hCCR2 ( IC50 = 5.1 nM ); mCCR2 ( IC50 = 9.5 nM )
In vitro activity: INCB3344 exhibits strong antagonistic effects on both rat and cynomolgus CCR2; the latter two exhibit IC50 values of 2.7 and 6.2 nM in chemotaxis activity antagonistic activity and 7.3 and 16 nM in binding antagonistic activity, respectively. IC50 values of more than 1 μM are demonstrated by INCB3344, a selective antagonist of hCCR2, against a panel of more than 50 ion channels, transporters, chemokine receptors, and other specific GPCRs. It is also a selective mCCR2 antagonist, showing IC50 values of >1 μM and >3 μM against murine CCR1 and murine CCR5, respectively, the two most homologous chemokine receptors to mCCR2[1]. In this assay, the binding IC50 of INCB3344 is found to be 10±5 nM, and at a concentration of 90 nM, inhibition of >90% binding is seen[2].

体外活性：INCB3344 是一种新型、有效、选择性、口服生物可利用的 CCR2 受体小分子拮抗剂，结合拮抗作用的 IC50 值为 5.1 nM (hCCR2) 和 9.5 nM (mCCR2)，而结合拮抗作用的 IC50 值为 3.8 nM (hCCR2) 和 7.8 nM (hCCR2)。 mCCR2) 具有拮抗趋化活性的作用。 INCB3344 是一种选择性 hCCR2 拮抗剂，对超过 50 个离子通道、转运蛋白、趋化因子受体和其他选定的 GPCR 表现出超过 1 μM 的 IC50 值。它也是一种选择性 mCCR2 拮抗剂，对鼠 CCR1 和鼠 CCR5（与 mCCR2 最同源的两种趋化因子受体）的 IC50 值分别 >1 μM 和 >3 μM。首先通过使用鼠单核细胞系、WEHI-274.1 和 125I 标记的 mCCL2 作为示踪剂在全细胞结合测定中测试其抑制 CCL2 与 CCR2 结合的能力来评估 INCB3344 的药理活性特征。该测定中 INCB3344 的结合 IC50 确定为 10±5 nM，并且在 90 nM 浓度下观察到 >90% 结合的抑制。激酶测定：WEHI 274.1（鼠单核细胞系）细胞用于全细胞结合测定。将 RPMI 1640 (VWR)、+0.1% BSA+20 mM HEPES (VWR) 中的细胞 (5×105) 添加到 RPMI 1640 中不同浓度的 INCB3344 中，然后立即添加 150 pM 125I 标记的 mCCL2（小鼠 CCL2） (JE)) 并在室温 (RT) 下孵育 30 分钟。对于非特异性对照，添加 0.3 μM mCCL2 代替 INCB3344。然后通过 1.2 μm 聚偏二氟乙烯过滤器收获细胞，将过滤器风干，并通过在伽马计数器中计数来确定结合。拮抗剂活性报告为特异性结合的 IC50 所需的抑制剂浓度。特异性结合定义为总结合减去非特异性结合，通常占总结合的 97%。细胞测定：将 RPMI 1640 (VWR) 中的 WEHI-274.1 细胞 (5×105) 加入 RPMI 1640 中含有或不含不同浓度 INCB3344 的细胞中，将其装入 96 孔改良 Boyden 中 8 μm 聚碳酸酯过滤器顶部的孔中室。在过滤器下方，将含有或不含 INCB3344 或介质的 30 nM mCCL2 置于相应的 96 孔板中。密封室在 37°C、5% CO2 下孵育 45 分钟。洗涤过滤器，用瑞氏吉姆萨染色，并通过显微镜计数底部室中向 mCCL2 迁移的细胞数量。 INCB3344 拮抗 CCR2 介导的趋化作用的能力被报道为特异性迁移至 mCCL2 的 IC50 值所需的抑制剂浓度。特定迁移定义为总迁移减去背景迁移。通过使用小鼠 MIP-1α 作为配体，使用类似的测定法来确定 INCB3344 对 CCR1 介导的 WEHI-274.1 细胞趋化性的影响。此外，在 INCB3344 存在的情况下，对 C5a、FMLP 和 RANTES 进行了类似的测试，以了解 WEHI-274.1 细胞的迁移情况。在研究INCB3344对CCR5介导的趋化作用的影响时，以小鼠T细胞为细胞系统，以小鼠MIP-1β为配体。

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在用人外周血单核细胞进行的人 MCP-1 结合实验中，INCB3344 的 IC₅₀ 为 5.1 nM；在人 MCP-1 刺激的趋化实验中，IC₅₀ 为 3.8 nM。[1]
在使用表达 CCR2 的小鼠单核细胞系进行的实验中，INCB3344 对小鼠 CCR2 的结合抑制 IC₅₀ 为 9.5 nM，趋化抑制 IC₅₀ 为 7.8 nM。[1]
INCB3344 对超过 50 种离子通道、转运蛋白、趋化因子受体和其他选定的 GPCR 显示出 >1000 倍的选择性。具体而言，它对小鼠 CCR1 的 IC₅₀ >1 μM，对小鼠 CCR5 的 IC₅₀ >3 μM。[1]
在多非利特结合实验（评估 hERG 通道活性）中，INCB3344 的 IC₅₀ 为 13 μM。[1]
在蛋白结合实验中，INCB3344 在人血清中的游离分数为 24%，在小鼠血清中为 15%。[1]

