细胞中 IL-6 的产生量升高（3723 pg/mL）（ELISA）。 [1]
HHT 预处理（4 小时）抑制了 IL-6 (5 ng/mL) 诱导的 STAT3 磷酸化和核转位（Western blot、免疫荧光、核/胞质分离）。[1]
HHT 抑制了 H1975 细胞中 STAT3 的转录活性（荧光素酶报告基因检测）。[1]
HHT 对 IL-6 诱导的 STAT3 磷酸化的抑制作用呈剂量依赖性（A549 细胞中为 0-4 μM；H1975 细胞中为 0-2 μM）和时间依赖性（预处理 0-4 小时）。[1]
HHT 对 IL-6 诱导的 STAT3 磷酸化的抑制作用是可逆的；在不含 HHT 的培养基中培养 6 小时后，STAT3 磷酸化几乎恢复（Western blot）。[1]
STAT3 磷酸化的恢复并非由于新合成的 STAT3 蛋白所致（CHX 处理实验）。 [1]
在A549和H1975细胞中，HHT与多西他赛（DTX）联合用药显示出协同效应（CI < 1）（MTT法，CalcuSyn软件）。[1]
HHT（2 μM或0.25 μM）与DTX（8 nM）联合用药导致Caspase 3活化增强、PARP裂解增加以及STAT3磷酸化降低（Western blot）。[1]

与吉非替尼或载体对照组相比，高三尖杉酯碱（10 mg/kg）成功抑制了肿瘤的生长（P<0.05）。此外，接受高三尖杉酯碱（HHT）治疗的小鼠体重没有减轻，表明高三尖杉酯碱没有明显的副作用。所有小鼠均被安乐死、分离、检查并采集肿瘤样本。将使用肿瘤表达细胞的蛋白质印迹法来确定高三尖杉酯碱是否能降低STAT3的磷酸化水平。与载体对照组或吉非替尼治疗组相比，高三尖杉酯碱治疗组的STAT3磷酸化水平和MCL1水平均显著降低。同时，高三尖杉酯碱治疗抑制了ERK1/2和AKT1/2/3的磷酸化，这与上述结果一致。将肿瘤组织冷冻，并将切片稀释至 10 μM，用于荧光组织化学染色，以便更深入地研究不同处理方式的异种移植瘤样本中 STAT3 的磷酸化情况。高三尖杉酯碱 (HHT) 治疗对 STAT3 磷酸化的抑制作用强于吉非替尼治疗或肿瘤免疫对照组 [1]。

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与载体对照组或吉非替尼 (30 mg/kg) 组相比，HHT (10 mg/kg) 可有效抑制携带 H1975 异种移植瘤的裸鼠的肿瘤生长 (P < 0.05)；每两天计算一次肿瘤体积，持续 3 周，每周 5 次。[1]
HHT 治疗未降低小鼠体重，表明无明显副作用。[1]
与载体对照组或吉非替尼治疗组相比，HHT 治疗组的 STAT3 磷酸化水平和 MCL1 表达水平显著降低（肿瘤裂解物的蛋白质印迹分析）。 [1]
HHT 治疗并未抑制 AKT1/2/3 和 ERK1/2 的磷酸化（肿瘤裂解物的蛋白质印迹分析）。[1]
与载体对照组或吉非替尼治疗组相比，HHT 治疗抑制了 STAT3 的磷酸化（肿瘤切片的荧光免疫组化分析）。[1]