当静脉注射给 CD-1 小鼠时，INCB3344 表现出高清除率和中等分布体积，导致半衰期短至 1 小时。然而，尽管其清除率很高，但仍能实现良好的口服暴露，10 mg/kg 剂量下的 AUC 为 2664 nM·h。口服生物利用度为47%。相比之下，当以相同剂量口服 Balb/c 小鼠时，获得了稍微更好的口服暴露量 (AUC=3888 nM h)。这种 PK 特性，加上其有效的抗 mCCR2 活性和良好的选择性，使得该化合物适合啮齿类动物的模型研究。 INCB3344 可防止醋酸脱氧皮质酮 (DOCA)/盐诱导的 CCR2 血管表达变化。在一系列单独的实验中，与假手术动物相比，在 DOCA/盐治疗期第 7 至 21 天接受 INCB3344 的小鼠主动脉中 CCR2 表达升高（约高 1.5 倍）；然而，该 CCR2 表达水平显着低于媒介物治疗组中观察到的水平（P<0.05，n=6）。同样，DOCA/盐处理的小鼠中其受体配体 CCL2 的表达增加在接受 INCB3344 的小鼠中减弱（P<0.05，n=6）。相比之下，接受载体或 INCB3344 的 DOCA/盐处理小鼠的 CCL7、CCL8 和 CCL12 水平升高至相似程度。

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INCB3344 已被用作靶点验证的工具化合物，在多发性硬化症小鼠模型、炎症性关节炎大鼠模型和肥胖小鼠模型中，能有效降低靶组织中的巨噬细胞含量并抑制疾病发展。[1]

人 MCP-1 结合实验: 将人外周血单核细胞（200,000 至 500,000 个）与低浓度的 ¹²⁵I 标记的 MCP-1 在含有 HEPES 和 BSA 的结合缓冲液中孵育，缓冲液中可加入或不加未标记的竞争性 MCP-1 或不同浓度的待测化合物。反应在室温下进行 30 分钟，通过经聚乙烯亚胺或 PBS 预浸的玻璃纤维滤膜快速过滤来终止。滤膜用含 NaCl 的缓冲液冲洗、干燥，然后用伽马计数器量化结合的放射性。[1]
小鼠 MCP-1 结合实验: 使用表达 CCR2 的小鼠单核细胞系进行了类似的结合实验。[1]

WEHI-274.1，在 96 孔改良博伊登室中，将 RPMI 1640 (VWR) 中的细胞 (5×105) 加载到 8 μm 聚碳酸酯过滤器上方的孔中，RPMI 1640 中含有或不含不同浓度的 INCB3344。包含 30 nM mCCL2（有或没有 INCB3344）或介质的匹配 96 孔板位于过滤器下方。密封室在 37°C、5% CO2 下孵育 45 分钟。对过滤器进行赖特-吉姆萨染色，并使用显微镜来计算底部室中向 mCCL2 迁移的细胞数量。 INCB3344 拮抗 CCR2 介导的趋化作用的能力被报道为特异性迁移至 mCCL2 的 IC50 值所需的抑制剂浓度。总迁移减去背景迁移被称为特定迁移。利用小鼠 MIP-1α 作为配体，采用类似的测定法来评估 INCB3344 对 CCR1 介导的 WEHI-274.1 细胞趋化性的影响。此外，当 INCB3344 存在时，以类似的方式检查 C5a、FMLP 和 RANTES 的 WEHI-274.1 细胞迁移。以小鼠MIP-1β为配体，以小鼠T细胞为细胞系统，研究INCB3344对CCR5介导的趋化作用的影响[2]。

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人 MCP-1 趋化实验: 化合物拮抗 CCR2 功能的能力通过改良的 Boyden 小室中使用人外周血单核细胞来测定。将细胞置于不含血清的培养基中，加入或不加入抑制剂，置于小室上层。MCP-1 加至小室下层。小室在 37°C、5% CO₂ 条件下孵育 30 分钟。孵育后，洗去滤膜上层的细胞，将滤膜风干并染色。在显微镜下计数迁移至滤膜下层的细胞数。通过比较含拮抗剂的孔与仅含 MCP-1 的对照孔的细胞迁移数来确定拮抗剂效力。[1]
小鼠 MCP-1 趋化实验: 使用小鼠单核细胞系进行了类似的趋化实验。[1]