采用 MTT 法测定细胞毒性。将细胞接种于 96 孔板中，预培养 24 小时，然后用 HHT 处理 24 小时或 48 小时。在 570 nm 波长处测定吸光度。细胞死亡率计算公式为：（对照组平均 A570 值 - 实验组平均 A570 值）/（对照组平均 A570 值 - 空白组平均 A570 值）。[1]
采用台盼蓝染色排除法评估细胞活力。将细胞悬液（0.5 mL，1×10^6 个细胞/mL）与 0.1 mL 0.4% 台盼蓝溶液混合，室温孵育 3 分钟，然后用血细胞计数板计数。细胞活力 (%) =（活细胞数/总细胞数）× 100%。 [1]
对于 Hoechst 33258 染色，细胞以 10 mg/mL 的浓度染色 10 分钟，并在荧光显微镜下观察。[1]
软琼脂克隆形成实验：将细胞（1000 个细胞/孔）悬浮于 1 mL 含有 0.3% 低熔点琼脂糖和 10% FBS 的培养基中，并加入指定浓度的 HHT，然后接种于 6 孔板底部含有 0.6% 琼脂糖和 10% FBS 的培养基层上。2 周后，用 0.5 mL 0.005% 结晶紫染色 1 小时以上，并在光学显微镜下计数克隆。[1]
对于细胞内 Ca2+ 测定，用 HHT 处理 H1975 细胞，用细胞分散剂收集细胞，与 FLUO-4 孵育 60 秒，并使用 FL1 通道通过流式细胞仪进行分析。 [1]
IL-6 ELISA：培养 12 小时后收集条件培养基，以 3,000 rpm 离心 15 分钟，并使用人 IL-6 Quantikine ELISA 试剂盒进行分析。收集培养细胞并计数以进行标准化。[1]
细胞色素 C 检测的胞质分级分离：将细胞与胞质裂解缓冲液（0.01% 洋地黄皂苷、2 mM EDTA、1 mM PMSF、蛋白酶抑制剂，溶于 1× PBS）在室温下孵育 3 分钟，以 16,000×g 离心 2 分钟，收集上清液（胞质组分）用于蛋白质印迹分析。 [1]
核质分离：用冰冷的PBS刮取细胞，4℃下以2000 rpm离心4分钟，将细胞重悬于缓冲液A（10 mM HEPES pH 7.9、10 mM KCl、0.1 mM EDTA、1 mM DTT、蛋白酶抑制剂）中，冰上孵育10分钟，然后加入10 μL 10% NP-40。4℃下以6000 rpm离心4分钟收集上清液（胞质组分）。将沉淀重悬于缓冲液B（20 mM HEPES pH 7.9、0.4 M NaCl、1 mM EDTA、1 mM DTT、蛋白酶抑制剂）中，冰上孵育15分钟（核组分）。使用Lamin B和GAPDH进行Western blot分析以评估分离效果。 [1]
JC-1 线粒体跨膜电位凋亡检测：HHT 处理 24 小时后，用 PBS 洗涤细胞，加入 100 μL JC-1 工作液，培养 20 分钟，用孵育缓冲液洗涤，并在荧光显微镜下观察。[1]
免疫荧光染色：用 4% 多聚甲醛固定细胞，用 0.1% Triton X-100 透化，加入抗 pSTAT3 (Y705) 的一抗（1:50），4℃ 孵育过夜，使用 FITC 标记的二抗，DAPI 染色细胞核，并在共聚焦显微镜下观察。 [1]
STAT3 荧光素酶报告基因检测：使用 Lipofectamine 2000 将 pSTAT3-TA-luc 质粒转染至 H1975 细胞。4 小时后更换培养基，用 HHT 处理细胞 4 小时，再用 IL-6 处理 20 小时。使用荧光素酶检测系统检测萤火虫荧光素酶活性。[1]
药物组合检测：使用 Chou-Talalay 方程计算组合指数 (CI)。CI = (D)HHT/(Dx)HHT + (D)DTX/(Dx)DTX。CI < 1 表示协同作用；CI = 1 表示相加作用；CI > 1 表示拮抗作用。使用 CalcuSyn 软件（版本 2.1）进行计算。[1]

所有动物实验均按照清华大学动物伦理委员会批准的方案进行，并符合《实验动物管理条例》（国务院批准）的规定。[1]
6-8周龄的雌雄裸鼠（nu/nu）购自广东省医学动物中心，并在无特定病原体（SPF）环境中饲养和监测。[1]
将悬浮于100 μL RPMI-1640培养基中的NSCLC H1975细胞（2.5×10^6）皮下注射到每只小鼠的右侧腹部。[1]
当肿瘤达到可触及的大小时开始治疗。小鼠随机分为三组（n=10），分别接受HHT（10 mg/kg）、吉非替尼（30 mg/kg）或载体对照治疗，持续3周，每周5次。[1]
肿瘤体积采用游标卡尺测量肿瘤最长垂直直径，并使用以下公式估算：4π/3 × (宽度/2)^2 × (长度/2)。[1]
当肿瘤直径达到2 cm或小鼠出现濒死状态时，处死动物。切除肿瘤，裂解细胞用于蛋白质印迹和免疫组织化学分析。 [1]
肿瘤组织荧光免疫组化：将冰冻切片（10 μm）用4%多聚甲醛固定1小时，依次用10%、20%和30%蔗糖溶液脱水，包埋于Tissue-Tek OCT包埋剂中，-80℃冷冻，切片（4-10 μm），用3% BSA/0.2% Triton X-100 PBS溶液封闭1小时，与抗pSTAT3 (Y705)抗体（1:50）于4℃孵育过夜，使用FITC标记的二抗，DAPI染色细胞核，最后用共聚焦显微镜观察。[1]

吸收、分布和排泄
高三尖杉酯碱的吸收未进行定量分析，但其最大浓度在大约30分钟后达到。高三尖杉酯碱的主要消除途径尚不明确，但肾脏消除率低于15%。高三尖杉酯碱的稳态分布容积（Vd）为141 ± 93.4 L。高三尖杉酯碱的清除率未进行定量分析。代谢/代谢物：高三尖杉酯碱在肝脏中的代谢极少，主要通过血浆酯酶水解为4'-二甲基高三尖杉酯碱（4'-DMHHT）。生物半衰期：皮下注射后，高三尖杉酯碱的半衰期约为6小时。

蛋白结合
血浆蛋白结合率≤50%。毒性数据：小鼠（腹腔注射）：LD50：1960 μg/kg；小鼠（腹腔注射）：LD50：6.5 mg/kg。

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HHT治疗未降低小鼠体重，表明无明显副作用（在携带H1975异种移植瘤的裸鼠中，HHT 10 mg/kg，每周5次，持续3周）。[1]

[1]. Homoharringtonine induces apoptosis and inhibits STAT3 via IL-6/JAK1/STAT3 signal pathway in Gefitinib-resistant lung cancer cells. Sci Rep. 2015 Jul 13;5:8477.

奥马西他汀甲酯琥珀酸酯是一种源自头孢紫杉碱（Cephalotaxus harringtonia）的生物碱酯，用于治疗慢性期或加速期慢性粒细胞白血病。它具有抗肿瘤、抑制蛋白质合成、诱导细胞凋亡和抗冠状病毒活性。它是一种生物碱酯、叔醇、有机杂戊烷化合物和烯醇醚。其作用机制与头孢紫杉碱相似。奥马西他汀甲酯琥珀酸酯（曾被称为HHT或高哈灵顿碱）是一种头孢紫杉碱酯和蛋白质合成抑制剂，其作为单一药物在血液系统恶性肿瘤中的临床活性已得到证实。奥马西他汀甲酯琥珀酸酯由头孢紫杉碱合成，而头孢紫杉碱则提取自红豆杉属植物的叶片。 2005年10月，奥马西他滨甲哌鎓琥珀酸盐获得欧洲药品管理局（EMA）授予的孤儿药资格认定，用于治疗慢性粒细胞白血病（CML）。随后，在2006年3月，它获得美国食品药品监督管理局（FDA）授予的孤儿药资格认定，用于治疗CML。2006年11月，奥马西他滨甲哌鎓琥珀酸盐获得FDA授予的快速通道资格认定，用于治疗CML。最近，在2012年10月，奥马西他滨甲酯琥珀酸盐（商品名：Synribo）获得FDA批准，用于治疗对两种或两种以上酪氨酸激酶抑制剂不耐受和/或耐药的加速期或慢性期CML患者。据报道，奥马西他滨甲酯琥珀酸酯存在于红豆杉（Taxus chinensis，又名 Cephalotaxus fortunei）和哈氏红豆杉（Taxus harringtonia）中，并有相关数据。奥马西他汀甲酯琥珀酸酯是戈哈林顿碱的半合成制剂，戈哈林顿碱是一种从常绿乔木红豆杉中分离得到的细胞毒性植物生物碱，具有潜在的抗肿瘤活性。奥马西他汀与真核细胞中的 80S 核糖体结合，通过干扰链延伸来抑制蛋白质合成。该药物还可以诱导某些癌细胞类型的分化和凋亡。作为哈林顿碱的半合成衍生物，它是一种蛋白质合成抑制剂，可诱导肿瘤细胞凋亡。用于治疗慢性粒细胞白血病。另见：奥马西他汀（含活性部分）。