小鼠：在部分实验中，对接受醋酸脱氧皮质酮和盐处理的小鼠，每日腹腔注射CCR2拮抗剂INCB3344（30 mg/kg/天；昊源化学速递有限公司）或溶剂（10% DMSO/0.9%羧甲基纤维素）。注射于诱导高血压后10天开始，持续至21天治疗期结束。在第10至21天，接受溶剂处理的假手术小鼠作为正常血压对照组。
大鼠：所用大鼠为体重200-250 g的成年雄性Sprague-Dawley大鼠。在L5和L6椎体之间鞘内注射1 μg CCL2和/或1 mM INCB3344。在给药后 30、60、90、120 和 240 分钟对动物进行一项测试。在每个时间点，测定最大潜在效应 (MPE) 的百分比。

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小鼠药代动力学研究：在 CD-1 和 Balb/c 小鼠中评估了 INCB3344 的药代动力学。CD-1 小鼠静脉给药剂量为 5 mg/kg。CD-1 和 Balb/c 小鼠口服给药剂量均为 10 mg/kg。所提供的文本中未详细说明具体的给药制剂。[1]

在CD-1小鼠中，静脉注射INCB3344（5 mg/kg）后，其清除率（CL）为5.1 L/h/kg，稳态分布容积（Vdₛₛ）为2.8 L/kg，半衰期（T₁/₂）为1.0小时。[1]
在CD-1小鼠中，口服INCB3344（10 mg/kg）后，其最大浓度（Cₘₐₓ）为1886 nM，曲线下面积（AUC）为2664 nM·h，口服生物利用度（F）为47%。[1]
在Balb/c小鼠中，口服INCB3344（10 mg/kg）后，其Cₘₐₓ为961 nM，AUC为3888 nM·h。[1]

在多非替利竞争性结合试验中，INCB3344 对 hERG 通道的抑制 IC₅₀ 为 13 μM。[1]

[1]. Discovery of INCB3344, a potent, selective and orally bioavailable antagonist of human and murine CCR2. Bioorg Med Chem Lett. 2010 Dec 15;20(24):7473-8.

[2]. Discovery and pharmacological characterization of a novel rodent-active CCR2 antagonist, INCB3344. J Immunol. 2005 Oct 15;175(8):5370-8.

[3]. Reversal of vascular macrophage accumulation and hypertension by a CCR2 antagonist in deoxycorticosterone/salt-treated mice. Hypertension. 2012 Nov;60(5):1207-12.

[4]. Spinal CCL2 pronociceptive action is no longer effective in CCR2 receptor antagonist-treated rats. J Neurochem. 2008 Jul;106(2):757-69.

[5]. Enrichment of Ly6Chi monocytes by multiple GM-CSF injections with HBV vaccine contributes to viral clearance in a HBV mouse model. Hum Vaccin Immunother. 2017 Dec 2;13(12):2872-2882.

[6]. CCR2 upregulation in DRG neurons plays a crucial role in gastric hyperalgesia associated with diabetic gastropathy. Mol Pain. 2018 Jan-Dec;14:1744806917751322.

[7]. Mcp1 Promotes Macrophage-Dependent Cyst Expansion in Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease. J Am Soc Nephrol. 2018 Oct;29(10):2471-2481.

INCB3344 是基于 CCR2 拮抗剂的共同药效团，通过合理设计发现的。[1]
由于其具有强效的抗鼠 CCR2 活性、良好的选择性和口服生物利用度，INCB3344 被认为是一种适用于啮齿动物模型靶点验证的工具化合物。[1]

C29H34N3O6F3

577.59196

577.24

C, 60.30; H, 5.93; F, 9.87; N, 7.28; O, 16.62

1262238-11-8

INCB3344 R-isomer; cis-INCB3344; 1285539-85-6; 709018-37-1 (isomers)

10008367

White to yellow solid powder

3.3

109

3

10

8

41

915

2

CCO[C@H]1CN(C[C@@H]1NC(=O)CNC(=O)C2=CC(=CC=C2)C(F)(F)F)C3CCC(CC3)(C4=CC5=C(C=C4)OCO5)O

MZEOSVPWMSEFPW-XYCDVDSTSA-N

InChI=1S/C29H34F3N3O6/c1-2-39-25-16-35(21-8-10-28(38,11-9-21)19-6-7-23-24(13-19)41-17-40-23)15-22(25)34-26(36)14-33-27(37)18-4-3-5-20(12-18)29(30,31)32/h3-7,12-13,21-22,25,38H,2,8-11,14-17H2,1H3,(H,33,37)(H,34,36)/t21?,22-,25-,28?/m0/s1

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: 6 mg/mL (10.39 mM) in 5% DMSO + 95% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: 6 mg/mL (10.39 mM) in 5% DMSO + 95% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶.

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.75 mg/mL (4.76 mM) (饱和度未知) in 5% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 50% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 4 中的溶解度: 5%DMSO + Corn oil: 5.0mg/ml (8.66mM)

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。