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药物适应症
适用于对两种或两种以上用于治疗加速期或慢性期慢性粒细胞白血病的酪氨酸激酶抑制剂不耐受和/或耐药的患者。
FDA标签
费城染色体阳性慢性粒细胞白血病，适用于携带T315I Bcr-Abl激酶结构域突变且对既往伊马替尼治疗耐药的患者。作用机制：高三尖杉酯碱不直接与Bcr-Abl结合，而是与核糖体大亚基的A位点裂隙结合，从而抑制蛋白质合成，影响链延伸并阻止蛋白质合成。药效学：高三尖杉酯碱的药效学尚未完全阐明。高三尖杉酯碱已知参与蛋白质合成抑制，这有助于其发挥抗肿瘤活性。

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高三尖杉酯碱（HHT；4-甲基(2R)-2-羟基-2-(4-羟基-4-甲基戊基)丁二酸酯）是从红豆杉（一种广泛分布于中国和日本的植物）中分离得到的头孢紫杉碱酯。红豆杉种子对人类有毒，但用于中药。[1]
临床研究表明，HHT单独使用或与粒细胞集落刺激因子、阿糖胞苷或干扰素-α联合使用，均能有效抑制急性髓系白血病（AML）和慢性髓系白血病（CML）。[1]
既往研究表明，HHT可通过阻止氨酰tRNA与核糖体肽基转移酶A位点裂隙结合来抑制蛋白质合成。 [1]
在包含55种NCI细胞系的高通量筛选实验中，HHT对具有野生型p53的癌细胞更有效。[1]
HHT抗骨髓瘤的可能机制包括抑制AKT磷酸化及其多个靶基因（包括NF-κB、XIAP、cIAP和Cyclin D1），以及抑制MCL1蛋白合成并诱导慢性淋巴细胞白血病细胞凋亡。[1]
本研究表明，HHT可通过IL-6/JAK1/STAT3信号通路诱导细胞凋亡并抑制STAT3，从而在吉非替尼耐药的非小细胞肺癌治疗中具有潜在应用价值。[1]

C29H39NO9

545.6213

545.262

26833-87-4

285033

Off-white to yellow solid powder

1.3±0.1 g/cm3

713.1±60.0 °C at 760 mmHg

144-146ºC

385.1±32.9 °C

0.0±2.4 mmHg at 25°C

1.605

2.7

134.99

2

10

11

39

968

4

CC(C)(CCC[C@@](CC(=O)OC)(C(=O)O[C@H]1[C@H]2C3=CC4=C(C=C3CCN5[C@@]2(CCC5)C=C1OC)OCO4)O)O

HYFHYPWGAURHIV-JFIAXGOJSA-N

InChI=1S/C29H39NO9/c1-27(2,33)8-5-10-29(34,16-23(31)36-4)26(32)39-25-22(35-3)15-28-9-6-11-30(28)12-7-18-13-20-21(38-17-37-20)14-19(18)24(25)28/h13-15,24-25,33-34H,5-12,16-17H2,1-4H3/t24-,25-,28+,29-/m1/s1

(S)-1-((11bS,12S,14aR)-13-methoxy-2,3,5,6,11b,12-hexahydro-1H-[1,3]dioxolo[4',5'

Omacetaxine mepesuccinate Synribo CGX-635 Myelostat CGX635Ceflatonin homoharringtonine, 3H-labeled, (3(R))-isomer

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 本产品在运输和储存过程中需避光。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ≥ 50 mg/mL (~91.64 mM)
H2O : ~1.4 mg/mL (~2.57 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.58 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.58 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.58 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 1.67 mg/mL (3.06 mM) in PBS (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶 (<60°C).

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。